本發(fā)明屬基因
技術(shù)領(lǐng)域：
，本發(fā)明涉及一種用于檢測人源性BAX基因表達(dá)水平的引物組合。
背景技術(shù)：
：BAX基因?qū)儆贐cl-2基因家族，是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要基因，BAX基因是被廣泛研究的凋亡相關(guān)基因，BAX基因編碼的BAX蛋白可拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用。BAX蛋白廣泛分布于人體許多組織和細(xì)胞中，尤其在肝、腎小管、胰島、胃腺體、心肌、淋巴結(jié)生發(fā)中心和神經(jīng)元等組織表達(dá)較高。多種生理病理?xiàng)l件下，如缺氧、氧化還原狀態(tài)的改變都可干擾蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，長時(shí)間過強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。許多細(xì)胞的凋亡過程中伴有BAX表達(dá)水平的升高。BAX促進(jìn)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)理主要是：(1)線粒體滲透性轉(zhuǎn)換、氧化磷酸化和ATP的合成功能受到破壞；(2)細(xì)胞氧化還原作用發(fā)生改變；(3)線粒體中的細(xì)胞凋亡相關(guān)分子凋亡酶激活因子APaf-1釋放出來，與細(xì)胞色素C相互作用，激活Caspase線粒體凋亡通路。BAX過度表達(dá)后可形成同源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活經(jīng)典的線粒體凋亡通路。研究發(fā)現(xiàn)在NO供體硝普鈉（SodiumNitroprusside,SNP）誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡過程中BAX蛋白表達(dá)顯著增高，其可加速軟骨細(xì)胞凋亡的進(jìn)程,而采用RNA干擾技術(shù)使BAX基因沉默后BAXmRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下降，SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的作用明顯被抑制。同樣，對大鼠腦缺血再灌注損傷的研究發(fā)現(xiàn)，BAX在腦缺血再灌注損傷時(shí)表達(dá)增加，與Bcl-2形成同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡。BAX蛋白構(gòu)象的改變或高表達(dá)可誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而低表達(dá)或表達(dá)缺失與腫瘤發(fā)生或進(jìn)展密切相關(guān)。對子宮內(nèi)膜癌的研究發(fā)現(xiàn)，隨著手術(shù)分期及組織學(xué)分級的增加、肌層侵襲的加深及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，BAX基因mRNA過表達(dá)陽性率逐漸增加，提示隨著子宮內(nèi)膜癌惡性程度的增加及分化程度的降低，在細(xì)胞惡性增殖更加活躍的同時(shí)，細(xì)胞自發(fā)凋亡也增加，腫瘤亦具有更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力。因此BAX基因mRNA的表達(dá)水平可作為判斷高危因素和惡性生物學(xué)行為的指標(biāo)之一，可協(xié)助臨床制訂個(gè)性化的綜合治療方案和隨訪。對BAX表達(dá)水平的研究除采用免疫組化和Western免疫印跡等方法從蛋白水平進(jìn)行研究外，也可從mRNA水平研究,包括半定量反轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR方法等。以蛋白為檢測目標(biāo)的方法通常操作比較繁瑣，耗時(shí)。半定量反轉(zhuǎn)錄PCR需要電泳檢測，準(zhǔn)確度不夠高。熒光定量PCR方法是一種高靈敏度、簡便快捷的檢測方法，操作簡單,可應(yīng)用SYBRgreen染料法檢測，無需使用熒光探針，采用熒光定量PCR相對定量方法通過與表達(dá)水平相對穩(wěn)定的管家基因比較來反映目的基因的表達(dá)水平，能很好的輔助BAX表達(dá)水平的研究，整個(gè)PCR反應(yīng)過程只需1.2小時(shí)即可完成。管家基因需選擇維持細(xì)胞最低限度功能所不可少的基因,在所有細(xì)胞中均要表達(dá)的一類基因，且表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小。細(xì)胞在應(yīng)激反應(yīng)時(shí)一些正常表達(dá)的基因會受到抑制，有研究表明比較常用的actin管家基因受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響，表達(dá)量會減少，因此不適宜用做內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)的參考基因。核糖體蛋白基因產(chǎn)物是維持細(xì)胞生命活動所必須的，表達(dá)于所有細(xì)胞中，其表達(dá)只受啟動序列或啟動子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他機(jī)制調(diào)節(jié),可用作內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)的參考基因。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明通過設(shè)計(jì)人源性BAX基因的特異性引物和核糖體蛋白RPL19基因的特異性引物，將其用于BAX基因表達(dá)水平的檢測。本發(fā)明的工作原理是應(yīng)用熒光定量PCRSYBRgreen熒光染料的方法根據(jù)相對定量原理，即2-△△CT法確定基因表達(dá)水平。本發(fā)明包含兩對引物，一對引物是針對人源性BAX基因的特異性引物；另一對引物是針對人的核糖體蛋白RPL19基因設(shè)計(jì)的特異性引物。根據(jù)NCBI公布的humanBAX的mRNA序列（序列號：NM_138761.3）設(shè)計(jì)BAX引物序列見表1：表1.BAX引物設(shè)計(jì)引物名稱序列F-baxCGGGTTGTCGCCCTTTTCTAR-baxGTCCAATGTCCAGCCCATGA根據(jù)NCBI公布的humanRPL19的mRNA序列（序列號：NM_000981.3）設(shè)計(jì)引物序列見表2：表2.RPL19引物設(shè)計(jì)引物名稱序列F-rplCGAGCGAGCTCTTTCCTTTR-rplAGACCTTCTTCTTGCCACAGC本發(fā)明設(shè)計(jì)的兩對引物可分別特異性檢測BAX和RPL19基因的mRNA表達(dá)水平，無非特異性擴(kuò)增，所選擇的管家基因表達(dá)水平不受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響，可對BAX基因的表達(dá)水平進(jìn)行準(zhǔn)確定量。本發(fā)明的檢測系統(tǒng)采用SYBRgreen熒光染料方法，無需使用探針，試劑使用方便，只需加入相關(guān)檢測模板即可，不需要繁瑣的操作步驟，整個(gè)檢測過程只需1.2h即可完成。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例一中的BAX和RPL19基因擴(kuò)增產(chǎn)物融解曲線，其中A為BAX基因擴(kuò)增產(chǎn)物融解曲線，B為RPL19基因擴(kuò)增產(chǎn)物融解曲線。圖2為本發(fā)明實(shí)施例二中Manf蛋白對PD細(xì)胞模型BAX基因表達(dá)水平的影響。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明實(shí)施例中采用諾唯贊的AcetaqSYBRsupermix，采用25微升反應(yīng)體系。熒光定量PCR儀采用ABI7500。利用本發(fā)明的特異性引物組合和方法檢測人源性BAX基因表達(dá)水平時(shí)，基本操作為：步驟1.細(xì)胞RNA提取采用商品化試劑盒提取細(xì)胞RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度，并控制提取質(zhì)量OD260/280～2.0。本發(fā)明實(shí)施例采用天根總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，具體操作按說明書進(jìn)行；步驟2.cDNA反轉(zhuǎn)錄取大約500ngRNA采用商品化試劑盒進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。本實(shí)施例采用Takara的商品化試劑盒PrimeScriptTMRTMasterMix（PerfectRealTime）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作按說明書進(jìn)行；步驟3.熒光定量PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中每種模板分別加入兩種熒光定量PCR反應(yīng)體系中分別進(jìn)行BAX和RPL19基因檢測，一種反應(yīng)體系包含組分如下：1×AcetaqSYBRsupermix上游引物（F-bax）　　　各0.1～0.5μM下游引物（R-bax）各0.1～0.5μM模板（1:5稀釋的cDNA)5μl總體積25μl另一種反應(yīng)體系包含組分如下：1×AcetaqSYBRsupermix上游引物（F-rpl）　　　各0.1～0.5μM下游引物（R-rpl）各0.1～0.5μM模板（1:5稀釋的cDNA)5μl總體積25μl熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃5min，然后再運(yùn)行40個(gè)循環(huán)（具體95℃10s，60℃34s），退火時(shí)檢測熒光信號?？稍谶\(yùn)行結(jié)束后進(jìn)行融解曲線分析,檢測引物擴(kuò)增的特異性；步驟4.檢測結(jié)果分析根據(jù)系統(tǒng)自動基線和設(shè)置的對數(shù)期閾值獲得各個(gè)反應(yīng)的CT值，計(jì)算2-△△CT值，即實(shí)驗(yàn)組BAX基因mRNA表達(dá)水平與對照組比較的倍數(shù)，△△CT=（CTbax（實(shí)驗(yàn)組）-CTrpl19（實(shí)驗(yàn)組））-（CTbax（對照組）-CTrpl19（對組））。實(shí)施例一慢病毒感染細(xì)胞株BAX基因表達(dá)水平的檢測將含有GRP78基因干擾序列的慢病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞：SH-SY5Y細(xì)胞用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)，接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，5000個(gè)細(xì)胞/孔，次日使用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基稀釋RNAi慢病毒濃縮液，每孔加入10μl含RNA干擾序列的慢病毒濃縮液和90μl不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，更換新鮮的含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后采用熒光定量PCR檢測BAX表達(dá)水平。檢測結(jié)果見表3：表3.慢病毒感染細(xì)胞與對照細(xì)胞BAX表達(dá)水平的比較表3結(jié)果表明慢病毒感染細(xì)胞BAX基因表達(dá)水平是對照組細(xì)胞的1.46倍，說明攜帶GRP78干擾序列的慢病毒感染細(xì)胞后可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。BAX和RPL19基因擴(kuò)增產(chǎn)物融解曲線分別為單一融解峰（見圖1），說明引物擴(kuò)增特異性較好，無非特異性擴(kuò)增條帶。實(shí)施例二通過檢測BAX基因表達(dá)水平研究Manf蛋白對細(xì)胞的保護(hù)作用帕金森?。≒arkinsonDisease,PD）是一種椎體外系進(jìn)行性神經(jīng)退化性疾病，研究表明氧化應(yīng)激損傷和α-突觸核蛋白神經(jīng)免疫反應(yīng)是導(dǎo)致帕金森病的主要原因，都能產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。已證實(shí)MANF蛋白對多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用。通過采用6-羥基多巴胺(6-OHDA)制作SH-SY5Y細(xì)胞損傷的帕金森病細(xì)胞模型可檢測Manf蛋白的保護(hù)作用機(jī)制。將實(shí)驗(yàn)分為對照組（DMEM）組、6-OHDA（50μmol/L）組以及Manf+6-OHDA（50μmol/L）（4μg/ml）組。預(yù)先給予Manf蛋白4h后加入6-OHDA分別作用1h、7h和18h后收集細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后采用熒光定量PCR測定BAX基因表達(dá)水平。通過與對照組比較，計(jì)算出各組BAX基因的相對表達(dá)水平（見圖2），結(jié)果表明在Manf蛋白存在情況下，細(xì)胞BAX基因表達(dá)水平在1h和18h沒有升高，甚至略有降低，而6-OHDA組在7小時(shí)和18hBAX基因表達(dá)水平較對照組有所升高，說明Manf蛋白對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，可能通過抑制BAX基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。通過上述的實(shí)施例可以知道，本發(fā)明的特異性引物組合及相應(yīng)的方法，可以特異性檢測人源性BAX基因的表達(dá)水平，避免同源性基因的干擾，并以不受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響的RPL19作為內(nèi)參，提高了人源性BAX基因表達(dá)水平的檢測準(zhǔn)確性，檢測過程簡單、高效。以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>同濟(jì)大學(xué)蘇州研究院<120>一種用于檢測人源性BAX基因表達(dá)水平的引物組合及其應(yīng)用<130>2016<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc_feature<223>PCR擴(kuò)增引物<400>1cgggttgtcgcccttttcta20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc_feature<223>PCR擴(kuò)增引物<400>2gtccaatgtccagcccatga20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc_feature<223>PCR擴(kuò)增引物<400>3cgagcgagctctttccttt19<210>4<211>21<212>DNA<213>人工合成<220><221>misc_feature<223>PCR擴(kuò)增引物<400>4agaccttcttcttgccacagc21當(dāng)前第1頁1 2 3