本發(fā)明涉及一種銀耳異聚多糖及其提取物、制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：銀耳異聚多糖作為一種功能性多糖，可應(yīng)用于藥品、保健品、食品和化妝品中，具有多種功效。專利cn100402555c公開了水溶液高溫條件下提取得到的一種分子量在85～160萬道爾頓的銀耳雜多糖，并公開了其具有保濕潤滑皮膚和粘膜、增強(qiáng)潤滑感、抗氧化衰老、抗過敏、增稠穩(wěn)定等功效。專利cn102161710a中公開了利用酸解法制備低分子量銀耳異聚多糖的方法，并公開了分子量為500～10000道爾頓銀耳異聚多糖在制備治療慢性萎縮性胃炎的藥物和制備腫瘤治療輔助藥物中的應(yīng)用。專利cn1778824a中公開了堿溶液和水溶液提取的均一體銀耳異聚多糖，其分子量在5萬～7萬道爾頓，分別具有抑制淋巴瘤、抗輻射、增強(qiáng)免疫力、抗病毒、抗氧化等功效。由以上現(xiàn)有專利技術(shù)可以看出(1)不同分子量的銀耳異聚多糖的功效是不同的；(2)由于多糖往往以較大的分子狀態(tài)存在于動(dòng)植物體內(nèi)，因此制備低分子量的多糖時(shí)必定需要一定的方法對(duì)糖苷鍵進(jìn)行水解斷裂。目前常見的水解糖苷鍵的方法有酸解、堿解和酶解。酸解是采用一定濃度的鹽酸等酸性物質(zhì)進(jìn)行水解，屬于非專一性水解，可以很方便的將大分子多糖的糖苷鍵進(jìn)行斷裂，但酸解往往也會(huì)造成多糖的過度水解，一方面無法實(shí)現(xiàn)分子量的精準(zhǔn)控制，另一方面也會(huì)造成多糖收率的下降，影響其技術(shù)應(yīng)用價(jià)值。另外，該方法由于酸的存在，對(duì)生產(chǎn)設(shè)備有特定的要求，不利于產(chǎn)品的生產(chǎn)轉(zhuǎn)化。堿解和酸解一樣屬于非專一性水解，但其水解作用溫和，可以通過不同工藝條件的設(shè)置獲得特定分子量的多糖。另外，其對(duì)生產(chǎn)設(shè)備要求不高，工藝應(yīng)用不需要特定的設(shè)備。但是堿解也存在一些問題，堿解工藝容易導(dǎo)致產(chǎn) 品顏色加深，還可以將植物原料組織中的纖維素水解，得到堿纖維素鈉及其裂解產(chǎn)物，這些物質(zhì)作為雜質(zhì)最終會(huì)和目標(biāo)多糖一起被乙醇沉淀，作為雜質(zhì)進(jìn)入最終產(chǎn)品，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的純度和功效。因此，在進(jìn)行堿液提取不同分子量多糖時(shí)，必須要考慮去除因?yàn)槔w維素水解而產(chǎn)生的相關(guān)雜質(zhì)，另外還要解決產(chǎn)品顏色深的問題。另外，采用酶解方法時(shí)酶種類的選擇比較難，因?yàn)椴煌亩嗵瞧涮擒真I鏈接方式差異較大，且同一種多糖中也往往存在多種糖苷鍵，但是酶的專一性又比較強(qiáng)，一種酶只能水解一種糖苷鍵，所以對(duì)于酶的篩選存在較大難度，目前多采用酵母菌等不同微生物發(fā)酵方法以獲得某種特定的酶進(jìn)行多糖的酶解，開發(fā)周期長，費(fèi)用高；銀耳異聚多糖大分子結(jié)構(gòu)主要以α-1,3糖苷鍵的鏈接方式存在，而目前尚無專一性的酶可應(yīng)用于銀耳異聚多糖大分子結(jié)構(gòu)的酶解。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中堿解糖苷鍵獲取銀耳異聚多糖的方法純度較低、顏色深的問題，而提供了一種銀耳異聚多糖及其提取物、制備方法和應(yīng)用。利用本發(fā)明的制備方法可制得不同分子量范圍的高純度的銀耳異聚多糖，收率可以達(dá)到20％以上，純度可以達(dá)到93％以上；采用本申請(qǐng)的制備方法制得的10～20萬道爾頓的銀耳異聚多糖表現(xiàn)出了良好的促成纖維細(xì)胞增殖效果和促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸的能力，同時(shí)還表現(xiàn)出了優(yōu)異的皮膚滲透性。本發(fā)明提供了一種銀耳異聚多糖提取物的制備方法，其包括以下步驟：將酸性絮凝劑與經(jīng)酸調(diào)至弱酸性或中性的銀耳堿提液混合，絮凝，固液分離得沉淀復(fù)合物，即可；其中，所述的酸性絮凝劑為絮凝劑的酸水溶液，所述的絮凝劑為殼聚糖。本發(fā)明所述的酸性絮凝劑一般通過將所述的殼聚糖溶解于酸水中得到。其中，所述的酸水一般為本領(lǐng)域常規(guī)的可以將殼聚糖溶解的酸水，本發(fā)明優(yōu) 選鹽酸水溶液；所述的鹽酸水溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選0.25％～1.0％。所述的殼聚糖可以參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，本發(fā)明優(yōu)選殼聚糖的規(guī)格為：脫乙?；?5％；且20℃下，濃度為10克/升時(shí)的粘度≥200mpa.s。所述的酸性絮凝劑中，所述的絮凝劑的濃度優(yōu)選0.005～0.02g/ml，更優(yōu)選0.01g/ml。本發(fā)明所述的銀耳異聚多糖提取物的制備方法中，所述的“經(jīng)酸調(diào)至弱酸性或中性的銀耳堿提液”中酸的種類可為本領(lǐng)域該類操作中常規(guī)使用的酸的種類，本發(fā)明優(yōu)選稀鹽酸；所述的稀鹽酸的質(zhì)量濃度優(yōu)選0.5％～6.0％，更優(yōu)選1％～6.0％；所述的弱酸性一般指4≤ph＜7，優(yōu)選6≤ph＜7；所述的中性一般指ph＝7。所述的銀耳一般指銀耳子實(shí)體原料；所述的銀耳子實(shí)體原料可為將銀耳子實(shí)體原料利用純水浸泡清洗得到的銀耳子實(shí)體原料。本發(fā)明所述的銀耳異聚多糖提取物的制備方法中，本發(fā)明所述的“經(jīng)酸調(diào)至弱酸性或中性的銀耳堿提液”制備方法可以參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，一般為：將銀耳進(jìn)行堿解得到銀耳堿提液后，用酸調(diào)節(jié)所述的銀耳堿提液至弱酸性或中性，過濾得到的濾液即為所述的“經(jīng)酸調(diào)至弱酸性或中性的銀耳堿提液”。其中，所述的銀耳可以直接進(jìn)行堿解得到“所述的銀耳堿提液”，也可以將所述的銀耳勻漿后再進(jìn)行堿解得到所述的銀耳堿提液。所述的過濾優(yōu)選減壓精過濾。所述的堿解的條件可以根據(jù)不同分子量范圍的銀耳異聚多糖進(jìn)行選擇，不同的堿解條件(包括堿的種類、濃度與用量，堿解的時(shí)間和溫度等)可以得到不同分子量范圍的銀耳異聚多糖，本發(fā)明中的堿解條件優(yōu)選如下：堿優(yōu)選氫氧化鈉；所述的堿可以以堿水溶液的形式參與反應(yīng)，所述的堿水溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選1～15％(例如3％、5％、6％、8％或10％)；所述的堿水溶液與所述的銀耳的體積質(zhì)量比優(yōu)選10～30ml/g(例如15ml/g、20ml/g或25ml/g)；所述的堿解的時(shí)間優(yōu)選2～10h(例如3h、4h、6h或8h)；所述的堿解溫度優(yōu)選90～98℃。本發(fā)明所述的銀耳異聚多糖提取物的制備方法中，所述的酸性絮凝劑的用量一般為可以將所述的“經(jīng)酸調(diào)至弱酸性或中性的銀耳堿提液”中的銀耳異聚多糖絮凝完全，即可；本發(fā)明中，每100ml所述的“經(jīng)酸調(diào)至弱酸性 或中性的銀耳堿提液”優(yōu)選添加5～10ml所述的酸性絮凝劑；更優(yōu)選添加5～8ml所述的酸性絮凝劑。所述的絮凝的溫度優(yōu)選10～35℃；所述的絮凝優(yōu)選在攪拌下進(jìn)行。所述的固液分離可以參照本領(lǐng)域的常規(guī)進(jìn)行選擇，本發(fā)明優(yōu)選過濾。本發(fā)明所述的銀耳異聚多糖提取物的制備方法中，所述的“經(jīng)酸調(diào)至弱酸性或中性的銀耳堿提液”與所述的“酸性絮凝劑”的混合方式?jīng)]有特殊限定，一般為將所述的酸性絮凝劑加入到所述的“經(jīng)酸調(diào)至弱酸性或中性的銀耳堿提液”中。本發(fā)明所述的銀耳異聚多糖提取物的制備方法，在得到所述的沉淀復(fù)合物后還可進(jìn)一步包括以下步驟：將所述的沉淀復(fù)合物在堿性條件下解離，固液分離，得濾液a，即可。所述的濾液a的制備中，所述的解離為將所述的酸性絮凝劑與銀耳異聚多糖分開的過程，本發(fā)明中優(yōu)選包括以下步驟：將所述的沉淀復(fù)合物與水混合后，用堿調(diào)至ph為8.0～10.0(例如9.0)，50～60℃下進(jìn)行解離，即可。其中，所述的水優(yōu)選純水，本領(lǐng)域中的純水一般為去離子水；所述的水的用量可以參照本領(lǐng)域的常規(guī)進(jìn)行選擇，所述水與所述的沉淀復(fù)合物的體積質(zhì)量比優(yōu)選10～20ml/g，更優(yōu)選12～15ml/g。所述的堿可使所述的沉淀復(fù)合物解離即可，本申請(qǐng)優(yōu)選氫氧化鈉；所述的氫氧化鈉可以以氫氧化鈉水溶液的形式進(jìn)行反應(yīng)，所述的氫氧化鈉水溶液優(yōu)選質(zhì)量濃度為4％～10％的氫氧化鈉水溶液，更優(yōu)選質(zhì)量濃度為5％的氫氧化鈉水溶液。本發(fā)明還提供了一種銀耳異聚多糖的制備方法，其包括以下步驟：將上述的濾液a脫色，用酸調(diào)至中性，濃縮，醇沉，收集沉淀，即可。所述的銀耳異聚多糖的制備方法中，所述的脫色可以參照本領(lǐng)域的常規(guī)進(jìn)行選擇，本發(fā)明優(yōu)選采用過氧化氫進(jìn)行脫色；其中，所述的過氧化氫優(yōu)選質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的過氧化氫水溶液。所述的過氧化氫的用量一般為將所述的濾液a脫色即可，例如，所述的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的過氧化氫水溶液的體積優(yōu)選為所述的濾液a體積的0.5％～2.0％，更優(yōu)選1.0％。所述的銀耳異聚多 糖的制備方法中，所述的酸可以參照本領(lǐng)域該類反應(yīng)的常規(guī)進(jìn)行選擇，本發(fā)明優(yōu)選稀鹽酸，所述的稀鹽酸的質(zhì)量濃度優(yōu)選4％～8％，更優(yōu)選6％。所述的銀耳異聚多糖的制備方法中，所述的濃縮條件可以參照本領(lǐng)域的常規(guī)選擇，本發(fā)明優(yōu)選減壓濃縮；所述的濃縮優(yōu)選至濃縮液與銀耳的體積質(zhì)量比為2～3ml/g，所述的銀耳為所述的濾液a的制備過程中使用的銀耳原料。所述的醇沉的步驟可參照本領(lǐng)域的常規(guī)進(jìn)行選擇，一般為將醇與到所述的濃縮液混合，沉淀，即可；其中，所述的醇的種類可以參照本領(lǐng)域的常規(guī)進(jìn)行選擇，本發(fā)明優(yōu)選乙醇；所述的乙醇一般以其水溶液的形式進(jìn)行所述的沉淀，所述的乙醇水溶液的體積百分比濃度優(yōu)選90％～95％；所述的醇沉的終點(diǎn)可以參照本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，本發(fā)明優(yōu)選至最終乙醇的體積百分比濃度達(dá)到60％～70％，即可。本發(fā)明所述的銀耳異聚多糖的制備方法還可包括干燥所述的沉淀的步驟。所述的干燥優(yōu)選真空減壓干燥。本發(fā)明所述的銀耳異聚多糖的制備方法中，當(dāng)制備得到分子量小于10萬道爾頓(例如5.6萬、8.7萬或9.6萬道爾頓)銀耳異聚多糖時(shí)，所述的濾液a的制備過程中制備銀耳子堿提液的堿提條件優(yōu)選為：堿為質(zhì)量濃度為9％～11％的氫氧化鈉水溶液(例如10％的氫氧化鈉水溶液)；所述的堿與所述的銀耳的體積質(zhì)量比為15～25ml/g(例如20ml/g)；堿解的溫度為90～98℃；堿解的時(shí)間為9～11h(例如10h)，制備得到了所述的分子量小于10萬道爾頓銀耳異聚多糖。本發(fā)明所述的銀耳異聚多糖的制備方法中，當(dāng)制備得到分子量大于20萬小于等于100萬道爾頓(例如22.4萬、67.5萬或97.1萬道爾頓)銀耳異聚多糖時(shí)，所述的濾液a的制備過程中制備銀耳子堿提液的堿提條件優(yōu)選為：堿為質(zhì)量濃度為0.5％～4.5％的氫氧化鈉水溶液(例如3％的氫氧化鈉水溶液)；所述的堿與所述的銀耳的體積質(zhì)量比為5～15ml/g(例如10ml/g)；堿解的溫度為90～98℃；堿解的時(shí)間為3～6h(優(yōu)選4h)，制備得到所述的分子量大于20萬小于等于100萬道爾頓銀耳異聚多糖。本發(fā)明所述的銀耳異聚多糖的制備方法中，當(dāng)制備得到分子量10～20萬道爾頓(例如16.7萬、18.5萬和12.8萬道爾頓)銀耳異聚多糖時(shí)，所述的濾液a的制備過程中制備銀耳堿提液的堿提條件優(yōu)選為：堿為質(zhì)量濃度為5％～8％的氫氧化鈉水溶液(例如6％氫氧化鈉水溶液)；所述的堿與所述的銀耳的體積質(zhì)量比為15～25ml/g(例如20ml/g)；所述的堿解的溫度為90～98℃；所述的堿解的時(shí)間為3～6h(例如4h)，制備得到了所述的分子量10～20萬道爾頓銀耳異聚多糖。本發(fā)明還提供了一種由上述的制備方法制備得到的分子量為10～20萬道爾頓的銀耳異聚多糖。所述的分子量為10～20萬道爾頓的銀耳異聚多糖中的中性糖的摩爾比優(yōu)選為，巖藻糖:木糖:甘露糖:葡萄糖＝0.40～0.45(例如0.42):0.34～0.36(例如0.35):1:0.17～0.25(例如0.20)；所述的分子量為10～20萬道爾頓的銀耳異聚多糖中葡萄糖醛酸的質(zhì)量含量優(yōu)選17％～20％(例如18％)。本發(fā)明還提供了一種分子量10～20萬道爾頓的銀耳異聚多糖在制備護(hù)膚品中的應(yīng)用。所述的護(hù)膚品的功效可包括深層補(bǔ)水和/或抗衰老。所述的護(hù)膚品的種類沒有特殊限定，可為化妝品或個(gè)人護(hù)理用品等。另外，本發(fā)明所述的分子量10～20萬道爾頓的銀耳異聚多糖還可用于日化用品、保健食品和藥品等領(lǐng)域。本發(fā)明中的鹽酸的濃度，如無特殊說明，指鹽酸水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；如1％的鹽酸指質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的鹽酸水溶液。本發(fā)明中的氫氧化鈉的濃度，如無特殊說明，指氫氧化鈉水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；如10％的氫氧化鈉指質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的氫氧化鈉水溶液。本發(fā)明所述的室溫一般指10～35℃。在不違背本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：①本發(fā)明中銀耳異聚多糖的制備方法中，針對(duì)堿解過程中存在的一些問題，根據(jù)銀耳異聚多糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，創(chuàng)新性的使用了酸性絮凝劑，通過絮凝劑和銀耳異聚多糖的絡(luò)合沉淀，可使銀耳異聚多糖與其他雜質(zhì)(如纖維素堿解的產(chǎn)物等)進(jìn)行分離，最終可制得高純度的低分子量銀耳異聚多糖，采用本發(fā)明的制備方法制備銀耳異聚多糖的收率可以達(dá)到20％以上，純度可以達(dá)到93％以上。②本申請(qǐng)采用上述銀耳異聚多糖的制備方法實(shí)現(xiàn)了不同分子量范圍的銀耳異聚多糖的制備，例如10～20萬道爾頓的銀耳異聚多糖。③本申請(qǐng)中的10～20萬道爾頓的銀耳異聚多糖表現(xiàn)出了良好的促成纖維細(xì)胞增殖效果和促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸的能力，同時(shí)還表現(xiàn)出了優(yōu)異的皮膚滲透性，可以增加肌膚真皮層儲(chǔ)水能力的效果，具有深層補(bǔ)水和/或抗衰老的功效。具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。具體實(shí)施例中室溫一般為10～35℃。具體實(shí)施例中的酸性絮凝劑溶液是指將殼聚糖溶解于1％(v/v)的鹽酸水溶液中制備得到；例如，1％的酸性絮凝劑溶液是指將1g殼聚糖溶解于100ml1％(v/v)的鹽酸水溶液中制備得到。(其中，殼聚糖規(guī)格：脫乙?；?5％；粘度(10克/升，20℃)≥200mpa.s)具體實(shí)施例中的多糖含量測(cè)定的方法和分子量測(cè)定的方法均為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，其中，多糖含量測(cè)定參考：《糖復(fù)合物生化研究技術(shù)》，張惟杰.浙江大學(xué)出版社，1999年，第11頁的第二章2.1節(jié)糖的定量測(cè)定中苯酚-硫酸法；分子量測(cè)定參考：hplc法測(cè)定真菌多糖平均分子量方法的研究，孔祥輝等，黑龍江省科協(xié)2006學(xué)術(shù)年會(huì)暨太陽島科技論壇，2006。實(shí)施例1取銀耳子實(shí)體原料，純水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)20倍體積的濃度為6％的氫氧化鈉水溶液(ml)，在90℃～98℃條件下堿解提取4h；堿解結(jié)束后，用6％濃度的稀鹽酸調(diào)節(jié)料液ph值至6.0～7.0；進(jìn)行常規(guī)減壓精過濾，收集濾液；每100ml濾液中加入8ml濃度為1％的酸性絮凝劑溶液，常溫條件下攪拌使其充分絮凝，形成一種沉淀復(fù)合物；過濾，收集沉淀復(fù)合物；濾液進(jìn)行無害化處理后、棄去。將上述沉淀復(fù)合物分散在原料重量(g)的20倍體積的純水溶液(ml)中，并用5％的氫氧化鈉溶液調(diào)整料液ph值至堿性9.0～10.0，在50℃～60℃條件下加熱解離。將上述料液過濾，收集濾液；沉淀物進(jìn)行無害化處理后、棄去。向上述濾液中加入濾液總體積的1.0％(v/v)的30％過氧化氫進(jìn)行脫色處理；脫色后料液再次用質(zhì)量濃度為6％的稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值為中性；上述料液減壓濃縮至原料重量(g)的2倍～3倍體積(ml)；濃縮后料液采用90％～95％的高濃度乙醇進(jìn)行沉淀，使最終料液中乙醇的體積百分比濃度達(dá)到60％～70％，收集沉淀，真空減壓干燥，即得到高純度銀耳異聚多糖，收率為：27.2％；銀耳異聚多糖含量為：95％；經(jīng)hplc方法測(cè)定分子量為16.7萬道爾頓。實(shí)施例2：取銀耳子實(shí)體原料，純水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)25倍體積的濃度為5％的氫氧化鈉水溶液(ml)，在90℃～98℃條件下堿解提取3h，堿解結(jié)束后，用質(zhì)量濃度6％的稀鹽酸調(diào)節(jié)料液ph值至6.0～7.0；進(jìn)行常規(guī)精過濾，收集濾液；每100ml濾液中加入5ml濃度為2％的酸性絮凝劑溶液，常溫條件下攪拌使其充分絮凝，形成一種沉淀復(fù)合物；過濾，收集沉淀復(fù)合物；濾液進(jìn)行無害化處理后、棄去。將上述沉淀復(fù)合物分散在原料重量(g)15倍體積的純水溶液中(ml)，并用5％的氫氧化鈉溶液調(diào)整料液ph值至堿性8.0～9.0，在50℃～60℃條件下加熱解離。將上述料液過濾，收集濾液；沉淀物進(jìn)行無害化處理后、棄去。向上述濾液中加入濾液總體積的0.5％(v/v)的30％過氧化氫進(jìn)行脫色處理；脫色后料液再次用質(zhì)量 濃度為6％的稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值為中性；上述料液減壓濃縮至原料重量(g)的2～3倍體積(ml)；濃縮后料液采用90％～95％的高濃度乙醇進(jìn)行沉淀，使最終料液中乙醇的沉淀濃度達(dá)到60％～70％，收集沉淀，真空減壓干燥，即得到高純度銀耳異聚多糖，收率為：29.1％；銀耳異聚多糖含量為：94.7％；經(jīng)hplc方法測(cè)定分子量為18.5萬道爾頓。實(shí)施例3：取銀耳子實(shí)體原料，純水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)的15倍體積的濃度為8％的氫氧化鈉水溶液(ml)，在90℃～98℃條件下堿解提取6h；堿解結(jié)束后，用6％濃度的稀鹽酸調(diào)節(jié)料液ph值至6.0～7.0；進(jìn)行常規(guī)精過濾，收集濾液；每100ml濾液中加入10ml濃度為0.5％的酸性絮凝劑溶液，常溫條件下攪拌使其充分絮凝，形成一種沉淀復(fù)合物；過濾，收集沉淀復(fù)合物；濾液進(jìn)行無害化處理后、棄去。將上述沉淀復(fù)合物分散在原料重量(g)的10倍體積的純水溶液(ml)中，并用5％的氫氧化鈉溶液調(diào)整料液ph值至堿性8.0～9.0，在50℃～60℃條件下加熱解離。將上述料液過濾，收集濾液；沉淀物進(jìn)行無害化處理后、棄去。向上述濾液中加入濾液總體積的2.0％(v/v)的30％過氧化氫進(jìn)行脫色處理；脫色后料液再次用質(zhì)量濃度為6％的稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值為中性；上述料液減壓濃縮至原料重量(g)的2倍～3倍體積(ml)；濃縮后料液采用高濃度乙醇進(jìn)行沉淀，使最終料液中乙醇的沉淀濃度達(dá)到60％～70％，收集沉淀，真空減壓干燥，即得到高純度銀耳異聚多糖，收率為：24.8％；銀耳異聚多糖含量為：93.6％，經(jīng)hplc方法測(cè)定分子量為12.8萬道爾頓。實(shí)施例4取銀耳子實(shí)體原料，純水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)的20倍體積的濃度為10％的氫氧化鈉水溶液(ml)，在90℃～98℃條件下堿解提取10h，堿解結(jié)束后，用質(zhì)量濃度6％的稀鹽酸調(diào)節(jié)料液ph值至6.0～7.0；進(jìn)行常規(guī)精過濾，收集濾液；每100ml濾液中加入10ml濃度為1％的酸性絮凝劑溶液，常溫條件下攪拌使其充分絮凝，形成一種沉淀復(fù)合物；過 濾，收集沉淀復(fù)合物；濾液進(jìn)行無害化處理后、棄去。將上述沉淀復(fù)合物分散在原料重量(g)的20倍體積的純水溶液(ml)中，并用10％的氫氧化鈉溶液調(diào)整料液ph值至堿性9.0～10.0，在50℃～60℃條件下加熱解離。將上述料液過濾，收集濾液；沉淀物進(jìn)行無害化處理后、棄去。向上述濾液中加入料液總體積的2.0％(v/v)的30％過氧化氫進(jìn)行脫色處理；脫色后料液再次用質(zhì)量濃度為6％的稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值為中性；上述料液減壓濃縮至原料重量(g)的2倍～3倍體積(ml)；濃縮后料液采用90％～95％的高濃度乙醇進(jìn)行沉淀，使最終料液中乙醇的體積百分比濃度達(dá)到60％～70％，收集沉淀，真空減壓干燥，即得到高純度銀耳異聚多糖，收率為：26.8％；銀耳異聚多糖含量為：96.4％；經(jīng)hplc方法測(cè)定分子量為8.7萬道爾頓。實(shí)施例5(1)取銀耳子實(shí)體原料，純水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)的20倍體積的濃度為9％的氫氧化鈉水溶液(ml)，在90℃～98℃條件下堿解提取9h，堿解結(jié)束后，用質(zhì)量濃度6％的稀鹽酸調(diào)節(jié)料液ph值至6.0～7.0；進(jìn)行常規(guī)精過濾，收集濾液；每100ml濾液中加入10ml濃度為1％的酸性絮凝劑溶液，常溫條件下攪拌使其充分絮凝，形成一種沉淀復(fù)合物；過濾，收集沉淀復(fù)合物；濾液進(jìn)行無害化處理后、棄去。將上述沉淀復(fù)合物分散在原料重量(g)的20倍體積的純水溶液(ml)中，并用10％的氫氧化鈉溶液調(diào)整料液ph值至堿性9.0～10.0，在50℃～60℃條件下加熱解離。將上述料液過濾，收集濾液；沉淀物進(jìn)行無害化處理后、棄去。向上述濾液中加入料液總體積的2.0％(v/v)的30％過氧化氫進(jìn)行脫色處理；脫色后料液再次用質(zhì)量濃度為6％的稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值為中性；上述料液減壓濃縮至原料重量(g)的2倍～3倍體積(ml)；濃縮后料液采用90％～95％的高濃度乙醇進(jìn)行沉淀，使最終料液中乙醇的體積百分比濃度達(dá)到60％～70％，收集沉淀，真空減壓干燥，即得到高純度銀耳異聚多糖，收率為：24.2％；銀耳異聚多糖含量為：95.8％；經(jīng)hplc方法測(cè)定分子量為9.6萬道爾頓。實(shí)施例6取銀耳子實(shí)體原料，純水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)的20倍體積的濃度為11％的氫氧化鈉水溶液(ml)，在90℃～98℃條件下堿解提取11h，堿解結(jié)束后，用質(zhì)量濃度6％的稀鹽酸調(diào)節(jié)料液ph值至6.0～7.0；進(jìn)行常規(guī)精過濾，收集濾液；每100ml濾液中加入10ml濃度為1％的酸性絮凝劑溶液，常溫條件下攪拌使其充分絮凝，形成一種沉淀復(fù)合物；過濾，收集沉淀復(fù)合物；濾液進(jìn)行無害化處理后、棄去。將上述沉淀復(fù)合物分散在原料重量(g)的20倍體積的純水溶液(ml)中，并用10％的氫氧化鈉溶液調(diào)整料液ph值至堿性9.0～10.0，在50℃～60℃條件下加熱解離。將上述料液過濾，收集濾液；沉淀物進(jìn)行無害化處理后、棄去。向上述濾液中加入料液總體積的2.0％(v/v)的30％過氧化氫進(jìn)行脫色處理；脫色后料液再次用質(zhì)量濃度為6％的稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值為中性；上述料液減壓濃縮至原料重量(g)的2倍～3倍體積(ml)；濃縮后料液采用90％～95％的高濃度乙醇進(jìn)行沉淀，使最終料液中乙醇的體積百分比濃度達(dá)到60％～70％，收集沉淀，真空減壓干燥，即得到高純度銀耳異聚多糖，收率為：28.3％；銀耳異聚多糖含量為：94.6％；經(jīng)hplc方法測(cè)定分子量為5.6萬道爾頓。實(shí)施例7：取銀耳子實(shí)體原料，純水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)的10倍體積的濃度為3％的氫氧化鈉水溶液(ml)，在90℃～98℃條件下堿解提取4h；堿解結(jié)束后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)料液ph值至6.0～7.0；精過濾，收集濾液；每100ml濾液中加入8ml濃度為1％的酸性絮凝劑溶液，常溫條件下攪拌使其充分絮凝，形成一種沉淀復(fù)合物；過濾，收集沉淀復(fù)合物；濾液進(jìn)行無害化處理后、棄去。將上述沉淀復(fù)合物分散在原料重量(g)的12倍體積的純水溶液(ml)中，并用10％的氫氧化鈉溶液調(diào)整料液ph值至堿性9.0～10.0，在50℃～60℃條件下加熱解離。將上述料液過濾，收集濾液；沉淀物進(jìn)行無害化處理后、棄去。向上述濾液中加入料液總體積的0.5％(v/v)的30％過氧化氫進(jìn)行脫色處理；脫色后料液再次用質(zhì)量濃度為6％的稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值為中性；上述料液減壓濃縮至原料重量(g)的2倍～3倍體積(ml)； 濃縮后料液采用90％～95％的高濃度乙醇進(jìn)行沉淀，使最終料液中乙醇的沉淀濃度達(dá)到60％～70％，收集沉淀，真空減壓干燥，即得到高純度銀耳異聚多糖，收率為：20.6％；銀耳異聚多糖含量為：97.1％；經(jīng)hplc方法測(cè)定分子量為67.5萬道爾頓。實(shí)施例8取銀耳子實(shí)體原料，純水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)的10倍體積的濃度為0.5％的氫氧化鈉水溶液(ml)，在90℃～98℃條件下堿解提取3h；堿解結(jié)束后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)料液ph值至6.0～7.0；精過濾，收集濾液；每100ml濾液中加入8ml濃度為1％的酸性絮凝劑溶液，常溫條件下攪拌使其充分絮凝，形成一種沉淀復(fù)合物；過濾，收集沉淀復(fù)合物；濾液進(jìn)行無害化處理后、棄去。將上述沉淀復(fù)合物分散在原料重量(g)的12倍體積的純水溶液(ml)中，并用10％的氫氧化鈉溶液調(diào)整料液ph值至堿性9.0～10.0，在50℃～60℃條件下加熱解離。將上述料液過濾，收集濾液；沉淀物進(jìn)行無害化處理后、棄去。向上述濾液中加入料液總體積的0.5％(v/v)的30％過氧化氫進(jìn)行脫色處理；脫色后料液再次用質(zhì)量濃度為6％的稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值為中性；上述料液減壓濃縮至原料重量(g)的2倍～3倍體積(ml)；濃縮后料液采用90％～95％的高濃度乙醇進(jìn)行沉淀，使最終料液中乙醇的沉淀濃度達(dá)到60％～70％，收集沉淀，真空減壓干燥，即得到高純度銀耳異聚多糖，收率為：22.7％；銀耳異聚多糖含量為：99.2％；經(jīng)hplc方法測(cè)定分子量為97.1萬道爾頓。實(shí)施例9取銀耳子實(shí)體原料，純水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)的10倍體積的濃度為4.5％的氫氧化鈉水溶液(ml)，在90℃～98℃條件下堿解提取6h；堿解結(jié)束后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)料液ph值至6.0～7.0；精過濾，收集濾液；每100ml濾液中加入8ml濃度為1％的酸性絮凝劑溶液，常溫條件下攪拌使其充分絮凝，形成一種沉淀復(fù)合物；過濾，收集沉淀復(fù)合物；濾液進(jìn)行無害化處理后、棄去。將上述沉淀復(fù)合物分散在原料重量(g)的12 倍體積的純水溶液(ml)中，并用10％的氫氧化鈉溶液調(diào)整料液ph值至堿性9.0～10.0，在50℃～60℃條件下加熱解離。將上述料液過濾，收集濾液；沉淀物進(jìn)行無害化處理后、棄去。向上述濾液中加入料液總體積的0.5％(v/v)的30％過氧化氫進(jìn)行脫色處理；脫色后料液再次用質(zhì)量濃度為6％的稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值為中性；上述料液減壓濃縮至原料重量(g)的2倍～3倍體積(ml)；濃縮后料液采用90％～95％的高濃度乙醇進(jìn)行沉淀，使最終料液中乙醇的沉淀濃度達(dá)到60％～70％，收集沉淀，真空減壓干燥，即得到高純度銀耳異聚多糖，收率為：25.6％；銀耳異聚多糖含量為：98.5％；經(jīng)hplc方法測(cè)定分子量為22.4萬道爾頓。對(duì)比實(shí)施例1：采用純水高溫煮提的方法制備得到保留天然銀耳異聚多糖結(jié)構(gòu)的高分子量銀耳異聚多糖，通過hplc方法測(cè)定分子量為480萬道爾頓。具體步驟如下：取銀耳子實(shí)體原料，純水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)的10倍體積的純水(ml)，在90℃～98℃條件下煮提8h，過濾，收集濾液。上述料液減壓濃縮至原料重量(g)的2倍～3倍體積(ml)；濃縮后料液采用90％～95％的高濃度乙醇進(jìn)行沉淀，使最終料液中乙醇的沉淀濃度達(dá)到60％～70％，收集沉淀，真空減壓干燥，即得到高純度銀耳異聚多糖，經(jīng)測(cè)定分子量為480萬道爾頓。對(duì)比實(shí)施例2：不采用酸性絮凝劑，其余條件和步驟按照本發(fā)明的實(shí)施1進(jìn)行，制備得到銀耳異聚多糖。對(duì)比實(shí)施例3：不進(jìn)行本發(fā)明的脫色處理，其余條件和步驟按照本發(fā)明的實(shí)施1進(jìn)行，制備得到銀耳異聚多糖。效果實(shí)施例1銀耳異聚多糖中單糖組成分析測(cè)試結(jié)果測(cè)試樣品：實(shí)施例1～3和對(duì)比實(shí)施例1～2制得的銀耳異聚多糖。測(cè)試方法：(1)取樣品20mg，加2mol/ltfa6ml，在100℃下封管水解6h，蒸干 后加入吡啶、鹽酸羥胺、乙酸酐制成糖腈乙酸酯，進(jìn)gc-ms分析，得到銀耳異聚多糖中中性單糖的摩爾組成比例。(2)采用硫酸咔唑法對(duì)各樣品中的酸性糖(葡萄糖醛酸)的質(zhì)量含量進(jìn)行測(cè)試。對(duì)比實(shí)施例1的銀耳異聚多糖是保留天然銀耳異聚多糖結(jié)構(gòu)的高分子量銀耳異聚多糖，即可以理解為未被酸或堿破壞的原始狀態(tài)的銀耳多糖，其分子量測(cè)定為480萬道爾頓。若經(jīng)過堿解得到的低分子量銀耳異聚多糖中中性糖的比例與對(duì)比實(shí)施例1基本一致，說明該低分子銀耳多糖的單糖組成和原始狀態(tài)基本一致，即在經(jīng)堿解得到的低分子量銀耳異聚多糖中基本沒有引入由于纖維素水解所得的雜質(zhì)葡萄糖。具體測(cè)試結(jié)果：見表1。表1：不同銀耳異聚多糖單糖組成比例分析樣品中性糖的摩爾比葡萄糖醛酸含量，％對(duì)比實(shí)施例1巖藻糖:木糖:甘露糖:葡萄糖＝0.42:0.34:1:0.1819對(duì)比實(shí)施例2巖藻糖:木糖:甘露糖:葡萄糖＝0.25:0.26:1:0.6715實(shí)施例1巖藻糖:木糖:甘露糖:葡萄糖＝0.40:0.35:1:0.2017實(shí)施例2巖藻糖:木糖:甘露糖:葡萄糖＝0.45:0.34:1:0.1720實(shí)施例3巖藻糖:木糖:甘露糖:葡萄糖＝0.42:0.36:1:0.2518由表1看出：實(shí)施例1～3制備所得樣品的中性單糖組成比例基本與樣品對(duì)比實(shí)施例1的樣品一致，而對(duì)比實(shí)施例2中的葡萄糖含量明顯增多，說明本發(fā)明所采用的酸性絮凝方法可有效的去除在堿解提取時(shí)引入的雜質(zhì)葡萄糖(該雜質(zhì)葡萄糖可能由纖維素水解得到)。效果實(shí)施例2：產(chǎn)品顏色對(duì)比。測(cè)試樣品：對(duì)比實(shí)施例3樣品和實(shí)施例1～3樣品。測(cè)試方法：透光率測(cè)定方法：樣品采用純水溶解成0.5％質(zhì)量濃度的水溶液，采用紫外分光光度計(jì)在400nm處測(cè)定其透光率，顏色深的樣品透光率低。結(jié)果表 2。表2樣品的透光率樣品透光率，％對(duì)比實(shí)施例370.6實(shí)施例190.7實(shí)施例288.5實(shí)施例392.1表2，可見采用本發(fā)明實(shí)施例1～3制得的銀耳異聚多糖的透光率遠(yuǎn)高于對(duì)比實(shí)施例3，因此采用本發(fā)明的制備方法能有效解決產(chǎn)品銀耳異聚多糖顏色深的問題。效果實(shí)施例3：銀耳異聚多糖對(duì)成纖維細(xì)胞的活化及促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸含量功效測(cè)試選擇上述實(shí)施例1的樣品進(jìn)行功效測(cè)試。用含小牛血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞，傳代2次，確認(rèn)細(xì)胞生長情況穩(wěn)定，取生長融合率為80％左右的細(xì)胞待用。在無菌操作臺(tái)中將培養(yǎng)皿中生長至80％左右的細(xì)胞回收至離心管中，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加實(shí)施例1的提取物，使其在培養(yǎng)基中的濃度(w/v)為0.1％(即0.1g/100ml)和0.01％，同時(shí)設(shè)立不添加本發(fā)明的提取物的一組為空白對(duì)照組。培養(yǎng)3天后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定每孔細(xì)胞數(shù)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。透明質(zhì)酸含量檢測(cè)：收集各組分72h后的培養(yǎng)液進(jìn)行透明質(zhì)酸(ha)的elisa檢測(cè)(即酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè))，繪制標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲，按說明書加入試劑，避光室溫孵育5min的反應(yīng)終止溶液終止反應(yīng)15min內(nèi)觀察吸光率測(cè)出ha的濃度。檢測(cè)結(jié)果：(1)成纖維細(xì)胞增殖效果：樣品經(jīng)過72h的培養(yǎng)后，含有樣品濃度0.5％、 0.25％、0.125％作用組的細(xì)胞存活率為107.03％、106.31％、105.70％，表現(xiàn)出對(duì)成纖維細(xì)胞具有良好的增殖效果。(2)成纖維細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸效果：樣品經(jīng)過72h的培養(yǎng)后，含有樣品濃度0.5％、0.25％、0.125％作用組的透明質(zhì)酸分泌量為108.57％、106.83％、100.76％，因此，0.5％、0.25％濃度的銀耳異聚多糖可顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸。由以上檢測(cè)結(jié)果可以看出，實(shí)施例1制備得到的銀耳異聚多糖可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，同時(shí)可通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸，從而達(dá)到增加肌膚真皮層儲(chǔ)水能力，達(dá)到深層補(bǔ)水、抗衰老的效果。效果實(shí)施例4：銀耳異聚多糖皮膚滲透性對(duì)比1、測(cè)試儀器及試劑：滲透儀(ryj-6b型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀)人造皮膚(上海軒儀儀器)2、測(cè)試樣品：對(duì)比實(shí)施例1和實(shí)施例1～3樣品3、測(cè)試方法透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀接受池體積為15ml，接受液為ph6.0的pbs緩沖液，將擴(kuò)散池置于恒溫水浴循環(huán)箱中保持37℃，以400r/min不斷攪拌。將接受液加進(jìn)接受池中并與人造皮膚密切接觸，并注意從取樣口排盡氣泡。開動(dòng)滲透擴(kuò)散試驗(yàn)儀30min穩(wěn)定后，將3ml樣品溶液加入樣品池，以400r/min不斷攪拌，連續(xù)滲透8h，滲透結(jié)束，取接收池溶液采用苯酚硫酸法測(cè)定銀耳多糖的含量。以8h的累積透過率作為樣品滲透性的評(píng)價(jià)條件。8h累積透過率計(jì)算：接收池銀耳多糖的量(mg)/樣品池初始銀耳多糖的量(mg)其中,多糖含量測(cè)定參考：《糖復(fù)合物生化研究技術(shù)》，張惟杰.浙江大學(xué)出版社，1999年。4、測(cè)試結(jié)果見表3：表3銀耳異聚多糖皮膚透過率樣品8h累積透過率，％對(duì)比實(shí)施例15.9實(shí)施例136.7實(shí)施例232.4實(shí)施例338.1表3可表明，本申請(qǐng)實(shí)施例1～3中分子量為10～20萬的銀耳異聚多糖表現(xiàn)出了良好的皮膚滲透性，遠(yuǎn)優(yōu)于對(duì)比實(shí)施例1中的高分子量銀耳異聚多糖。良好的皮膚滲透性可使本申請(qǐng)中的10～20萬的銀耳異聚多糖更好地透過皮膚，且通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸，從而增加肌膚真皮層儲(chǔ)水能力，達(dá)到深層補(bǔ)水、抗衰老的效果。當(dāng)前第1頁12