本發(fā)明涉及殼聚糖化學改性領(lǐng)域。更具體地，涉及一種化學雙改性的羧甲基殼聚糖衍生物及其制備方法。

背景技術(shù)：

甲殼素廣泛存在于低等植物菌類，蝦、蟹、昆蟲等甲殼動物的外殼及真菌的細胞壁等，是自然界中儲量僅次于纖維素的天然可再生資源。殼聚糖化學名為(1，4)-2-氨基-2-脫氧-β-d-葡萄糖，是甲殼素脫乙酰后得到的一種堿性多糖。殼聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，以及抗菌性能。但是由于殼聚糖不溶于水，極大地限制了其在許多領(lǐng)域的應(yīng)用。

殼聚糖可以在堿性條件下通過羧甲基化反應(yīng)得到羧甲基殼聚糖(j.adv.drug.deliv.rev.2001,50,591.)。羧甲基的引入賦予了殼聚糖良好的水溶性，拓寬了殼聚糖的適用范圍。然而，化學結(jié)構(gòu)的改變在一定程度影響了羧甲基殼聚糖的抗菌性能和生物相容性。

季銨鹽類抗菌劑是目前研究較多的一類水溶性抗菌劑，但是小分子抗菌劑存在易揮發(fā)、不易加工、生物相容差等缺點。將季銨鹽接枝在殼聚糖主鏈上不但可以大幅改善殼聚糖的水溶性，而且還可以有效提高其抗菌能力(jiaz.etal.carbohyd.res.2001,333,1；lims.h.andhudsons.m.carbohyd.res.2004,339,313)。然而，由于季銨鹽的細胞毒性較強，季銨鹽改性殼聚糖的生物相容性受到極大影響。

精氨酸為堿性帶正電氨基酸，具有優(yōu)異的生物相容性。在主鏈上引入精氨酸能夠有效提高殼聚糖的生物相容性。而且，精氨酸含有胍基基團，質(zhì)子化后帶正電，可以與表面帶負電的細菌作用，從而達到一定的抑菌效果。但由于精氨酸改性殼聚糖抗菌性能有限，目前主要用于基因轉(zhuǎn)染和抗凝材料等方面的研究(casettaril.etal.biomaterials2012,33,7565)。

由此可見，通過單一改性方法制備的殼聚糖衍生物難以同時具備良好的水溶性、抗菌性和生物相容性。因此，通過新的制備方法得到兼具上述多種性能的改性殼聚糖衍生物，將能夠很大程度上推進殼聚糖衍生物在許多領(lǐng)域的進一步應(yīng)用。因此，需要提供一種全新的雙改性羧甲基殼聚糖衍生物及其制備方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的在于提供一種新的雙改性羧甲基殼聚糖衍生物。在羧甲基殼聚糖主鏈上同時修飾季銨鹽和(寡聚)精氨酸，兩種功能基團的分布是無規(guī)的。羧甲基殼聚糖本身具有良好的水溶性，在此基礎(chǔ)上，季銨鹽和(寡聚)氨基酸的引入賦予其良好抗菌性能和生物安全性。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種制備雙改性羧甲基殼聚糖衍生物的方法。該制備方法反應(yīng)條件相對溫和，并且制備過程不使用有機溶劑，不產(chǎn)生有毒物質(zhì)，整個生產(chǎn)工藝節(jié)能環(huán)保，可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

為達到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種雙改性羧甲基殼聚糖衍生物，所述雙改性羧甲基殼聚糖衍生物的分子結(jié)構(gòu)式如式(1)所示

其中，x、y、z和n為自然數(shù)，1≤x≤10000，1≤y≤10000，1≤z≤10000，1≤n≤30。

作為本領(lǐng)域公知常識，羧甲基殼聚糖是殼聚糖的羧甲基化產(chǎn)物。由于羧甲基取代度不同，羧甲基殼聚糖含有不同比例的未羧甲基化單元，如由于殼聚糖原料脫乙酰度不同，羧甲基殼聚糖也會含有不同比例的未脫乙酰單元，如

作為本領(lǐng)域公知常識，通常用通式來表示羧甲基殼聚糖。但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當知曉，羧甲基殼聚糖原料分子鏈中會含有部分未羧甲基化單元，以及含有部分未脫乙酰的單元。

本發(fā)明中,上述分子結(jié)構(gòu)式(1)中，三個重復(fù)單元在高分子鏈中的排列順序并非是完全按照結(jié)構(gòu)式中所標注的順序，而是采取無規(guī)則的排列方式在高分子鏈中排列組合的。也就是說，雙改性羧甲基殼聚糖衍生物分子鏈中的(寡聚)精氨酸取代基以及季銨鹽取代基呈無規(guī)則排列。

本發(fā)明首次成功制備季銨鹽和(寡聚)精氨酸雙改性羧甲基殼聚糖衍生物，在保留了羧甲基殼聚糖良好水溶性的前提下，同時提高了羧甲基殼聚糖的抗菌性能和生物安全性。該產(chǎn)物是一種高性能的綠色抗菌劑。

為達到上述第二個目的，本發(fā)明所述雙功能基團改性殼聚糖的制備方法為：將羧甲基殼聚糖在一定條件下分別與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨和(寡聚)精氨酸反應(yīng)，得到雙改性羧甲基殼聚糖衍生物。其中，羧甲基殼聚糖可選用各種市售產(chǎn)品，分子量在10³～10⁶之間。作為優(yōu)選方案，應(yīng)采用羧甲基化程度在50％以上的羧甲基殼聚糖。更優(yōu)選，脫乙酰度95％以上，分子量在10³～2×10⁵da之間的羧甲基殼聚糖。反應(yīng)所得雙改性羧甲基殼聚糖衍生物，經(jīng)分離純化，得到最終產(chǎn)品。

具體地，所述制備方法包括如下步驟：

(1)將羧甲基殼聚糖溶于水，制得羧甲基殼聚糖溶液；

(2)將2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨加入羧甲基殼聚糖溶液，進行反應(yīng)，得到溶液s1；

(3)將(寡聚)精氨酸在水溶液條件下進行活化，得到(寡聚)精氨酸活化溶液；

(4)將(寡聚)精氨酸活化溶液與溶液s1混合，進行反應(yīng)；

(5)加入終止劑，以終止反應(yīng)；

(6)將反應(yīng)產(chǎn)物分離純化，獲得分子量>5000da的產(chǎn)物，即為雙改性羧甲基殼聚糖衍生物。

優(yōu)選地，步驟(1)中，所述羧甲基殼聚糖重均分子量在10³～10⁶之間，羧甲基取代度在20～100％，脫乙酰度為50～100％；更優(yōu)選地，步驟(1)中，所述羧甲基殼聚糖數(shù)均分子量在10³～3×10⁵之間，羧甲基取代度在50～100％，脫乙酰度為80～100％。最優(yōu)選地，步驟(1)中，所述羧甲基殼聚糖數(shù)均分子量在10³～2×10⁵之間，羧甲基取代度在80～100％，脫乙酰度在95～100％。此優(yōu)選分子量范圍可以保證羧甲基殼聚糖的高分子屬性，分子量太大水溶性下降。

優(yōu)選地，步驟(1)中，所述羧甲基殼聚糖水溶液中羧甲基殼聚糖的濃度為0.1％～50％，按質(zhì)量體積百分比計。更優(yōu)選地，所述羧甲基殼聚糖的濃度為0.1％～30％，按質(zhì)量體積百分比計。此優(yōu)選羧甲基殼聚糖濃度范圍可以保證反應(yīng)的高生產(chǎn)效率和產(chǎn)物的高接枝率。羧甲基殼聚糖濃度過高會增加反應(yīng)體系粘度，使反應(yīng)轉(zhuǎn)化率降低、反應(yīng)均一性差。

優(yōu)選地，步驟(2)中，所述羧甲基殼聚糖與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨質(zhì)量比為1：0.5～10；更優(yōu)選地，步驟(2)中，所述羧甲基殼聚糖與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨質(zhì)量比為1：1～7。此優(yōu)選質(zhì)量比范圍可以保證產(chǎn)物的高接枝率。羧甲基殼聚糖與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨質(zhì)量比低于上述優(yōu)選范圍，產(chǎn)物接枝率下降，進而抗菌性能隨之減弱；質(zhì)量比高于上述優(yōu)選范圍，會造成原料浪費。

優(yōu)選地，步驟(3)中，所述(寡聚)精氨酸數(shù)均分子量<5000da。更優(yōu)選地，所述(寡聚)精氨酸的數(shù)均分子量<3000da。此優(yōu)選分子量范圍可以保證(寡聚)精氨酸具有較好的抗菌性能。分子量太大會影響反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，產(chǎn)物的抗菌性能也會隨之下降。

優(yōu)選地，步驟(3)中，活化的條件為ph值4.5～7.4。更優(yōu)選地，所述活化條件為ph值5.5～7.4。最優(yōu)選地，ph值為6.0～6.5。此優(yōu)選ph值范圍可以保證最佳的催化效率。ph值過低或過高均會影響活化效率，從而影響反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。

進一步地，步驟(3)中，所述活化包括以下步驟：將n-羥基琥珀酰亞胺(以下簡寫為nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(以下簡寫為edc)溶于水，得到催化溶液；將(寡聚)精氨酸加入到所述的催化溶液中，得到(寡聚)精氨酸活化溶液。

優(yōu)選地，步驟(3)中，所述nhs和edc的摩爾比是1：0.1～10。更優(yōu)選地，nhs與edc的摩爾比是1：0.1～1。此優(yōu)選nhs與edc的摩爾比范圍可以保證最佳的活化效率。摩爾比過低會導致低接枝率；摩爾比過高并不能進一步提高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，反而造成原料浪費。

優(yōu)選地，步驟(3)中，所述(寡聚)精氨酸與edc的摩爾比為1：0.5～10。更優(yōu)選地所述(寡聚)精氨酸與edc的摩爾比為1：0.5～5。此優(yōu)選摩爾比范圍可以保證最佳的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。摩爾比過低或過高均會影響活化效率，從而影響反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。

優(yōu)選地，步驟(4)中，所述(寡聚)精氨酸活化溶液中(寡聚)精氨酸與溶液s1中羧甲基殼聚糖的摩爾比為0.02～1：1。更優(yōu)選地，為0.02～0.5：1。此優(yōu)選摩爾比范圍可以保證終產(chǎn)物最佳的抗菌性能。摩爾比過低會使(寡聚)精氨酸接枝量降低，抗菌性能減弱；摩爾比高于優(yōu)化范圍接枝率不會有明顯提高，反而造成原料浪費。

優(yōu)選地，步驟(4)中，反應(yīng)的時間為6～48小時。

本發(fā)明所涉及的化學反應(yīng)式如下：

本發(fā)明中，由于原材料均具有很好的水溶性，全部制備過程在水溶液環(huán)境下進行，無需使用強酸、強堿或有機溶劑，反應(yīng)條件溫和。并且，在接枝了2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨后，無需提純過程，大大簡化了反應(yīng)過程，縮短反應(yīng)時間。所述的制備方法最大限度降低了對環(huán)境的污染和能耗。

現(xiàn)有技術(shù)中，專利cn102093489a公開了一種兩親性n-長鏈烷基-n-精氨酸殼聚糖衍生物及其膠束的制備。但是，其與本發(fā)明的區(qū)別點在于：

專利cn102093489a中，所述的長鏈烷基具有強疏水性，將其接枝在殼聚糖主鏈上，使終產(chǎn)物具有兩親性，以形成膠束；所述的精氨酸具有穿膜性，能夠提高膠束的穿膜效率，進而提高藥物的生物利用度。但是，其也存在相應(yīng)的缺點和不足：由于殼聚糖不溶于水和有機溶劑，反應(yīng)需要在較低ph值條件下進行，反應(yīng)過程復(fù)雜、時間長，需要使用強堿和有機溶劑。

本發(fā)明所述的2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨是水溶性小分子，帶有正電荷，具有優(yōu)異的殺菌性能。所述的(寡聚)精氨酸帶有胍基集團，同樣具有抗菌性能。所述的羧甲基殼聚糖是水溶性大分子。所述的雙改性羧甲基殼聚糖具有良好的水溶性、抗菌性和生物相容性，是一種理想的的抗菌材料，極具市場開發(fā)前景。

本發(fā)明所述的雙改性羧甲基殼聚糖衍生物的制備方法，通過對原料的選擇和對工藝參數(shù)的大量摸索，創(chuàng)造性地采用2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨和(寡聚)精氨酸雙改性的方法。通過控制反應(yīng)物濃度和比例(羧甲基殼聚糖水溶液中羧甲基殼聚糖的濃度為0.1％～50％，羧甲基殼聚糖與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨的質(zhì)量比為1：0.5～10)、反應(yīng)的時間(不超過12小時)，首先對羧甲基殼聚糖進行季銨鹽改性；再選擇精氨酸或者精氨酸寡聚物在活化溶液中，通過控制催化劑用量(nhs和edc的摩爾比是1：0.1～1.0，精氨酸或精氨酸寡聚物與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾比為1：0.5～10)、精氨酸或寡聚精氨酸與羧甲基殼聚糖的摩爾比(0.02～1：1)；反應(yīng)ph值(4.5～7.4)、反應(yīng)時間(6～48小時)，最終經(jīng)過分離純化得到季銨鹽和(寡聚)精氨酸雙改性羧甲基殼聚糖衍生物。制備過程操作簡單、反應(yīng)時間短，可在同一反應(yīng)釜中連續(xù)進行。反應(yīng)條件溫和，無需強酸強堿或有機溶劑，最大限度減小了對環(huán)境的污染。所用主要原料羧甲基殼聚糖來源豐富，所需設(shè)備簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

需要注意的是：在本發(fā)明說明書中出現(xiàn)的所有分子結(jié)構(gòu)式中，各個重復(fù)單元的排列順序并非是完全按照結(jié)構(gòu)式中所標注的順序，而是采取無規(guī)則的排列方式在高分子鏈中排列組合的。

另外注意的是，如果沒有特別說明，本發(fā)明所記載的任何范圍包括端值以及端值之間的任何數(shù)值以及以端值或者端值之間的任意數(shù)值所構(gòu)成的任意子范圍。

本發(fā)明的有益效果如下：

1.雙改性羧甲基殼聚糖衍生物的分子鏈上同時修飾了具有良好抗菌性能季銨鹽分子和生物相容性的(寡聚)精氨酸，在提高抗菌性能的同時又改善了生物安全性；

2.羧甲基殼聚糖具有生物可降解性，低毒，生產(chǎn)過程中較少污染；

3.相較于未改性的羧甲基殼聚糖，雙改性羧甲基殼聚糖具有較好的抗菌性能；

4.相較于季銨鹽改性殼聚糖，本發(fā)明產(chǎn)品產(chǎn)生細胞毒性的最低濃度提高十倍；

5.制備方法反應(yīng)條件溫和，無需高溫高壓處理，且不使用有機溶劑，綠色環(huán)保，可用于大規(guī)模生產(chǎn)。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細的說明。

圖1示出原料羧甲基殼聚糖的¹hnmr譜圖。

圖2示出本發(fā)明實施例1制備的雙改性殼聚糖衍生物¹hnmr譜圖。

圖3示出本發(fā)明實施例1制備的雙改性殼聚糖衍生物采用涂板法對金黃色葡萄球菌進行抗菌性能檢測結(jié)果照片。

圖4示出本發(fā)明實施例1制備的雙改性殼聚糖衍生物對永生化表皮細胞hacat細胞的毒性測試結(jié)果。

圖5示出對比例產(chǎn)品采用涂板法對金黃色葡萄球菌進行抗菌性能檢測的結(jié)果照片。

圖6示出對比例產(chǎn)品對永生化表皮細胞hacat細胞的毒性測試結(jié)果。

具體實施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

一種季銨鹽和精氨酸雙改性羧甲基殼聚糖衍生物，其分子結(jié)構(gòu)式如下所示：

其中，x、y和z為自然數(shù)，1≤x≤10000，1≤y≤10000，1≤z≤10000。

上述季銨鹽和精氨酸羧甲基殼聚糖衍生物的具體制備方法如下：

稱取0.1g羧甲基殼聚糖(數(shù)均分子量為2x10⁵da，羧甲基取代度為100％，脫乙酰度為100％)加入100ml水，得到質(zhì)量體積百分比濃度為0.1％的溶液；將2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨加入羧甲基殼聚糖溶液中，反應(yīng)12小時，得到溶液s1；將精氨酸在30mlph4.5溶液中活化(nhs和edc摩爾比為1：10)；將精氨酸活化溶液倒入到溶液s1，反應(yīng)48小時；將與精氨酸等摩爾比的鹽酸羥胺加入反應(yīng)溶液，以終止反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，獲得分子量>5000da的終產(chǎn)物，即為雙改性羧甲基殼聚糖衍生物。該反應(yīng)中，羧甲基殼聚糖與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨質(zhì)量比為1：0.5，羧甲基殼聚糖、精氨酸與edc摩爾比為1：1：0.5。

圖1示出原料羧甲基殼聚糖的¹hnmr譜圖。圖2示出本發(fā)明實施例1制備的季銨鹽和精氨酸雙改性羧甲基殼聚糖衍生物¹hnmr譜圖。通過對比雙改性羧甲基殼聚糖衍生物和原料羧甲基殼聚糖的¹hnmr譜圖可以發(fā)現(xiàn)，雙改性羧甲基殼聚糖衍生物¹hnmr譜圖分別在4.2～4.7ppm和1.0～1.2ppm出現(xiàn)季銨鹽和精氨酸的特征峰。充分表明雙功能基團通過氨基成功接枝到了羧甲基殼聚糖的分子鏈上。

圖3示出本發(fā)明實施例1制備的雙改性羧甲基殼聚糖衍生物對金黃色葡萄球菌進行抗菌性能測試的結(jié)果照片。從左到右分別是采用濃度為0.01mg/ml和0.5mg/ml。該測試的具體過程為：將本實施例制備的不同濃度的雙改性羧甲基殼聚糖衍生物水溶液分別與菌液混合，37℃的恒溫恒濕搖床上培養(yǎng)12小時后涂平板。平板在37℃的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)48小時，做活菌菌落計數(shù)。該結(jié)果表明：本實施例制備的雙改性羧甲基殼聚糖衍生物對金黃色葡萄球菌具有良好殺滅性能。

對本實施例制備的產(chǎn)品采用涂板法對金黃色葡萄球菌減少率的統(tǒng)計結(jié)果如下表：

表1雙改性殼聚糖對金黃色葡萄球菌抑菌性能測試結(jié)果

圖4示出本發(fā)明實施例1制備的雙改性羧甲基殼聚糖衍生物對人永生化表皮細胞hacat細胞的毒性測試結(jié)果，濃度≤0.01mg/ml時，細胞存活率>80％。

以上各數(shù)據(jù)結(jié)果說明：雙改性羧甲基殼聚糖衍生物不但具有較好的抗菌性能，而且在有效抑菌濃度下細胞正常生長，具有較好的生物安全性。

實施例2

一種季銨鹽和寡聚精氨酸雙改性羧甲基殼聚糖衍生物，其分子結(jié)構(gòu)式如下所示：

其中，x、y和z為自然數(shù)，1≤x≤10000，1≤y≤10000，1≤z≤10000，n＝5。

上述季銨鹽和寡聚精氨酸雙改性羧甲基殼聚糖衍生物的具體制備方法如下：

稱取50g羧甲基殼聚糖(數(shù)均分子量為10³da，羧甲基取代度為80％，脫乙酰度為80％)加入100ml水，得到質(zhì)量體積百分比濃度為50％的溶液；將2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨加入羧甲基殼聚糖溶液中，反應(yīng)2小時，得到溶液s1；將寡聚精氨酸在30mlph6.5溶液中活化(nhs和edc摩爾比為1：1)；將寡聚精氨酸活化溶液倒入到溶液s1，反應(yīng)6小時；將與寡聚精氨酸等摩爾比的鹽酸羥胺加入反應(yīng)溶液，以終止反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，獲得分子量>5000da的終產(chǎn)物，即為雙改性羧甲基殼聚糖衍生物。該反應(yīng)中，羧甲基殼聚糖與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨質(zhì)量比為1：10，羧甲基殼聚糖、寡聚精氨酸與edc摩爾比為1：0.5：2.5。對該實施例制備的雙功能基團改性的殼聚糖衍生物參照實施例1進行抗菌性能與安全性能測試，其結(jié)果與實施例1類似。

實施例3

一種季銨鹽和寡聚精氨酸雙改性羧甲基殼聚糖衍生物，其分子結(jié)構(gòu)式如下所示：

其中，x、y和z為自然數(shù)，1≤x≤10000，1≤y≤10000，1≤z≤10000，n＝10。

上述季銨鹽和寡聚精氨酸雙改性羧甲基殼聚糖衍生物的具體制備方法如下：

稱取30g羧甲基殼聚糖(數(shù)均分子量為10⁴da，羧甲基取代度為50％，脫乙酰度為95％)加入100ml水，得到質(zhì)量體積百分比濃度為30％的溶液；將2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨加入羧甲基殼聚糖溶液中，反應(yīng)10小時，得到溶液s1；將寡聚精氨酸在30mlph6.0溶液中活化(nhs和edc摩爾比為1：0.1)；將寡聚精氨酸活化溶液倒入到溶液s1，反應(yīng)6小時；將與寡聚精氨酸等摩爾比的鹽酸羥胺加入反應(yīng)溶液，以終止反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，獲得分子量>5000da的終產(chǎn)物，即為雙改性羧甲基殼聚糖衍生物。該反應(yīng)中，羧甲基殼聚糖與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨質(zhì)量比為1：7，羧甲基殼聚糖、寡聚精氨酸與edc摩爾比為1：0.02：0.2。對該實施例制備的雙功能基團改性的殼聚糖衍生物參照實施例1進行抗菌性能與安全性能測試，其結(jié)果與實施例1類似。

實施例4

一種季銨鹽和寡聚精氨酸雙改性羧甲基殼聚糖衍生物，其分子結(jié)構(gòu)式如下所示：

其中，x、y和z為自然數(shù)，1≤x≤10000，1≤y≤10000，1≤z≤10000，n＝20。

上述季銨鹽和寡聚精氨酸雙改性羧甲基殼聚糖衍生物的具體制備方法如下：

稱取20g羧甲基殼聚糖(數(shù)均分子量為10³da，羧甲基取代度為20％，脫乙酰度為50％)加入100ml水，得到質(zhì)量體積百分比濃度為20％的溶液；將2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨加入羧甲基殼聚糖溶液中，反應(yīng)4小時，得到溶液s1；將寡聚精氨酸在30mlph7.4溶液中活化(nhs和edc摩爾比為1：1)；將寡聚精氨酸活化溶液倒入到溶液s1，反應(yīng)18小時；將與寡聚精氨酸等摩爾比的鹽酸羥胺加入反應(yīng)溶液，以終止反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，獲得分子量>5000da的終產(chǎn)物，即為雙改性羧甲基殼聚糖衍生物。該反應(yīng)中，羧甲基殼聚糖與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨質(zhì)量比為1：10，羧甲基殼聚糖、寡聚精氨酸與edc摩爾比為1：0.5：5。對該實施例制備的雙功能基團改性的殼聚糖衍生物參照實施例1進行抗菌性能與安全性能測試，其結(jié)果與實施例1類似。

實施例5

一種季銨鹽和寡聚精氨酸雙改性羧甲基殼聚糖衍生物，其分子結(jié)構(gòu)式如下所示：

其中，x、y和z為自然數(shù)，1≤x≤10000，1≤y≤10000，1≤z≤10000，n＝30。

上述季銨鹽和寡聚精氨酸雙改性羧甲基殼聚糖衍生物的具體制備方法如下：

稱取0.1g羧甲基殼聚糖(數(shù)均分子量為10⁶da，羧甲基取代度為100％，脫乙酰度為95％)加入100ml水，得到質(zhì)量體積百分比濃度為0.1％的溶液；將2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨加入羧甲基殼聚糖溶液中，反應(yīng)6小時，得到溶液s1；將寡聚精氨酸在30mlph5.5溶液中活化(nhs和edc摩爾比為1：10)；將寡聚精氨酸活化溶液倒入到溶液s1，反應(yīng)24小時；將與寡聚精氨酸等摩爾比的鹽酸羥胺加入反應(yīng)溶液，以終止反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，獲得分子量>5000da的終產(chǎn)物，即為雙改性羧甲基殼聚糖衍生物。該反應(yīng)中，羧甲基殼聚糖與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨質(zhì)量比為1：10，羧甲基殼聚糖、寡聚精氨酸與edc摩爾比為1：1：1。對該實施例制備的雙功能基團改性的殼聚糖衍生物參照實施例1進行抗菌性能與安全性能測試，其結(jié)果與實施例1類似。

實施例6

一種季銨鹽和寡聚精氨酸雙改性羧甲基殼聚糖衍生物，其分子結(jié)構(gòu)式如下所示：

其中，x、y和z為自然數(shù)，1≤x≤10000，1≤y≤10000，1≤z≤10000，n＝15。

上述季銨鹽和寡聚精氨酸雙改性羧甲基殼聚糖衍生物的具體制備方法如下：

稱取0.1g羧甲基殼聚糖(數(shù)均分子量為3×10⁵da，羧甲基取代度為85％，脫乙酰度為90％)加入100ml水，得到質(zhì)量體積百分比濃度為0.1％的溶液；將2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨加入羧甲基殼聚糖溶液中，反應(yīng)8小時，得到溶液s1；將寡聚精氨酸在30mlph6.0溶液中活化(nhs和edc摩爾比為1：1)；將寡聚精氨酸活化溶液倒入到溶液s1，反應(yīng)12小時；將與寡聚精氨酸等摩爾比的鹽酸羥胺加入反應(yīng)溶液，以終止反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，獲得分子量>5000da的終產(chǎn)物，即為雙改性羧甲基殼聚糖衍生物。該反應(yīng)中，羧甲基殼聚糖與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨質(zhì)量比為1：1，羧甲基殼聚糖、寡聚精氨酸與edc摩爾比為1：0.1：0.05。對該實施例制備的雙功能基團改性的殼聚糖衍生物參照實施例1進行抗菌性能與安全性能測試，其結(jié)果與實施例1類似。

對比例1

一種季銨鹽改性羧甲基殼聚糖衍生物，其分子結(jié)構(gòu)式如下：

其中，x和y為自然數(shù)，1≤x≤10000，1≤y≤10000。

所述季銨鹽改性羧甲基殼聚糖衍生物的制備過程如下：

具體的制備方法為：稱取0.1g羧甲基殼聚糖(數(shù)均分子量為2x10⁵da，羧甲基取代度為100％，脫乙酰度為95％)加入100ml水，得到質(zhì)量體積百分比濃度為0.1％的溶液；將2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨加入羧甲基殼聚糖溶液中，反應(yīng)24小時；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，獲得分子量>5000da的終產(chǎn)物，即為季銨鹽改性羧甲基殼聚糖衍生物。該反應(yīng)中，羧甲基殼聚糖與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨質(zhì)量比為1：0.5。

對比例2

一種精氨酸改性羧甲基殼聚糖衍生物，其分子結(jié)構(gòu)式如下：

其中，x和y為自然數(shù)，1≤x≤10000，1≤y≤10000。所述精氨酸改性羧甲基殼聚糖衍生物的制備過程如下：

具體的制備方法為：

稱取0.1g羧甲基殼聚糖(數(shù)均分子量為2x10⁵da，羧甲基取代度為100％，脫乙酰度為95％)加入100ml水，得到質(zhì)量體積百分比濃度為0.1％的溶液；將精氨酸在30mlph4.5溶液中活化(nhs和edc摩爾比為1：10)；將精氨酸活化溶液倒入到羧甲基殼聚糖溶液，反應(yīng)48小時；將與精氨酸等摩爾比的鹽酸羥胺加入反應(yīng)溶液，以終止反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，獲得分子量>5000da的終產(chǎn)物，即為精氨酸改性羧甲基殼聚糖衍生物。該反應(yīng)中，羧甲基殼聚糖、精氨酸與edc摩爾比為1：1：0.5。

對比例3

一種羧甲基殼聚糖，其分子結(jié)構(gòu)式如下：

其中，x為自然數(shù)，1≤x≤15000。所述羧甲基殼聚糖通過市售購買，為實施例1中的反應(yīng)初始原料。

將對比例1-3中的產(chǎn)品按照實施例1所述方法對金黃色葡萄球菌進行抗菌性能檢測以及對人永生化表皮細胞hacat細胞的毒性測試，其測試結(jié)果分別如圖5和圖6所示：

圖5示出對比例產(chǎn)品采用涂板法對金黃色葡萄球菌進行抗菌性能檢測的結(jié)果照片。圖中從左到右依次為對比例1(0.5mg/ml)、對比例2(5mg/ml)和對比例3(5mg/ml)的測試結(jié)果。

圖6示出對比例產(chǎn)品對人永生化表皮細胞hacat細胞的測試結(jié)果。圖中從左到右依次為對比例1(0.001mg/ml)、對比例2(5mg/ml)和對比例3(5mg/ml)的測試結(jié)果。

將如上的測試結(jié)果與對比例1的測試結(jié)果相比較，列表如下表1所示：

表1

測試結(jié)果的對比說明：本發(fā)明產(chǎn)品雙改性羧甲基殼聚糖在0.01mg/ml濃度時，對金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果(細菌減少率為90％)，并且有較好的生物相容性；濃度為0.5mg/ml時，有較強的殺菌效果(細菌減少率達到99％)。

與本發(fā)明產(chǎn)品相比較，對比例1產(chǎn)品(季銨鹽改性羧甲基殼聚糖)具有相似的抗菌性能。但是對比例1產(chǎn)品生物相容性相對較差，在濃度≤0.001mg/ml時，才能達到細胞相對增值率>80％。本發(fā)明產(chǎn)品將該濃度提高了十倍，使產(chǎn)品在使用濃度范圍內(nèi)細胞毒性最低。

與本發(fā)明產(chǎn)品相比較，對比例2(精氨酸改性羧甲基殼聚糖)和對比例3(羧甲基殼聚糖原料)產(chǎn)品具有較好的生物相容性。但是，不具有殺菌或抑菌性能，在5mg/ml時金黃色葡萄球菌的細菌減少率僅為50～60％。

由此可見，本發(fā)明所述的季銨鹽和(寡聚)精氨酸雙改性羧甲基殼聚糖具有較好抗菌性和安全性，所述的雙改性方法同時解決了季銨鹽單改性神品生物相容性差和(寡聚)精氨酸單改性產(chǎn)品抗菌性能不理想的問題。

顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。