相關(guān)申請(qǐng)案交叉參考本申請(qǐng)案主張優(yōu)先于在2007年6月19日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)案第60/945,035號(hào)和在2007年8月20日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)案第60/956,875號(hào)；優(yōu)先于在2008年2月21日申請(qǐng)的美國(guó)實(shí)用新型專利申請(qǐng)案第12/035,339號(hào)和在2008年5月16日申請(qǐng)的美國(guó)實(shí)用新型專利申請(qǐng)案第12/153,446號(hào)；并且優(yōu)先于在2008年4月25日申請(qǐng)的英國(guó)專利申請(qǐng)案第0807615.0號(hào)，每個(gè)所述專利都是全文以引用方式并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域：
：概括地說(shuō)，本發(fā)明涉及膽汁酸和相關(guān)組合物和方法。在一方面中，本發(fā)明涉及脫氧膽酸和相關(guān)組合物、可用中間體、和其合成方法。在另一方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明組合物的用途和用作醫(yī)藥組合物的方法以及制造其的方法。重要的是，本發(fā)明膽汁酸并非自天然產(chǎn)生這些酸的哺乳動(dòng)物和微生物分離，并且因此不含任何與所述有機(jī)體相關(guān)的毒素和污染物。在另一方面中，本發(fā)明涉及脫氧膽酸和其醫(yī)藥上可接受的鹽和中間體的合成。
背景技術(shù)：
：：人們對(duì)研究膽汁酸和(尤其)膽汁酸化學(xué)的膽酸學(xué)的關(guān)注已延續(xù)了大半個(gè)世紀(jì)。盡管對(duì)膽汁酸化學(xué)已了解很多，但其涉及眾多種化學(xué)實(shí)體，其中許多具有驚人特性。綜述可參見(jiàn)(例如)穆霍帕德亞,S.(Mukhopadhyay,S.)和U.麥特拉(U.Maitra.),當(dāng)代科學(xué)(CurrentScience)87∶1666-1683(2004)(“膽汁酸化學(xué)和生物學(xué)(Chemistryandbiologyofbileacids)”)，其是以引用方式并入本文中。膽汁酸的特征在于兩個(gè)連接單元，即剛性類固醇核和脂肪族短側(cè)鏈(見(jiàn)本申請(qǐng)案的圖1)。參見(jiàn)霍夫曼,A.F.(Hofmann,A.F.)等人。膽汁酸的建議名稱參見(jiàn)脂質(zhì)研究期刊(J.LipidRes.)33∶599-604(1992)。核和側(cè)鏈二者具有大量可能的立體排列方式。可通過(guò)個(gè)別環(huán)的擴(kuò)展或收縮來(lái)改變核，并且可使側(cè)鏈縮短或延長(zhǎng)。此外，膽酸分子的兩部分都具有大量可能的極性取代基。電離基團(tuán)可存于核或側(cè)鏈上。最后，偶合基團(tuán)可存于核上(例如硫酸根、葡萄糖醛酸酯、磷酸根)或存于側(cè)鏈上(甘氨酸或牛磺酸或其它氨基酸，或甚至糖類)。側(cè)鏈結(jié)構(gòu)決定了化合物的種類(膽酸或膽酸鹽)。膽酸是兩親性化合物，其具有兼性和兩親性“面”，參見(jiàn)霍夫曼,A.F.，生理科學(xué)新聞報(bào)(NewsPhysiol.Sci.)14∶24-29(1999)(“膽汁酸：好的，壞的，和丑陋的(BileAcids:Thegood,theBad,andtheUgly)”，第25頁(yè)，圖1)。通常，將疏水表面稱作“β面”并且將親水表面稱作“α面”。一般來(lái)說(shuō)，β面為脂溶性并且α面極性相對(duì)較強(qiáng)。存在多種膽汁酸，例如那些在疏水面和親水面上具有極性基團(tuán)(在天然存在的膽汁酸中為羥基)者，例如熊脫氧膽酸。分子的兩親性使得其形成具有兩親性的水不溶性脂質(zhì)的混合膠粒，例如磷脂酰膽堿。除非膽汁酸超過(guò)臨界濃度(稱作臨界膠粒化濃度)，否則膽汁酸不能溶解呈混合膠粒形式的膳食脂質(zhì)。在人體中所發(fā)現(xiàn)的最主要膽汁酸是鵝脫氧膽酸和脫氧膽酸。脫氧膽酸也稱作脫氧膽酸鹽、膽烷酸、和3α,12α-二羥基-5β-膽烷酸鹽。在人體中，脫氧膽酸用于乳化脂肪以供在腸中吸收。在研究中，使用脫氧膽酸作為分離膜相關(guān)蛋白的溫和洗滌劑。當(dāng)脫氧膽酸基本純凈時(shí)，其呈白色至灰白色晶體粉末形式。脫氧膽酸是肝臟所產(chǎn)生四種主要酸之一。其可溶于醇和乙酸中。脫氧膽酸的CAS號(hào)是[83-44-3]?？焖偃コ臼枪爬系睦硐?，并且人們已宣稱很多物質(zhì)可達(dá)成這種結(jié)果，但很少顯示其真正起作用。由于安全性和效能方面的問(wèn)題，“美塑療法(Mesotherapy)”或使用注射物來(lái)去除脂肪并未被從業(yè)醫(yī)師廣泛接受，但自20世紀(jì)50年代以來(lái)已主張采用順勢(shì)療法和美容療法。歐洲首先提出了美塑療法，其是采用含有多種治療局部醫(yī)學(xué)和美容狀況的化合物的混合物的皮膚注射劑的方法。盡管在傳統(tǒng)上采用美塑療法來(lái)緩解疼痛，但近來(lái)在美國(guó)人們開(kāi)始關(guān)注其美容應(yīng)用，尤其是脂肪和蜂窩組織的去除。一種經(jīng)如此報(bào)導(dǎo)的用于局部減少脂肪的治療(其在巴西很受歡迎并且采用磷脂酰膽堿注射劑)被誤認(rèn)為與美塑療法含義相同。盡管其因被傳言為“脂肪溶解”注射而具有吸引力，但大多數(shù)患者和醫(yī)師仍不明確這些美容治療的安全性和效能。參見(jiàn)羅湯達(dá),A.M.(Rotunda,A.M.)和M.卡羅尼(M.Kolodney)，皮膚外科學(xué)(DermatologicSurgery)，32∶465-480(2006)(“美塑療法和磷脂酰膽堿注射：歷史說(shuō)明和回顧(MesotherapyandPhosphatidylcholineInjections:HistoricalClarificationandReview)”)。WO2006/133160(其包括圖在內(nèi)的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文中)闡述脂肪雕塑方法，例如通過(guò)將神經(jīng)肽Y受體拮抗劑投與脂肪儲(chǔ)存位點(diǎn)來(lái)減小脂肪儲(chǔ)存?？肆_寧M.G.(KoloninM.G.)等人，自然醫(yī)學(xué)(Nat.Med.)6月10(6):625-32(2004)闡述具有有效脂肪細(xì)胞殺滅效應(yīng)的脂肪選擇性促凋亡肽。所述促凋亡肽需要到達(dá)脈管系統(tǒng)以實(shí)施殺滅。近期公開(kāi)的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，當(dāng)將脫氧膽酸注射至體內(nèi)脂肪沉積中時(shí)，脫氧膽酸具有脂肪去除特性。參見(jiàn)WO2005/117900和WO2005/112942，以及美國(guó)專利第US2005/0261258號(hào)、美國(guó)專利第US2005/0267080號(hào)、美國(guó)專利第US2006/127468號(hào)、和美國(guó)專利第US20060154906號(hào)，所有所述專利的包括圖在內(nèi)的全部?jī)?nèi)容都是以引用方式并入本文中。注射至脂肪組織中的脫氧膽酸鹽具有兩種效應(yīng)：1)其通過(guò)溶胞機(jī)制殺滅脂肪細(xì)胞；和2)其使皮膚繃緊。達(dá)成期望美容整形(即體形塑造)同時(shí)需要這兩種效應(yīng)。由于注射至脂肪中的脫氧膽酸鹽因暴露于蛋白質(zhì)中而迅速失活并且隨后迅速返回腸內(nèi)含物中，因此其效應(yīng)在空間上受到限制。由于此衰減效應(yīng)可賦予臨床安全性，脂肪去除治療通常需要4-6個(gè)療程。此無(wú)需手術(shù)的局部脂肪去除不僅有利于病理性局部脂肪沉積(例如在治療HIV時(shí)伴隨醫(yī)療干預(yù)的血脂異常)的治療性治療，也有利于美容性脂肪去除，并且不存在手術(shù)(例如抽脂法)中固有的伴隨風(fēng)險(xiǎn)。參見(jiàn)羅湯達(dá)等人，皮膚外科學(xué)，30∶1001-1008(2004)(“脫氧膽酸鈉的洗滌劑效應(yīng)是用于局部化脂肪溶解的可注射磷脂酰膽堿調(diào)配物的主要特征(Detergenteffectsofsodiumdeoxycholateareamajorfeatureofaninjectablephosphatidylcholineformulationusedforlocalizedfatdissolution)”)和羅湯達(dá)等人，美國(guó)皮膚病學(xué)會(huì)雜志(J.Am.Acad.Dermatol.)2005∶973-978(“用皮下脫氧膽酸鹽注射來(lái)治療脂肪瘤(Lipomastreatedwithsubcutaneousdeoxycholateinjections)”)，兩個(gè)文獻(xiàn)都是以引用方式并入本文中。醫(yī)藥級(jí)膽汁酸制劑可以相對(duì)低的成本在市場(chǎng)上購(gòu)得。此低成本是因?yàn)橐韵率聦?shí)：膽汁酸得自動(dòng)物軀體，尤其是諸如牛和綿羊等大型動(dòng)物。重要的是，如同所有動(dòng)物源藥劑，人們擔(dān)心動(dòng)物源膽汁酸產(chǎn)物可能含有動(dòng)物病原體和其它有害因子，例如動(dòng)物或微生物代謝產(chǎn)物和毒素，包括諸如致熱原等細(xì)菌性毒素。所述動(dòng)物病原體可包括朊病毒，其被視為可引發(fā)朊病毒疾病的傳染性病原蛋白類型。朊病毒疾病是神經(jīng)系統(tǒng)的變性病癥。人們認(rèn)為一種此等疾病，即“瘋?！辈?被認(rèn)為是克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakobdisease)(CJD)的變種)，是由存于來(lái)自病牛的食用牛肉中的朊病毒所引發(fā)。大多數(shù)病例是具有未知傳播模式的散發(fā)型；某些病例是遺傳型；并且少量病例是通過(guò)醫(yī)療程序傳播。人類朊病毒疾病通過(guò)消耗受感染材料而蔓延在歷史上與庫(kù)魯病(kuru)有關(guān)并且近年來(lái)與變種CJD有關(guān)。其它動(dòng)物朊病毒疾病(綿羊瘙癢癥、傳染性水貂腦病、鹿類的慢性消耗性疾病、和牛海綿樣腦病)似乎都是通過(guò)接觸受感染動(dòng)物或通過(guò)消耗受感染食物而橫向傳播。由于傳播模式不同、種間屏障不可預(yù)測(cè)、組織中感染性的分布可變、和在某些疾病中所發(fā)現(xiàn)的種系變異，關(guān)于朊病毒疾病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和對(duì)未來(lái)事件的預(yù)測(cè)難于確定。一般來(lái)說(shuō)，動(dòng)物產(chǎn)物可能會(huì)暴露于產(chǎn)生致熱原(致發(fā)燒物質(zhì))的微生物中。如腸出血性大腸桿菌(E.coli.)對(duì)食物的污染所證實(shí)，食物和/或醫(yī)藥產(chǎn)品的細(xì)菌污染物也是一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題。在所述污染中涉及諸如牛肉等產(chǎn)品以及諸如蘋果、菠菜、和類似物等作物。在所述案例中，是細(xì)菌所產(chǎn)生的毒素(而非細(xì)菌自身)在人體中產(chǎn)生有害效應(yīng)。所述有害效應(yīng)包括嚴(yán)重腹瀉、腎衰竭和在極端情況下的死亡。必須實(shí)質(zhì)上除去所有醫(yī)藥組合物中的細(xì)菌性內(nèi)毒素(一類致熱原)。動(dòng)物產(chǎn)品一般是通過(guò)消除法來(lái)純化，即終產(chǎn)物是除去雜質(zhì)后的剩余材料，而非自混合物選擇終產(chǎn)物。并且除了諸如病原體等可能的動(dòng)物部分外，自動(dòng)物源純化的另一人為因素是終產(chǎn)物是一或多種膽汁酸的混合物。例如，脫氧膽酸的市售制劑含有某些鵝脫氧膽酸以及膽酸，膽酸在哺乳動(dòng)物膽汁酸合成中是脫氧膽酸和鵝脫氧膽酸二者的前體。由于未預(yù)先選定脫氧膽酸/鵝脫氧膽酸/膽酸的確切比例，在意欲大量制造膽汁酸時(shí)此可導(dǎo)致批次間差異。所述批次間差異可能會(huì)造成問(wèn)題并且在獲得監(jiān)管部門批準(zhǔn)或品質(zhì)控制中、尤其在制造醫(yī)藥組合物的努力中可能會(huì)需要額外步驟。顯然，制造者在制造膽汁酸醫(yī)藥組合物時(shí)需要批次間的可預(yù)測(cè)性。目前，關(guān)于含有動(dòng)物病原體和其它有害因子的動(dòng)物源產(chǎn)品的問(wèn)題已通過(guò)自經(jīng)隔離并且經(jīng)檢查的動(dòng)物獲得產(chǎn)物來(lái)解決。例如，來(lái)自新西蘭動(dòng)物的脫氧膽酸是在美國(guó)管理制度下用于人體的膽汁酸來(lái)源，只要?jiǎng)游锢^續(xù)保持隔離或不含有可觀察到的病原體即可。也就是說(shuō)，需要此類政府控制的管理制度以便在注射動(dòng)物源藥物時(shí)識(shí)別動(dòng)物病原體傳播的固有風(fēng)險(xiǎn)。倘若可獲得非動(dòng)物藥物替代品，則不再需要政府管理制度。具有相關(guān)優(yōu)點(diǎn)的所述替代品(替代動(dòng)物源藥物的非動(dòng)物性藥物)實(shí)例是人用胰島素。美國(guó)已于1998年停止制造牛胰島素，并且在2006年1月停止制造人用豬胰島素。盡管可自已知尚未接觸過(guò)會(huì)引發(fā)BSE的致病因子或其它致病因子的牲畜獲得動(dòng)物胰島素，但制造設(shè)施或制程可能會(huì)使動(dòng)物成份暴露于已接觸過(guò)病原體的動(dòng)物中。通過(guò)使用以重組方式或合成方式制造的胰島素可消除致病因子傳播至人類的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于消費(fèi)者來(lái)說(shuō)，胰島素的情形具有指導(dǎo)性：倘若可自由地獲得合成物質(zhì)，則在理論上可消除動(dòng)物病原體傳播的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于制造者來(lái)說(shuō)，若能夠制造基本不含動(dòng)物病原體物質(zhì)的純凈化學(xué)實(shí)體則有利于達(dá)成安全、優(yōu)質(zhì)、和管理目的。此外，與自生物來(lái)源獲得的產(chǎn)品相比，合成制程所提供的產(chǎn)品通常具有更高可重現(xiàn)性。目前，由于動(dòng)物軀體來(lái)源的膽汁酸相當(dāng)豐富，工業(yè)尚未進(jìn)步至完全以化學(xué)方式來(lái)合成膽汁酸，或使用植物甾醇或微生物起始材料來(lái)制備膽汁酸。并且盡管已合成出膽汁酸衍生物，但由于動(dòng)物材料成本低并且易于獲得，因此所述工作的類固醇化學(xué)仍主要使用動(dòng)物源膽汁酸作為起始材料。盡管在歷史上人們?cè)谥参镧薮佳芯恐懈冻龃罅颗?，但仍未開(kāi)發(fā)出便于市售的植物甾醇源膽汁酸的醫(yī)藥級(jí)組合物。參見(jiàn)(例如)穆霍帕德亞,S.和U.麥特拉.，當(dāng)代科學(xué)87∶1666-1683,1670(2004)(應(yīng)注意，根據(jù)1981年參考文獻(xiàn)(龜谷(Kametani)等人，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)103∶2890(1981)(“(+)-鵝脫氧膽酸的第一次總合成(FirstTotalSynthesisof(+)-ChenodeoxycholicAcid)”)，此時(shí)尚未曾實(shí)施任何膽汁酸的總合成))。已使用諸如細(xì)菌等微生物所產(chǎn)生膽汁酸作為細(xì)菌產(chǎn)物在原位用于(例如)海洋溢油清除中。參見(jiàn)馬尼拉(Maneerat)等人，實(shí)用微生物生物技術(shù)(Appl.Microbiol.Biotechnol.)76∶679-683(2004)(“膽汁酸是海洋細(xì)菌香味菌屬(Myroides)菌株SM1的新產(chǎn)物(Bileacidsarenewproductsofamarienebacterium,Myroidessp.StrainSM1)”)。為實(shí)現(xiàn)脫氧膽酸去除脂肪的全部潛力，必須進(jìn)一步解決使用動(dòng)物源產(chǎn)品的相關(guān)問(wèn)題。顯然，業(yè)內(nèi)需要適量的已知原本就不含動(dòng)物源部分(或能作用于動(dòng)物、尤其哺乳動(dòng)物并且在用于人類時(shí)可對(duì)人類產(chǎn)生有害效應(yīng)的病原部分)和其它有害因子(例如動(dòng)物或微生物代謝產(chǎn)物、毒素，包括諸如致熱原等細(xì)菌性毒素)的有效膽汁酸和相關(guān)組合物(例如脫氧膽酸)以供用作人用藥物。本發(fā)明通過(guò)提供以合成方式制備并且不具有動(dòng)物病原體和其它有害因子的潛在風(fēng)險(xiǎn)的膽汁酸組合物來(lái)解決此問(wèn)題。所揭示膽汁酸組合物可用于脂肪分解治療并且可用于局部脂肪去除領(lǐng)域的進(jìn)一步研究和研發(fā)性工作中。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本文提供足量適宜膽汁酸作為所定義醫(yī)藥組合物，并且提供其合成方法。由此提供的膽汁酸組合物和方法并非自天然產(chǎn)生膽酸的哺乳動(dòng)物或微生物分離。在一方面中，提供不含任何動(dòng)物源部分和哺乳動(dòng)物和/或細(xì)菌致熱原的特定脫氧膽酸醫(yī)藥組合物以及相關(guān)制造方法和用途。在另一方面中，提供足量適宜脫氧膽酸作為所定義醫(yī)藥組合物，其可用作局部去除脂肪的可注射醫(yī)藥組合物，并且提供相關(guān)組合物、制造方法和使用方法。本發(fā)明所定義脫氧膽酸鹽注射物可與通過(guò)正交機(jī)制消除脂肪的分子(例如NPY拮抗劑和/或脂肪選擇性促凋亡肽)組合來(lái)提供可用于以較少治療療程和更有效方式達(dá)成體形塑造的藥劑。在另一方面中，本發(fā)明提供與合成脫氧膽酸和其醫(yī)藥上可接受的鹽相關(guān)的方法和中間體。以合成方式制備的脫氧膽酸可用于去除脂肪的脂肪分解治療。附圖說(shuō)明圖1是表現(xiàn)膽汁酸結(jié)構(gòu)的圖，其包括膽酸骨架中碳的編號(hào)系統(tǒng)。圖2展示用本發(fā)明合成脫氧膽酸鈉處理后原代人脂細(xì)胞的細(xì)胞存活率的劑量依賴性降低相對(duì)于牛源脫氧膽酸鈉(西格瑪(Sigma))的相似性。圖3展示膽酸是兩親性化合物，其具有兼性和兩親性“面”。具體實(shí)施方式以引用方式并入本說(shuō)明書中所提及所有出版物和專利申請(qǐng)案都是以引用方式并入本文中，其并入程度如同明確并且單獨(dú)地指明以引用方式并入每一個(gè)別出版物或?qū)＠暾?qǐng)案一般。具體實(shí)施方式定義在整個(gè)本發(fā)明中，各個(gè)出版物、專利和公開(kāi)專利說(shuō)明書都是以等同引用方式來(lái)參照。此處，這些出版物、專利和所公開(kāi)專利說(shuō)明書的揭示內(nèi)容都是以引用方式并入本發(fā)明中以更充分地闡述本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
：的狀態(tài)。本文所用某些術(shù)語(yǔ)具有以下所定義含義。除非上下文明確表示其它含義，否則說(shuō)明書和權(quán)利要求書中所用單數(shù)形式“一(a、an)”和“所述”包括單數(shù)和復(fù)數(shù)含義。除非另外說(shuō)明，否則說(shuō)明書和權(quán)利要求書中所用表示成份數(shù)量、反應(yīng)條件等的所有數(shù)值在所有情況下均應(yīng)理解為受術(shù)語(yǔ)“約”修飾。因此，除非表明相反含義，否則以下說(shuō)明書和隨附權(quán)利要求書中所述數(shù)值參數(shù)都是近似值。至少應(yīng)根據(jù)所報(bào)告有效數(shù)字位數(shù)并且通過(guò)采用一般舍入技術(shù)來(lái)解釋每一數(shù)值參數(shù)。術(shù)語(yǔ)“乙?；噭笔侵缚蓪⒁阴；鵆H3C(O)-添加至分子的試劑。術(shù)語(yǔ)“酸”是指質(zhì)子供體并且包括有機(jī)酸和無(wú)機(jī)酸二者。術(shù)語(yǔ)“烷基”是指具有1至10個(gè)碳原子并且優(yōu)選地具有1至6個(gè)碳原子的單價(jià)飽和脂肪族烴基。此術(shù)語(yǔ)包括(例如)直鏈和具支鏈烴基，例如甲基(CH3-)、乙基(CH3CH2-)、正丙基(CH3CH2CH2-)、異丙基((CH3)2CH-)、正丁基(CH3CH2CH2CH2-)、異丁基((CH3)2CHCH2-)、仲丁基((CH3)(CH3CH2)CH-)、叔丁基((CH3)3C-)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2-)、和新戊基((CH3)3CCH2-)。術(shù)語(yǔ)“芳基”是指具有6至12個(gè)碳原子的單價(jià)芳香族碳環(huán)基團(tuán)，其具有單環(huán)(例如苯基)或多個(gè)稠環(huán)(例如萘基)。術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物源”是指源自包括多細(xì)胞生物和單細(xì)胞生物的生物界(動(dòng)物界)中任一種生物。術(shù)語(yǔ)“脫水劑”是指可與水反應(yīng)的試劑。在一方面中，脫水劑可與自分子移除的水反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)“脫硫劑”是指可與硫化物反應(yīng)的試劑。在一方面中，脫硫劑可與含硫化物分子反應(yīng)以自分子移除硫化物基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“乙二硫醇或二噻烷前體”是指通過(guò)與羰基反應(yīng)可形成乙二硫醇或二噻烷的試劑。術(shù)語(yǔ)“親電乙?；笔侵缸鳛橛H電體的乙酰基，親電體是受電子吸引并且易于接受電子的基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“氫化劑”是指可向分子提供氫的試劑。術(shù)語(yǔ)“路易斯酸(Lewisacid)”是指電子對(duì)受體。路易斯酸包括有機(jī)金屬試劑，例如烷基鹵化鋁(例如Et2AlCl和MeAlCl2)。術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物源”是指源自任何哺乳動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”是指以乳腺分泌的乳汁養(yǎng)育幼仔的溫血高等脊椎動(dòng)物(例如胎生動(dòng)物、有袋類動(dòng)物、或單孔類動(dòng)物)綱(哺乳綱)，其皮膚通?；蚨嗷蛏俳?jīng)毛發(fā)覆蓋，并且包括人類。術(shù)語(yǔ)“微生物源”是指源自任何微生物。術(shù)語(yǔ)“微生物”是指圓形、螺旋形、或桿形單細(xì)胞原核微生物領(lǐng)域(細(xì)菌領(lǐng)域)，其可能缺少細(xì)胞壁或若其具有細(xì)胞壁則為革蘭氏(gram)陽(yáng)性或革蘭氏陰性，其經(jīng)常聚集成菌落或可藉助鞭毛來(lái)移動(dòng)，其通常生存于土壤、水、有機(jī)物質(zhì)、或植物和動(dòng)物體內(nèi)，其營(yíng)養(yǎng)方式通常是自養(yǎng)、腐生或寄生，并且其特征在于其生化效應(yīng)和致病性。術(shù)語(yǔ)“烯化劑”是指與酮反應(yīng)以形成對(duì)應(yīng)烯烴的試劑。術(shù)語(yǔ)“烯烴形成條件”是指實(shí)施所述轉(zhuǎn)化的適宜條件。所述試劑的實(shí)例包括魏悌希(Wittig)試劑和魏悌希烯化條件。術(shù)語(yǔ)“氧化劑”是指可在氧化還原反應(yīng)中接受電子的試劑。以此方式，可將鹵素或氧添加至分子中或可自分子移除氫。術(shù)語(yǔ)“病原體”是指疾病的具體致病因子?！搬t(yī)藥上可接受的鹽”是指自業(yè)內(nèi)熟知的各種有機(jī)和無(wú)機(jī)異荷離子衍生的醫(yī)藥上可接受的鹽，并且包括(僅例如)鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、鈣鹽、鎂鹽、銨鹽、和四烷基銨鹽。適宜鹽包括那些闡述于以下文獻(xiàn)中者：P.海因里希斯塔爾(P.HeinrichStahl)、卡米爾G.韋穆特(CamilleG.Wermuth)(編輯)，藥物鹽特性、選擇和應(yīng)用手冊(cè)(HandbookofPharmaceuticalSaltsProperties,Selection,andUse)；2002。這些醫(yī)藥上可接受的鹽可通過(guò)使DCA與適宜堿反應(yīng)來(lái)制備。出于例示性目的，所述堿的實(shí)例包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、或氫氧化鋰。或者，所述鹽可通過(guò)用堿水解DCA的酯和省略任何可產(chǎn)生DCA的酸處理來(lái)制備。術(shù)語(yǔ)“還原劑”是指在氧化還原反應(yīng)中可提供電子的試劑。以此方式，可自分子移除鹵素或氧，或可將氫添加至分子中。組合物和使用方法在本文所述各方面中，本發(fā)明提供用于醫(yī)藥用途的組合物(和可用中間體)、其合成方法、和本發(fā)明醫(yī)藥組合物的使用方法。重要的是，本發(fā)明膽汁酸組合物不具有自動(dòng)物起始材料獲得的材料中的固有風(fēng)險(xiǎn)，并且因此不需要針對(duì)動(dòng)物源材料的詳細(xì)檢查和管控。因此在一方面中，本發(fā)明涉及不含諸如哺乳動(dòng)物病原體等動(dòng)物源材料，并且實(shí)質(zhì)上不含諸如致熱原等細(xì)菌源毒素的膽汁酸醫(yī)藥組合物。脫氧膽酸鈉是天然產(chǎn)生的膽酸鹽，其可在消化道內(nèi)溶解膳食脂質(zhì)。其是通過(guò)復(fù)雜的生物合成途徑采用膽固醇作為起始材料在體內(nèi)產(chǎn)生，并且所述途徑同時(shí)涉及人類和細(xì)菌酶二者。脫氧膽酸鹽的主要功能是通過(guò)溶解膳食脂質(zhì)以促進(jìn)吸收來(lái)輔助消化過(guò)程。在體內(nèi)，脫氧膽酸鹽的生物合成始于肝臟中膽固醇的酶促氧化、異構(gòu)化、和還原，從而形成膽酸，其是在結(jié)構(gòu)上與其膽固醇母體類似的膽汁酸(史屈爾L(StryerL)，第27章：膜脂和類固醇的生物合成(BiosynthesisofMembraneLipidsandSteroids)，生物化學(xué)(Biochemistry)，1995，W.H.弗里曼公司(W.H.FreemanandCompany)：紐約，第691-707頁(yè))。然后在肝臟中，膽酸以化學(xué)方式連接兩種氨基酸(?；撬峄蚋拾彼?之一而形成‘偶合’膽酸(即L-甘膽酸鹽和?；悄懰猁})。然后這些偶合膽酸儲(chǔ)存于膽囊中直至食用食物。食用食物后，膽汁溶液自膽囊中釋放至腸中，其中偶合膽酸分子發(fā)生兩次由腸道菌群所產(chǎn)生酶介導(dǎo)的額外化學(xué)修飾(李德龍J.M.(RidlonJ.M.)、康D.J.(KangD.J.)和希爾夢(mèng)P.B.(HylemonP.B.)，人類腸細(xì)菌的膽汁酸鹽生物轉(zhuǎn)化(Bilesaltbiotransformationsbyhumanintestinalbacteria),脂質(zhì)研究期刊,47(2)：第241-59頁(yè)(2006))。首先，使偶合膽酸去羥基以形成偶合脫氧膽酸鹽。然后使偶合脫氧膽酸鹽去偶合以形成游離脫氧膽酸鹽，其與其它膽汁酸一起參與膳食脂質(zhì)的溶解。由于脫氧膽酸鹽位于膽酸合成的下游，因此膽酸可能是存于脫氧膽酸鹽天然來(lái)源中的雜質(zhì)。脫氧膽酸鹽在水中以333mg/mL溶解，在醇中少量溶解，并且在丙酮和冰乙酸中溶解度甚至更低?？梢约s2.4mg/mL的臨界膠粒濃度以上的脫氧膽酸鈉濃度和中性pH來(lái)達(dá)成膠粒的可逆形成(松岡K,M.Y.(MatsuokaK,M.Y.)，脫氧膽酸鈉和烏索脫氧膽酸鈉的膠粒形成(Micelleformationofsodiumdeoxycholateandsodiumursodeoxycholate)(部分1)，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(Biochim.Biophys.Acta.)，1580(2-3)：第189-99頁(yè)(2002))。在2.4mg/mL的臨界膠粒濃度以上的濃度下，脫氧膽酸鹽可形成膠粒并且能溶解細(xì)胞、脂質(zhì)、和蛋白質(zhì)。在諸如0.4mg/mL等較低濃度下(與禁食狀態(tài)相當(dāng))和在26mg/mL白蛋白(其接近35-50mg/mL的血清生理濃度)存在下，98％脫氧膽酸鹽與白蛋白結(jié)合(洛達(dá)A.(RodaA.)等人，膽汁酸與人血清白蛋白交互作用的容量現(xiàn)象(Quantitativeaspectsoftheinteractionofbileacidswithhumanserumalbumin)，脂質(zhì)研究期刊,23(3)：第490-5頁(yè)(1982))。優(yōu)選實(shí)施例涉及脫氧膽酸(DCA)或其前藥、或所述化合物或前藥醫(yī)藥上可接受的鹽、以及相關(guān)組合物和方法，其中脫氧膽酸(DCA)是：其中所述化合物并非自天然產(chǎn)生DCA的哺乳動(dòng)物或微生物分離。其它優(yōu)選實(shí)施例也涉及DCA的立體異構(gòu)體和其醫(yī)藥上可接受的鹽，并且涉及合成DCA和其立體異構(gòu)體和鹽時(shí)的中間體以及相關(guān)組合物和方法。任選地，本發(fā)明膽汁酸醫(yī)藥組合物呈鹽形式，并且任選地另外含有醫(yī)藥上可接受的稀釋劑、賦形劑或載劑。在一方面中，本發(fā)明涉及化合物和醫(yī)藥上可接受的賦形劑，所述化合物是脫氧膽酸(DCA)或其前藥、或所述化合物或前藥醫(yī)藥上可接受的鹽：其中所述化合物并非自天然產(chǎn)生DCA的哺乳動(dòng)物或微生物分離。鹽制備的優(yōu)選陽(yáng)離子可選自由以下組成的群組：鈉(Na+)、鉀(K+)、鋰(Li+)、鎂(Mg2+)、鈣(Ca2+)、鋇(Ba2+)、鍶(Sr2+)、和銨(NH4+)。也可自堿金屬或堿土金屬來(lái)制備鹽。堿金屬可選自鈉(Na+)、鉀(K+)、和鋰(Li+)。堿土金屬可選自由鎂(Mg2+)、鈣(Ca2+)、鋇(Ba2+)、和鍶(Sr2+)組成的群組。用作局部去除脂肪的醫(yī)藥組合物的優(yōu)選膽酸鹽是脫氧膽酸鈉。也涵蓋各實(shí)施例中化合物的前藥。前藥是活性或非活性化合物，在將前藥投與患者后其通過(guò)體內(nèi)生理作用(例如水解、代謝和諸如此類)以化學(xué)方式被修飾為各實(shí)施例中的化合物。例如，可制備本發(fā)明脫氧膽酸或其衍生物的C1-C10酯或酰胺，從而通過(guò)細(xì)胞膜的破裂和酯酶的釋放來(lái)觸發(fā)脫氧膽酸或其衍生物的釋放。伴隨著酯酶的釋放，酯保護(hù)基團(tuán)斷裂，從而使得脫氧膽酸活性形式或其衍生物原位存于期望位置。所述C1-C10酯任選地可包括1-4個(gè)選自氧、硫或氮的雜原子；任選地具有1-4個(gè)選自氧、硫或氮的雜原子的烷基，例如甲基、乙基、異丙基、丁基、己基等；在任何可接受取代點(diǎn)任選地具有1-4個(gè)雜原子并且總共具有最多10個(gè)碳原子的烷基苯基，例如芐基或乙基苯基；和諸如苯基等芳基。酰胺的實(shí)例包括(但不限于)異羥肟酸鹽。涉及酯的前藥的概述可參見(jiàn)斯文松(Svensson)和特內(nèi)科(Tunek)，藥物代謝評(píng)論(DrugMetabolismReviews)165(1988)和班德格阿德(Bundgaard)，藥物設(shè)計(jì)(DesignofProdrugs)，埃爾塞維爾科學(xué)出版社(Elsevier)(1985)，其是全文以引用方式并入本文中。脫氧膽酸的C1-C10酯或酰胺的合成為業(yè)內(nèi)所熟知。例如，可在無(wú)機(jī)酸存在下于酯化反應(yīng)中通過(guò)脫氧膽酸與醇的反應(yīng)來(lái)合成酯。脫氧膽酸和鵝脫氧膽酸的天然結(jié)構(gòu)顯示如下。顯示四個(gè)環(huán)(A、B、C、D)以及自D環(huán)延伸的羧酸側(cè)鏈。脫氧膽酸和鵝脫氧膽酸(CDCA)或其衍生物的酯、異羥肟酸鹽、和羥基酰胺的某些實(shí)例非限制性地闡述于下文中。通過(guò)D環(huán)側(cè)鏈上羧基的酯化反應(yīng)，不同官能團(tuán)可附接至脫氧膽酸或鵝脫氧膽酸上來(lái)生成前藥。這些D環(huán)側(cè)鏈酯的某些實(shí)例非限制性地展示于表1中。表1.與脫氧膽酸和鵝脫氧膽酸的D環(huán)側(cè)鏈偶合的官能團(tuán)脫氧膽酸或鵝脫氧膽酸和其衍生物的釋放可通過(guò)細(xì)胞膜的破裂和酯酶的釋放來(lái)觸發(fā)。伴隨著酯酶的釋放，酯保護(hù)基團(tuán)可斷裂從而使得脫氧膽酸或鵝脫氧膽酸的活性形式或其衍生物原位存于期望位置。脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸和其衍生物的前藥也包括可能具有與天然分子相反的立體化學(xué)的差向異構(gòu)體。這些差向異構(gòu)體分子的實(shí)例展示于表2中。表2.脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸和其衍生物的差向異構(gòu)體注射本發(fā)明實(shí)施例的膽汁酸組合物后可能出現(xiàn)局部刺激，并且因此需要同時(shí)或依次投與局部麻醉劑。例如，利多卡因(lidocaine)通常用于人體中，并且可作為共調(diào)配物(存于相同容器中并且同時(shí)注射)或共注射物(自不同容器注射)來(lái)投與。諸如利多卡因等麻醉劑可通過(guò)諸如貼劑或軟膏劑等局部制劑來(lái)投與。對(duì)于較深組織來(lái)說(shuō)，可將麻醉劑更深地注射至目標(biāo)組織中或全身性投與(例如全身麻醉、硬膜外麻醉或其它已知方法)。存于本發(fā)明溶液中的膽汁酸或膽汁酸鹽的濃度可為約0.001-10、0.01-5、或0.1-2％(w/w、w/v、或v/v)。優(yōu)選地，存于上述溶液中的膽酸或膽酸鹽的濃度可為約0.1-5％w/w或更優(yōu)選為約1％w/w。在某些實(shí)施例中，脂肪溶解溶液最多包含100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.05、0.02、或0.01克的一或多種洗滌劑、膽汁酸和/或膽汁酸鹽，例如脫氧膽酸或其鹽或脫氧膽酸鈉。在優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明溶液不包括任何脂質(zhì)、磷脂或磷脂酰膽堿。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明溶液最多包括5％(w/w、w/v、或v/v)脂質(zhì)、磷脂或磷脂酰膽堿。在某些實(shí)施例中，上述溶液可另外包含選自由以下組成的群組的第二治療藥劑：抗微生物劑、血管收縮藥、抗血栓藥、抗凝血藥、抑泡劑(suds-depressant)、消炎劑、鎮(zhèn)痛藥、分散劑、抗分散劑、滲透促進(jìn)劑、類固醇、鎮(zhèn)靜劑、肌肉松弛劑、和抗腹瀉藥。在某些實(shí)施例中，溶液存于最多可含500mL溶液的容器中。所述容器可為注射器或可裝載注射器的容器。在某些實(shí)施例中，組合物和方法另外包含已知可通過(guò)正交機(jī)制消除脂肪的分子。所述分子包括神經(jīng)肽Y(NPY)受體拮抗劑，包括(但不限于)NPY受體拮抗劑，例如BIBP-3226(阿目金(Amgen))、BIBO-3304(柏林格殷格汗(BoehringerIngleheim))、BMS-192548和AR-H040922(百時(shí)美施貴寶(Bristol-MyersSquibb)、LY-357897(禮來(lái)(EliLilly))、1229U91和GW438014S(葛蘭素史克(GlaxoSmithKline))、JNJ-5207787(強(qiáng)生(Johnson&Johnson))、Lu-AA-44608(靈北(Lundbeck))、MK-0557(默克(Merck)NPY)、NGD-95-1(紐羅根(Neurgogen))、NLX-E201(紐羅吉科斯(Neurologix))、CGP-71683(諾華(Novartis))、PD-160170(輝瑞(Pfizer))、SR-120819A、BIIE0246、和S.A.0204(賽諾菲安萬(wàn)特(SanofiAventis))、S-2367(施永利(Shiongli))、作為NPY受體拮抗劑的二氫吡啶和二氫吡啶衍生物、作為NPY受體拮抗劑的二環(huán)化合物、咔唑NPY受體拮抗劑、和作為NPY受體拮抗劑的三環(huán)化合物。參見(jiàn)(例如)WO2006/133160和美國(guó)專利第6,313,128號(hào)(其包括圖在內(nèi)的全部?jī)?nèi)容都以引用方式并入本文中)。也涵蓋脂肪選擇性促凋亡肽，例如尋靶至白色脂肪脈管系統(tǒng)的CKGGRAKDC肽。參見(jiàn)克羅寧M.G.等人，自然醫(yī)學(xué)，6月10(6):625-32(2004)。在一方面中，本發(fā)明涉及減少個(gè)體中皮下脂肪沉積的方法。所述方法包含向個(gè)體中的皮下脂肪沉積局部投與組合物的步驟，所述組合物包含：(i)脂肪溶解有效量的一或多種藥理學(xué)活性洗滌劑或膽汁酸和/或膽汁酸鹽、或脫氧膽酸或其鹽、或脫氧膽酸鈉；(ii)醫(yī)藥、獸醫(yī)、或美容賦形劑；和(iii)(任選地)脂質(zhì)，其中脂質(zhì)與膽汁酸或膽汁酸鹽的比最高為1％w/w并且其中所述組合物不包括脂肪酶或輔脂肪酶。在某些實(shí)施例中，脂肪沉積與選自由以下組成的群組的病況相關(guān)：肥胖癥、脂肪再分布綜合癥、眼瞼脂肪疝出、脂肪瘤、德?tīng)柨鲜喜?Dercum'sdisease)、脂肪代謝障礙、水牛背部脂肪代謝障礙、頸背面脂肪、內(nèi)臟脂肪過(guò)多、乳房脹大、肥胖過(guò)度、身體脂肪在軀干和臂周圍擴(kuò)散、和與蜂窩組織相關(guān)的脂肪沉積。在優(yōu)選實(shí)施例中，上述方法不包括對(duì)所述個(gè)體實(shí)施手術(shù)。在一方面中，本發(fā)明涉及自哺乳動(dòng)物中的所選位置去除脂肪沉積的方法，其包含向有需要的哺乳動(dòng)物投與治療有效量的DCA或其前藥或所述DCA或前藥醫(yī)藥上可接受的鹽：其中所述化合物并非自天然產(chǎn)生DCA的哺乳動(dòng)物或微生物分離。在一實(shí)施例中，本發(fā)明方法可另外包含向哺乳動(dòng)物投與至少一種選自由神經(jīng)肽Y(NPY)受體拮抗劑和脂肪選擇性促凋亡肽組成的群組的額外活性成份。在一實(shí)施例中，神經(jīng)肽Y(NPY)受體拮抗劑選自由以下組成的群組：BIBP-3226、神經(jīng)肽Y5拮抗劑(阿目金NPY受體拮抗劑)、BIBO-3304(柏林格殷格汗NPY受體拮抗劑)、BMS-192548(百時(shí)美施貴寶NPY受體拮抗劑)、AR-H040922(百時(shí)美施貴寶NPY受體拮抗劑)、LY-357897(禮來(lái)NPY受體拮抗劑)、埃斯特韋(Esteve)NPY-Y5受體拮抗劑、1229U91(葛蘭素史克NPY受體拮抗劑)、GW438014S(葛蘭素史克NPY受體拮抗劑)、JNJ-5207787(強(qiáng)生NPY受體拮抗劑)、Lu-AA-44608(靈北NPY受體拮抗劑)、MK-0557(默克NPY受體拮抗劑)、NGD-95-1(紐羅根NPY受體拮抗劑)、NLX-E201(紐羅吉科斯NPY受體拮抗劑)、CGP-71683(諾華NPY受體拮抗劑)、PD-160170(輝瑞NPY受體拮抗劑)、SR-120819A(賽諾菲安萬(wàn)特NPY受體拮抗劑)、BIIE0246(賽諾菲安萬(wàn)特NPY受體拮抗劑)、S.A.0204(賽諾菲安萬(wàn)特NPY受體拮抗劑)、S-2367(施永利NPY受體拮抗劑)、作為NPY受體拮抗劑的二氫吡啶、作為NPY受體拮抗劑的二氫吡啶衍生物、作為NPY受體拮抗劑的二環(huán)化合物、咔唑NPY受體拮抗劑、和作為NPY受體拮抗劑的三環(huán)化合物。參見(jiàn)(例如)WO2006/133160和美國(guó)專利第6,313,128號(hào)(其包括圖在內(nèi)的全部?jī)?nèi)容都是以引用方式并入本文中)。在一實(shí)施例中，脂肪選擇性促凋亡肽是尋靶至白色脂肪脈管系統(tǒng)的CKGGRAKDC肽。參見(jiàn)克羅寧M.G.等人，自然醫(yī)學(xué)，6月10(6):625-32(2004)。在一方面中，本發(fā)明涉及在個(gè)體皮膚區(qū)域中還原皮膚病況外觀的方法。所述方法包含以下步驟：向所述皮膚區(qū)域局部投與包含以下的組合物：(i)緊膚有效量的一或多種藥理學(xué)活性洗滌劑、或膽汁酸和/或膽汁酸鹽、或脫氧膽酸或其鹽、或脫氧膽酸鈉，(ii)醫(yī)藥、獸醫(yī)、或美容賦形劑，和(iii)(任選地)脂質(zhì)。在某些實(shí)施例中，投與步驟涉及通過(guò)皮下或經(jīng)皮注射遞送本發(fā)明組合物。在某些實(shí)施例中，所治療或改善的皮膚病況選自由以下組成的群組：皮膚松垂、皮膚衰老、皮膚不規(guī)則、和皺紋。在某些實(shí)施例中，所治療皮膚區(qū)域是在眼下、頦下、臂下、臀部、頰、眉毛、小腿、背部、大腿、踝部、或腹部。在某些實(shí)施例中，將用于在皮膚區(qū)域還原皮膚病況外觀的組合物調(diào)配為緊膚溶液。所述緊膚溶液可另外包含選自由以下組成的群組的第二治療藥劑：抗微生物劑、血管收縮劑、抗血栓藥、抗凝血藥、抑泡劑、消炎藥、鎮(zhèn)痛藥、分散劑、抗分散劑、滲透促進(jìn)劑、類固醇、鎮(zhèn)靜劑、肌肉松弛劑、和抗腹瀉藥。在優(yōu)選實(shí)施例中，洗滌劑包含選自由以下組成的群組的膽汁酸：脫氧膽酸、膽酸、鵝脫氧膽酸、7-α-去羥基鵝脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸、上述膽汁酸中任一種的二羥基?；撬?、三羥基牛磺酸和甘氨酸偶合物。在某些實(shí)施例中，洗滌劑包含具有選自由以下組成的群組的陽(yáng)離子的膽汁酸鹽：鈉(Na+)、鉀(K+)、鋰(Li+)、鎂(Mg2+)、鈣(Ca2+)、鋇(Ba2+)、鍶(Sr2+)、和銨(NH4+)。在某些實(shí)施例中，洗滌劑包含具有堿金屬或堿土金屬陽(yáng)離子的膽汁酸鹽。優(yōu)選地，堿金屬為鈉(Na+)、鉀(K+)、或鋰(Li+)并且堿土金屬為鎂(Mg2+)、鈣(Ca2+)、鋇(Ba2+)、或鍶(Sr2+)。更優(yōu)選地，膽汁酸鹽是脫氧膽酸鈉。另一實(shí)施例提供在哺乳動(dòng)物中乳化脂肪的方法，其包含向有需要的哺乳動(dòng)物投與治療有效量的化合物，所述化合物是DCA或其前藥或所述DCA或前藥醫(yī)藥上可接受的鹽：其中所述化合物并非自天然產(chǎn)生DCA的哺乳動(dòng)物或微生物分離。另一實(shí)施例提供溶解磷脂酰膽堿的方法，其包含混合磷脂酰膽堿與有效量的化合物，所述化合物是DCA或其前藥或所述DCA或前藥醫(yī)藥上可接受的鹽，其中所述化合物并非自天然產(chǎn)生DCA的哺乳動(dòng)物或微生物分離。本發(fā)明另一方面涉及混合諸如脫氧膽酸(DCA)等脂肪-燒蝕性膽汁酸與殺滅脂肪細(xì)胞的試劑。在一方面中，本發(fā)明涵蓋通過(guò)混合以正交機(jī)制消除脂肪的分子與脫氧膽酸鹽注射物來(lái)增強(qiáng)脫氧膽酸鹽注射美容效果的方式。所述候選分子的實(shí)例包括(但不限于)本文所述神經(jīng)肽Y(NPY)拮抗劑和脂肪選擇性促凋亡肽。由于達(dá)成期望效應(yīng)需要脂肪細(xì)胞殺滅和緊膚二者，因此可通過(guò)添加具有有效脂肪細(xì)胞殺滅效應(yīng)的分子來(lái)增強(qiáng)具有脂肪消除能力和有效緊膚效應(yīng)的試劑(例如脫氧膽酸鹽)的效應(yīng)。此外，由于脫氧膽酸鹽可導(dǎo)致脈管滲漏，因此需要到達(dá)脈管系統(tǒng)才能實(shí)施殺滅的分子(例如結(jié)合毛細(xì)血管腔面上所表達(dá)蛋白質(zhì)的某些促凋亡肽)可到達(dá)這些蛋白。因此，所述試劑可與脫氧膽酸鹽具有協(xié)同性，從而可能在更少治療療程中以更有效方式達(dá)成體形塑造。合成方法在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供合成DCA的化合物、鹽、和前藥以及其相關(guān)中間體的方法。本文所用類固醇支架的編號(hào)遵循圖1中所示的一般慣例。因此，本發(fā)明提供制備脫氧膽酸(DCA)或其酯或其醫(yī)藥上可接受的鹽的方法：所述方法包含：(a)在氫化條件下使9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮1與H2反應(yīng)以形成化合物2(b)使化合物2與酸反應(yīng)以形成化合物3(c)使化合物3與還原劑反應(yīng)以形成化合物4，其呈4與5的混合物形式(d)在烯烴形成條件下使化合物4與二碳烯化劑反應(yīng)以形成化合物6(e)將化合物6轉(zhuǎn)化為式7化合物，其中P是保護(hù)基團(tuán)(f)在路易斯酸存在下使式7化合物與丙炔酸烷基酯CHCC(O)OR或丙烯酸烷基酯CH2＝CHC(O)OR反應(yīng)(其中R是烷基)以形成式8化合物，其中P是保護(hù)基團(tuán)，R是烷基，并且虛線----是單鍵或雙鍵；(g)在氫化條件下使式8化合物與H2反應(yīng)以形成式9化合物，其中P是保護(hù)基團(tuán)并且R是烷基(h)使式9化合物與氧化劑反應(yīng)以形成式10化合物，其中P是保護(hù)基團(tuán)并且R是烷基(i)在氫化條件下使式10化合物與H2反應(yīng)以形成式11化合物，其中P是保護(hù)基團(tuán)并且R是烷基(j)使式11化合物與還原劑反應(yīng)以形成式12化合物，其中P是保護(hù)基團(tuán)并且R是烷基和(k)使式12化合物暴露于去保護(hù)條件下以形成其酯，并且任選地使其暴露于適宜水解條件下以形成脫氧膽酸或其醫(yī)藥上可接受的鹽。本發(fā)明也提供下文方案1中所示的以下中間體，其中P和R是如上文中所定義。方案1.合成脫氧膽酸(DCA)在一實(shí)施例中，(a)項(xiàng)中的氫化條件包含Pd/C催化劑。在一實(shí)施例中，(b)項(xiàng)中的酸是無(wú)機(jī)酸。在某些方面中，無(wú)機(jī)酸是H2SO4。在一實(shí)施例中，(c)項(xiàng)中的還原劑是LiAl(OtBu)3H。在一實(shí)施例中，(d)項(xiàng)中的二碳烯化劑是諸如Ph3PCH2CH3+Br-等魏悌希試劑。在一實(shí)施例中，化合物7-12的保護(hù)基團(tuán)P是-C(O)CH3。在某些方面中，將化合物6暴露于?；瘲l件下以形成7a，例如通過(guò)用乙酸酐或諸如Et3N、吡啶和/或二甲胺基吡啶等有機(jī)堿處理6來(lái)達(dá)成。在一實(shí)施例中，(f)項(xiàng)中的路易斯酸是EtAlCl2。在一實(shí)施例中，(f)項(xiàng)中的丙炔酸烷基酯是丙炔酸甲酯。在一實(shí)施例中，(f)項(xiàng)中的丙烯酸烷基酯是丙烯酸甲酯。在一實(shí)施例中，(g)項(xiàng)中的氫化條件包含PtO2或Pd/C催化劑。在一實(shí)施例中，(h)項(xiàng)中的氧化劑是CrO3。在一實(shí)施例中，(i)項(xiàng)中的氫化條件包含Pd/C催化劑。在一實(shí)施例中，(j)項(xiàng)中的還原劑是LiAl(OtBu)3H。在一實(shí)施例中，當(dāng)P為-C(O)CH3時(shí)，(k)項(xiàng)中的去保護(hù)和水解條件包含使化合物12與堿土金屬氫氧化物、堿土金屬醇鹽、或二者的混合物反應(yīng)。在某些方面中，水解條件包括酸處理以獲得脫氧膽酸。在其它方面中，省略酸處理以獲得對(duì)應(yīng)鹽。在一實(shí)施例中，堿土金屬醇鹽是LiOH。在一實(shí)施例中，脫氧膽酸的鹽可通過(guò)與堿土金屬醇鹽或氫氧化物反應(yīng)來(lái)制備。脫氧膽酸的鹽包括鈉(Na+)、鉀(K+)、和鋰(Li+)鹽。在一實(shí)施例中，提供選自由以下組成的群組的中間體化合物9α-羥基-5β-雄甾烷-3,17-二酮(2)；5β-雄甾-9(11)-烯-3,17-二酮(3)；(Z)-3α-羥基-5β-孕甾-9(11),17(20)-二烯(6)；(Z)-3α-乙酰氧基-5β-孕甾-9(11),17(20)-二烯(7a)；(E)-3α-乙酰氧基-5β-膽-9(11),16,22-三烯-24-酸甲酯(8a)；3α-乙酰氧基-5β-膽-9(11),16-二烯-24-酸甲酯(8b)；3α-乙酰氧基-5β-膽-9(11)-烯-12-酮-24-酸甲酯(10a)；和3α-乙酰氧基-5β-膽烷-12-酮-24-酸甲酯(11a)。醫(yī)藥組合物和投與模式組合物可包括所揭示化合物以及至少一種醫(yī)藥上可接受的賦形劑?？山邮艿馁x形劑無(wú)毒性、有助于投與、并且對(duì)所揭示化合物的治療益處無(wú)不良影響。所述賦形劑可為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通?？色@得的任一固體、液體、半固體或(在氣溶膠組合物情況下)氣體賦形劑。固體醫(yī)藥賦形劑包括淀粉、纖維素、滑石粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、水稻、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、氯化鈉、無(wú)水脫脂乳和諸如此類。液體和半固體劑賦形劑可選自甘油、丙二醇、水、乙醇和各種油，包括那些源于石油、植物或合成油者，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。優(yōu)選液體載劑(尤其用于可注射溶液者)包括水、鹽水、水性右旋糖、和二醇。一般來(lái)說(shuō)，優(yōu)選實(shí)施例的化合物可通過(guò)具有類似效用的藥劑的任一已接受投與模式以治療有效量來(lái)投與。優(yōu)選實(shí)施例的化合物(即活性成份)的實(shí)際量可取決于諸如以下等多種因素：欲治療疾病的嚴(yán)重程度、個(gè)體的年齡和相對(duì)健康狀況、所用化合物的效能、投與途徑和形式、和其它因素。藥物可每日投與一次以上，優(yōu)選地每日投與一次或兩次。所有這些因素都為會(huì)診醫(yī)師所熟知。調(diào)配物中化合物的量可在所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所用整個(gè)范圍內(nèi)變化?？芍苽浔疚乃龈鞣矫嬷械谋景l(fā)明組合物，其中以重量/水相體積計(jì)或在假定水密度(即重量與體積之間的比為1∶1)時(shí)以w/w計(jì)，脫氧膽酸部分在約0.5％-10％范圍內(nèi)。在另一方面中，本發(fā)明實(shí)施例涉及濃度最高為稀釋劑飽和點(diǎn)的當(dāng)前所述醫(yī)藥組合物?？筛鶕?jù)諸如濃度和pH等條件來(lái)選擇觸變粘度。參見(jiàn)(例如)穆霍帕德亞,S.和U.麥特拉,當(dāng)代科學(xué)87:1666-1683(2004)，第1680頁(yè)。在某些實(shí)施例中，投與步驟涉及通過(guò)經(jīng)皮貼劑、泵、或皮下儲(chǔ)存來(lái)遞送本發(fā)明組合物。在某些實(shí)施例中，投與步驟涉及以局部或皮下方式遞送本發(fā)明組合物。在具體實(shí)施例中，投與步驟涉及局部(例如皮下或真皮下)投與至所述個(gè)體的眼下、頦下、臂下、臀部、小腿、背部、大腿、或腹部區(qū)域?？赏ㄟ^(guò)皮下或經(jīng)皮注射來(lái)達(dá)成投與。合成方案下文提供完成膽汁酸醫(yī)藥組合物的化學(xué)合成的方法和可用中間體的其它實(shí)例。以下這些闡述和實(shí)例提供自天然產(chǎn)生DCA的哺乳動(dòng)物或微生物提取此化合物的替代方案。本發(fā)明中意欲使用合成途徑1-6來(lái)合成脫氧膽酸(DCA)。合成途徑1B和實(shí)例1-11展示自氫化可的松合成DCA。1.始于腎上腺雄酮通過(guò)9(11)-烯或11,12-烯的第1A合成途徑方案1A(下文)的可的松(化合物1.1)廣泛用作完全合成材料。可使用氯鉻酸吡啶鎓(PCC)使其有效斷裂以形成C17酮化合物。此生成腎上腺雄酮(化合物1.2)的斷裂也可使用HIO4或鉍酸鈉(NaBiO3)來(lái)達(dá)成。將化合物1.2轉(zhuǎn)化為化合物1.3的反應(yīng)是已知化學(xué)過(guò)程?；衔?.3向化合物1.4的轉(zhuǎn)化涉及單縮酮化。之后的步驟是3-酮-4-烯再生，選擇性還原4,5-烯(H2/Pt/DMF)以產(chǎn)生C5β-構(gòu)型，并且將C3羰基選擇性還原為期望3α-構(gòu)型以產(chǎn)生化合物1.5。在將化合物1.5轉(zhuǎn)化為化合物1.6時(shí)添加保護(hù)基團(tuán)并且隨后將產(chǎn)物還原，從而產(chǎn)生C11β-醇(同軸構(gòu)型)，即化合物1.7，其適合發(fā)生區(qū)域選擇性消除反應(yīng)而生成關(guān)鍵的9(11)-烯(即化合物1.7轉(zhuǎn)化為化合物1.8)。合成方案在此處分支，其中化合物1.7可用作轉(zhuǎn)化為化合物1.8或化合物1.9的起始材料。由于C11羥基與C9氫原子之間存在反式雙軸關(guān)系，因此用于將化合物1.7轉(zhuǎn)化為化合物1.8的消除反應(yīng)具有區(qū)域選擇性。產(chǎn)生化合物1.9的異構(gòu)C11-C12烯烴的替代消除模式也具有區(qū)域選擇性，其涉及順式熱消除(即化合物1.7轉(zhuǎn)化為化合物1.9)。方案1A.合成DCA中C12羥基的兩個(gè)C環(huán)前體化合物1.8的烯丙位氧化(通過(guò)用CrO3和3,5二甲基吡唑處理)產(chǎn)生含烯酮化合物1.10?；衔?.9自類固醇的α-位向發(fā)生過(guò)酸氧化以產(chǎn)生C11-12環(huán)氧化物化合物1.11(參見(jiàn)上述方案1A)。這些化學(xué)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生C12羥基官能團(tuán)的兩個(gè)關(guān)鍵前體，即化合物1.10和化合物2.1(方案1A和2)。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可將上述可的松途徑修改為始于氫化可的松，氫化可的松具有相同碳骨架和相同的氧原子相對(duì)布局，并且氫化可的松與可的松的差別僅在于C-11載氧碳原子的氧化狀態(tài)不同。氫化可的松是在市場(chǎng)上購(gòu)得并且此化合物的各種合成是已知的(什切爾巴(Szczebara)等人，自然生物技術(shù)(NatureBiotechnology)21∶143-149(Feb.2003))，其包括總化學(xué)合成(伍德沃R.B.(WoodwardR.B.)等人，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志74∶4223(1952))。酮1.13是通過(guò)α,β-不飽和雙鍵的氫解自氫化可的松1.12開(kāi)始合成(方案1B)，之后使用硼氫化鈉實(shí)施整體酮還原以使得可使用NaIO4使1,2-二醇斷裂，由此在類固醇環(huán)系統(tǒng)的D環(huán)上形成C17酮。之后用氯鉻酸吡啶鎓(PCC)氧化來(lái)產(chǎn)生1.13。用處理1.13，之后用乙酸酐/吡啶實(shí)施乙?；垣@得受保護(hù)醇1.15。之后用魏悌希試劑烯化1.15來(lái)提供烯烴1.16，然后用丙炔酸甲酯和乙基二氯化鋁處理1.16以形成二烯1.17。在對(duì)兩個(gè)雙鍵實(shí)施氫化后，還原酮1.18，并且在用存于吡啶中的SOCl2處理后消除所得醇中間體以獲得烯烴1.19。用CrO3對(duì)烯烴1.19實(shí)施烯丙位氧化并且在氫化條件下還原雙鍵以獲得酮1.21。去除乙酸根保護(hù)基團(tuán)并且氧化所得醇以獲得二酮1.22。用LiAlH(O-tBu)3還原1.22并且水解甲酯以獲得DCA。方案1B.自氫化可的松合成DCA化合物1.10和2.1的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化展示于方案2中。首先修飾化合物1.10以使其含有與DCA相同的經(jīng)適度官能化的C環(huán)系統(tǒng)(方案2)。立體選擇性還原C12羰基以產(chǎn)生化合物2.1，并且對(duì)存于化合物2.1中的9(11)雙鍵實(shí)施催化氫化而獲得化合物2.2。方案2.使用烯丙位氧化途徑引入C12α-羥基方案3展示將含環(huán)氧化物的化合物1.11轉(zhuǎn)化為方案2的類似C12α-羥基類固醇化合物2.2。方案3.C11-C12環(huán)氧化物的立體選擇性還原如上所述，在這兩種途徑中形成共同中間體化合物2.2。合成DCA的下一步驟是修飾存于化合物2.2中的D環(huán)，以使所述化合物含有DCA的經(jīng)羧基側(cè)鏈取代的D環(huán)(方案4和方案5)。方案4.去保護(hù)和魏悌希反應(yīng)首先水解化合物2.2的C17縮酮和C3甲硅烷醚基。然后實(shí)施魏悌希反應(yīng)以產(chǎn)生化合物4.2。通過(guò)烯反應(yīng)實(shí)施化合物4.2向化合物5.1的轉(zhuǎn)化。之后催化還原化合物5.1并水解酯來(lái)產(chǎn)生DCA(方案5)。方案5.用以安裝DCA側(cè)鏈的烯反應(yīng)和催化還原2.始于可的松通過(guò)腎上腺雄酮的第2合成途徑(異類固醇(3,5-環(huán)甾醇)途徑)腎上腺雄酮(化合物1.2，方案6)在C17的選擇性縮酮化、硼氫化物還原、甲磺酰化、和緩沖水解產(chǎn)生含有異類固醇(3,5-環(huán)甾醇)的化合物6.1?；衔?.1發(fā)生9(11)-烯形成(化合物6.1轉(zhuǎn)化為化合物6.2，方案6)和烯丙位氧化(化合物6.2轉(zhuǎn)化為化合物6.3，方案6)，之后實(shí)施羰基還原以產(chǎn)生化合物6.4。異甾醇的水解和氫化產(chǎn)生化合物6.5，可通過(guò)上文第1合成途徑中所示合成方法將其轉(zhuǎn)化為DCA。方案6.通過(guò)形成異類固醇(即3,5-環(huán)甾醇)來(lái)保護(hù)A-B環(huán)系統(tǒng)3.始于番麻皂素(Hecogenin)的第3合成途徑番麻皂素(化合物7.1，方案7)是在墨西哥山藥(Mexicanyam)和其它龍舌蘭屬(Agave)植物中大量發(fā)現(xiàn)的植物甾醇。番麻皂素作為DCA合成起始材料的主要優(yōu)勢(shì)在于，其C12氧官能度與DCA一致。始于番麻皂素的合成途徑中的第一步驟是將番麻皂素(化合物7.1)中的C12羰基立體選擇性還原為所需C12-α構(gòu)型(化合物7.1轉(zhuǎn)化為化合物7.2)。然后使3-β-醇、5α-AB環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為3α-醇、5β-AB環(huán)系統(tǒng)(化合物7.1轉(zhuǎn)化為化合物7.2，轉(zhuǎn)化為化合物7.3)(方案7)。在化合物7.2轉(zhuǎn)化為化合物7.3后，通過(guò)熟知的馬克(Marker)降解(馬克R.E.、羅爾曼E.(Rohrmann,E.)，薩爾薩皂苷元、薩爾薩皂苷元酸和相關(guān)物質(zhì)的甾醇類LXIX.氧化產(chǎn)物(Sterols.LXIX.OxidationProductsofSarsasapogenin.SarsasapogenoicAcidandRelatedSubstances)，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志，61(8)：第2072-2077頁(yè)(1939))產(chǎn)生化合物7.4?？赏ㄟ^(guò)方案4和5中所述的方法來(lái)達(dá)成將D環(huán)側(cè)鏈(方案8)安裝至化合物8.2中?；衔?.2中所需的C17酮是通過(guò)臭氧分解化合物8.1的乙酸烯醇酯來(lái)形成(方案8)。然后以與方案5中類似的方式使用烯化和烯反應(yīng)序列自8.2制備DCA。始于番麻皂素的替代途徑展示于方案9和10中。方案7.C12羥基的引入，AB環(huán)修飾和側(cè)鏈斷裂方案8.側(cè)鏈引入方案9.二硫乙烷途徑生成3-酮-4-烯方案10A.通過(guò)3-酮-4-烯形成DCA4.始于皂苷配基(Sapogenin)的第4合成途徑皂苷配基得自與皂苷C3羥基連接的糖和二糖的水解(即類固醇糖苷)。這些皂苷配基是廣泛存在的植物產(chǎn)物。在自然界中皂苷是以下文所示的螺酮縮醇結(jié)構(gòu)存在?；衔?0.3也可自劍麻皂素(tigogenin)、薯蕷皂苷配基(diosgenin)、克洛皂苷元(chlorogenin)、異菝葜皂苷元(smilagenin)和番麻皂素(化合物7.1)形成。吾等確信DCA可自這些化合物中的每一種來(lái)合成，即劍麻皂素、薯蕷皂苷配基、克洛皂苷元、異菝葜皂苷元和番麻皂素(化合物7.1)。(Y.馬祖爾(Y.Mazur)、N.達(dá)涅利(N.Danieli)和弗朗茨松徳海姆(FranzSondheimer)，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志；82,5809(1960))。既然可自番麻皂素合成DCA，則可確定任一上述皂苷配基都同樣可用作DCA合成的起始材料。方案10B.始于皂苷的合成途徑5.始于豆甾醇的第5合成途徑豆甾醇(化合物11.1)是可自多種途徑獲得的植物甾醇。作為DCA合成的起始材料，其優(yōu)勢(shì)在于其含有官能化AB環(huán)系統(tǒng)和易于斷裂的側(cè)鏈部分。其缺點(diǎn)在于其C環(huán)中缺乏DCA合成所需關(guān)鍵官能團(tuán)。在此合成途徑中，通過(guò)異類固醇形成來(lái)保護(hù)豆甾醇(化合物11.1)的AB環(huán)，之后實(shí)施臭氧分解以形成安裝于C17的側(cè)鏈并且將其還原為呈羧基掩蔽形式的C24-醇(方案11)。隨后的步驟在C12生成烯丙型位置(方案12)。B環(huán)二烯形成和乙酸汞氧化是已知方法并且對(duì)B環(huán)系統(tǒng)實(shí)施催化還原以產(chǎn)生與上述先前途徑共有的中間體。然而，與其它途徑相反，側(cè)鏈已經(jīng)存在。實(shí)施烯丙位氧化(化合物12.4轉(zhuǎn)化為化合物1.20)和立體選擇性還原(化合物1.20轉(zhuǎn)化為化合物1.21)，之后實(shí)施先前所述步驟，從而產(chǎn)生可轉(zhuǎn)化為DCA的產(chǎn)物。方案11.異類固醇的臭氧分解和側(cè)鏈還原方案12.三烯形成和烯丙位氧化豆甾醇途徑的變化形式使用B環(huán)二烯的狄爾斯-阿德?tīng)?Diels-Alder)保護(hù)。此是有利的，因?yàn)槠淇煞蛛x9(11)雙鍵以在烯丙位氧化步驟期間防止可能的干擾(方案13)。方案13.三烯形成和環(huán)B二烯的狄爾斯-阿德?tīng)柋Ｗo(hù)6.始于麥角固醇(Ergosterol)的第6合成途徑麥角固醇(化合物14.1)是易于獲得的起始材料并且可用于通過(guò)本申請(qǐng)案中所述程序的調(diào)整形式來(lái)制備DCA。烯丙位氧化提供產(chǎn)生C12氧官能度的便捷途徑(方案14)。此途徑的優(yōu)勢(shì)在于始于環(huán)B二烯。其與豆甾醇途徑匯聚于一點(diǎn)。方案14.始于麥角固醇的三烯形成優(yōu)選實(shí)施例的化合物可使用下列一般方法和程序自易于購(gòu)得的起始材料來(lái)制備。應(yīng)了解，盡管給出了典型或優(yōu)選制程條件(即反應(yīng)溫度、時(shí)間、反應(yīng)物的摩爾比、溶劑、壓力等)，但除非另有說(shuō)明，否則也可使用其它制程條件。最佳反應(yīng)條件可隨所用特定反應(yīng)物或溶劑而變化，但所述條件可由所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)優(yōu)化程序來(lái)確定。此外，如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所了解，可能需要習(xí)用保護(hù)基團(tuán)來(lái)防止某些官能團(tuán)發(fā)生不期望反應(yīng)。各種官能團(tuán)的適宜保護(hù)基團(tuán)以及保護(hù)和去保護(hù)特定官能團(tuán)的適宜條件為業(yè)內(nèi)所熟知。例如，許多保護(hù)基團(tuán)闡述于T.W.格林(T.W.Greene)和G.M.伍茨(G.M.Wuts)，有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)(ProtectingGroupsinOrganicSynthesis)，第3版，威利出版社(Wiley)，紐約，1999和其中所引用參考文獻(xiàn)中。用于本文所述反應(yīng)的起始材料和試劑通常是已知化合物或可通過(guò)已知程序或其經(jīng)明顯修改的形式來(lái)制備。例如，許多起始材料和試劑可自諸如奧德里奇化學(xué)(AldrichChemical)公司(密爾沃基(Milwaukee)，威斯康星州，USA)、巴赫姆(Bachem)(托倫斯(Torrance)，加利福尼亞，USA)、伊姆卡-凱姆斯(Emka-Chem)或西格瑪(圣路易斯，密蘇里州，USA)等供應(yīng)商購(gòu)得。其它起始材料和試劑可通過(guò)闡述于諸如下列等標(biāo)準(zhǔn)參考文本中的程序或其經(jīng)明顯修改的形式來(lái)制備：菲澤和有機(jī)合成用菲氏試劑(FieserandFieser'sReagentsforOrganicSynthesis)，第1-15卷(約翰威利父子公司(JohnWileyandSons),1991)、碳化合物的羅德化學(xué)(Rodd'sChemistryofCarbonCompound)，第1-5卷和增刊(埃爾塞維爾科學(xué)出版社(ElsevierSciencePublishers),1989)、有機(jī)反應(yīng)(OrganicReactions)，第1-40卷(約翰威利父子公司,1991)、馬氏高級(jí)有機(jī)化學(xué)(March'sAdvancedOrganicChemistry)，(約翰威利父子公司，第4版),和拉洛克系統(tǒng)有機(jī)化學(xué)(Larock'sComprehensiveOrganicTransformations)(VCH出版(VCHPublishers)公司，1989)。實(shí)例若適宜，可使用諸如以下等習(xí)用技術(shù)分離和純化優(yōu)選實(shí)施例的各種起始材料、中間體和化合物：沉淀、過(guò)濾、結(jié)晶、蒸發(fā)、蒸餾、和色譜。可使用諸如以下等習(xí)用方法對(duì)這些化合物實(shí)施表征：熔點(diǎn)法、質(zhì)譜、核磁共振、和各種其它波譜分析。在第1合成途徑的方案1B中實(shí)施產(chǎn)物合成的步驟的實(shí)例性實(shí)施例更詳細(xì)地闡述于下文中。表3闡述在以下實(shí)例和整個(gè)說(shuō)明書中用于在實(shí)例性反應(yīng)方案和合成途徑中表達(dá)各種化合物/部分/裝置/程序/特性的縮寫。表3一般方法：氧敏感和濕度敏感材料的處理是在氬氣氛下用經(jīng)火焰干燥的雙頸燒瓶來(lái)實(shí)施。使用SE-馬克(SE-Make)硅膠(60-120目)、光譜化學(xué)(Spectrochem)硅膠(230-400目)或90中性氧化鋁(SD-精細(xì)化工(SD-FineChem)有限公司，印度)來(lái)實(shí)施柱色譜。在默克硅膠(Kieselgel)60F254(0.25mm)板(默克公司，白宮站(WhitehouseStation)，NJ)上實(shí)施分析型薄層色譜(TLC)。通過(guò)UV光(254nm)燈或通過(guò)用存于乙醇中的硫酸(5％)和對(duì)茴香醛(3％)的溶液碳化來(lái)檢測(cè)斑點(diǎn)顯影。裝置：可在下文所述裝置和設(shè)備上實(shí)施對(duì)本文所述反應(yīng)方案和合成途徑的化合物和產(chǎn)物的分析。核磁共振(NMR)在瓦里安水星-雙子星(VarianMercury-Gemini)200(1HNMR,200MHz；13CNMR,50MHz)或瓦里安水星-愛(ài)諾瓦(Inova)500(1HNMR,500MHz；13CNMR,125MHz)(瓦里安公司，帕羅奧圖，CA)波譜儀上以溶劑共振作為內(nèi)標(biāo)(1HNMR，在7.26ppm處的CHCl3或在2.5ppm處的DMSO和在3.33ppm處的DMSO-H2O；13CNMR，在77.0ppm處的CDCl3或在39.5ppm處的DMSO)記錄質(zhì)子和碳核磁共振波譜(1HNMR和13CNMR)。1HNMR數(shù)據(jù)報(bào)告如下：化學(xué)位移(δ，ppm)，多重態(tài)(s＝單峰，d＝雙峰，t＝三峰，q＝四重峰，br＝寬峰，m＝多重峰)，偶聯(lián)常數(shù)(Hz)，和積分。紅外光譜紅外光譜(FT-IR)是在超市吉之島(JASCO)-460+型(超市吉之島公司，伊士頓，MD)上運(yùn)行。質(zhì)譜是以帕金埃爾默(PerkinElmer),API-2000波譜儀(帕金埃爾默公司，沃爾瑟姆(Waltham)，MA)使用ES+模式來(lái)獲得。熔點(diǎn)熔點(diǎn)是使用LAB-INDIA熔點(diǎn)測(cè)量裝置(印度實(shí)驗(yàn)室儀器Pvt.(LabindiaInstrumentsPvt.公司)，印度)來(lái)測(cè)定并且未經(jīng)校正。高壓液相色譜HPLC色譜圖是使用島津(SHIMADZU)-2010型以PDA檢測(cè)器(島津公司，日本)來(lái)記錄。光學(xué)活性比旋光度([α]D)是使用超市吉之島-1020(超市吉之島公司，伊士頓，MD)在589nm處測(cè)定并且未經(jīng)校正?；瘜W(xué)物質(zhì)：除非另外說(shuō)明，否則使用未經(jīng)純化的市售試劑。自二苯甲酮羰基鈉蒸餾二乙醚和THF。無(wú)水DMF、DCM、戊烷和己烷是通過(guò)自CaH2蒸餾來(lái)獲得。實(shí)例1制備雄甾烷-3,11,17-三酮(1.13)將10％Pd/C(2.5g,5wt％)添加至存于DMF(250mL)中的氫化可的松(化合物1.12)(50.0g,138.12mmol)溶液中。在帕爾(Parr)裝置(50psi)中將所得漿液氫化12h。如TLC所顯示，在起始材料完全消失后，通過(guò)小型硅藻土濾塞過(guò)濾粗反應(yīng)混合物并且在真空下去除溶劑。獲得呈無(wú)色固體形式的粗產(chǎn)物(48.0g)。將NaBH4(2.1g,55.3mmol)添加至存于EtOH(500mL)和CH2Cl2(500mL)中的上述粗產(chǎn)物(48.0g,131.86mmol)的溶液中。1小時(shí)后，依次添加丙酮(50mL)和水(150mL)以及NaIO4(70.5g,329.6mmol)。在室溫下將混合物攪拌過(guò)夜。添加蒸餾水(500mL)并且用乙酸乙酯(3x250mL)萃取混合物。通過(guò)硅膠濾塞清洗乙酸乙酯層并且蒸發(fā)溶劑以獲得38g呈無(wú)色固體形式的粗產(chǎn)物。不經(jīng)純化即進(jìn)一步氧化粗產(chǎn)物。經(jīng)30分鐘以3等份將PCC(40.4g,187.5mmol)添加至存于CH2Cl2(400mL)中的上述粗產(chǎn)物的溶液中。在室溫下將所得反應(yīng)混合物攪拌約3-4h。如TLC所監(jiān)測(cè)，在反應(yīng)完成后，依次通過(guò)硅藻土和硅膠過(guò)濾粗反應(yīng)混合物并且通過(guò)柱色譜[59(W)x700(L)mm，60-120目二氧化硅，150g]來(lái)純化粗材料，其中用乙酸乙酯/己烷(3∶10)洗脫[每個(gè)溶離份50mL，10mL/min洗脫，通過(guò)TLC用對(duì)茴香醛碳化來(lái)監(jiān)測(cè)；在EtOAc/己烷(1∶1)中化合物1.13的Rf＝0.37并且化合物1.12的Rf＝0.05]以提供呈無(wú)色固體形式的非對(duì)映異構(gòu)化合物1.13(33.0g，產(chǎn)率79％)。通過(guò)制備型HPLC純化所獲得粗材料，其中使用月神(PhenomenexLunov)C18管柱(250x30.0mm,10μ)并且用CH3CN:H2O(12∶13)以25mL/min的流速和每個(gè)溶離份15mL實(shí)施等度洗脫。制備型HPLC僅用于純化，并不用于分析。表4闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表4實(shí)例23β-羥基-雄甾烷-11,17-二酮(1.14)經(jīng)15分鐘于惰性氣氛和-78℃下將(98.39mL，98.01mmol，存于THF中的1M溶液)添加至存于THF(330mL)中的化合物1.13(33.0g,109.27mmol)的溶液中并且在-78℃下將其攪拌約3-4h。用NaOH水溶液(2M,70mL)使反應(yīng)混合物驟冷。用乙酸乙酯(500mL)稀釋粗反應(yīng)混合物并且用水(3x75mL)、飽和鹽水溶液(100mL)洗滌有機(jī)層并用MgSO4(75g)干燥。在真空下去除溶劑以獲得33g粗材料。不經(jīng)純化即對(duì)粗產(chǎn)物實(shí)施乙?；?。粗材料的純化通過(guò)柱色譜[29(W)x600(L)mm,230-400目二氧化硅，200g]純化粗材料，其中用乙酸乙酯/己烷(1∶4)洗脫[每個(gè)溶離份25mL，5mL/min洗脫，通過(guò)TLC用對(duì)茴香醛碳化來(lái)監(jiān)測(cè)；在EtOAc/己烷(1∶1)中化合物1.14的Rf＝0.3并且化合物1.13的Rf＝0.37]以獲得化合物1.14。表5闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表5實(shí)例33β-羥基雄甾烷-11,17-二酮乙酸酯(1.15)在0℃和惰性氣氛下將乙酸酐(16.6g,162.8mmol)添加至存于吡啶(150mL)中的化合物1.14(33.0g,108.55mmol)的溶液中。在環(huán)境溫度下將所得反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜。如TLC所顯示，在反應(yīng)完成后，在真空下去除吡啶和殘余乙酸酐。用乙酸乙酯(500mL)稀釋粗殘余物并且用水(3x150mL)、飽和鹽水溶液(100mL)洗滌并用MgSO4(75g)干燥。在真空下蒸發(fā)溶劑并且通過(guò)柱色譜[59(W)x800(L)mm，60-120目二氧化硅，150g]純化粗材料，其中用乙酸乙酯/己烷(1∶10)洗脫[每個(gè)溶離份25mL，10mL/min洗脫，通過(guò)TLC用對(duì)茴香醛碳化來(lái)監(jiān)測(cè)；在EtOAc/己烷(3∶7)中化合物1.15的Rf＝0.38并且化合物1.14的Rf＝0.1]以獲得呈無(wú)色固體形式的化合物1.15(19.0g，產(chǎn)率66.4％)。表6闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表6實(shí)例4(Z)-3β-羥基-5β-孕-17(20)-烯-11-酮乙酸酯(1.16)在1h內(nèi)于惰性氣氛和-5℃下將叔丁醇鉀(159.28mL，159.2mmol，存于THF中的1M溶液)逐滴添加至存于THF(150mL)中的乙基三苯基溴化鏻(61.16g,164.8mmol)的溶液中。使所得暗粉色反應(yīng)混合物升溫至10-15℃并且在相同溫度下另外攪拌1h。在-5℃下將存于THF(50mL)中的化合物55(19.0g,54.9mmol)的溶液緩慢引入上述魏悌希內(nèi)鎓鹽懸浮液中。將溶液另外攪拌10-20分鐘并且使反應(yīng)混合物緩慢升溫至環(huán)境溫度。繼續(xù)攪拌約3-4h。如TLC所顯示，在起始材料完全消失后，用飽和NH4Cl水溶液(75mL)使反應(yīng)混合物驟冷。用EtOAc(2x150mL)萃取水層并且用飽和鹽水溶液(100mL)洗滌經(jīng)合并有機(jī)萃取物并用MgSO4(75g)干燥。在真空下去除溶劑并且通過(guò)柱色譜[49(W)x600(L)mm,60-120目二氧化硅，300g]純化粗材料，其中用乙酸乙酯/己烷(1∶20)洗脫[每個(gè)溶離份25mL，10mL/min洗脫，通過(guò)TLC用對(duì)茴香醛碳化來(lái)監(jiān)測(cè)；在EtOAc/己烷(1∶6)中化合物1.16的Rf＝0.54并且化合物1.15的Rf＝0.06]以獲得呈無(wú)色粘稠液體形式的化合物1.16(15.5g，產(chǎn)率78.8％)，其在1-2天后于0℃下緩慢固化。表7闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表7實(shí)例5(E)-3β-羥基-5β-膽-16(17),22(23)-二烯-24-酸酯乙酸甲酯(1.17)在0℃下將丙炔酸甲酯(9.68g,114.95mmol)添加至存于CH2Cl2(220mL)中的化合物1.16(16.5g,46mmol)的溶液中。在惰性氣氛下使反應(yīng)混合物升溫至環(huán)境溫度并且將其攪拌1h。在0℃下將乙基二氯化鋁(17.5g,137.8mmol)逐滴引入上述混合物中并且使所得反應(yīng)物質(zhì)再次升溫至環(huán)境溫度并將其攪拌過(guò)夜。如TLC所顯示，在反應(yīng)完成后，用冰水混合物(100mL)使粗反應(yīng)混合物驟冷并且用EtOAc(3x150mL)萃取水層。用飽和鹽水溶液(100mL)洗滌經(jīng)合并有機(jī)層并且用MgSO4(50g)干燥。在真空下去除溶劑并且通過(guò)柱色譜[49(W)x600(L)mm,60-120目二氧化硅，300g]純化粗材料，其中用乙酸乙酯/己烷(1∶7)洗脫[每個(gè)溶離份15mL，10mL/min洗脫，通過(guò)TLC來(lái)監(jiān)測(cè)并且通過(guò)UV光(254nm)燈或?qū)钕闳┨蓟瘉?lái)檢測(cè)；在EtOAc/己烷(1∶6)中化合物1.17的Rf＝0.36并且化合物1.16的Rf＝0.54]以獲得呈無(wú)色半固體形式的化合物1.17(16g，產(chǎn)率79％)。表8闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表8實(shí)例63β-羥基-5β-膽烷-11-酮-24-酸酯乙酸甲酯(1.18)將10％Pd/C(2.9g,20wt％)添加至存于EtOAc(150mL)中的化合物1.17(14.5g,32.8mmol)的溶液中。在帕爾裝置(50psi)中將所得漿液氫化12h。如TLC[在EtOAc/己烷(1∶3)中化合物1.18的Rf＝0.43并且化合物1.17的Rf＝0.43；然而僅化合物1.17具有來(lái)自共軛酯發(fā)色團(tuán)的UV活性]，在起始材料完全消失后，通過(guò)小型硅藻土濾塞過(guò)濾粗反應(yīng)混合物并且在真空下去除溶劑以獲得呈無(wú)色固體形式的化合物1.18(14g，產(chǎn)率95.7％)。表9闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表9實(shí)例73β-羥基-5β-膽-9(11)-烯-24-酸酯乙酸甲酯(1.19)在催化量的AcOH(2.0mL)存在下將PtO2(5.0g,100wt％)添加至存于EtOAc(75mL)中的1.18(5.0g,11.2mmol)的溶液中。在帕爾裝置(70psi)中將所得漿液氫化約14-16h。在反應(yīng)完成后，通過(guò)小型硅藻土濾塞過(guò)濾粗混合物并且在真空下去除溶劑。不經(jīng)進(jìn)一步純化即將粗產(chǎn)物用于消除反應(yīng)中。在0℃下將SOCl2(1.98g,16.78mmol)逐滴引入存于吡啶(100mL)中的上述粗材料的溶液中。使所得反應(yīng)混合物升溫至環(huán)境溫度并且攪拌約1h。如TLC所顯示，在反應(yīng)完成后，在真空下去除吡啶。用乙酸乙酯(100mL)稀釋粗殘余物并且用水(2x50mL)、飽和鹽水溶液(100mL)洗滌并用MgSO4(40g)干燥。在真空下蒸發(fā)溶劑并且通過(guò)柱色譜[49(W)x600(L)mm,60-120目二氧化硅，120g]純化粗材料，其中用乙酸乙酯/己烷(1∶10)洗脫[每個(gè)溶離份10mL，5mL/min洗脫，通過(guò)TLC用對(duì)茴香醛的碳化反應(yīng)監(jiān)測(cè)，在EtOAc/己烷(1∶6)中化合物1.19的Rf＝0.51并且化合物1.18的Rf＝0.22]以獲得呈無(wú)色固體形式的化合物1.19(4.1g，產(chǎn)率85.4％)。表10闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表10實(shí)例83β-羥基-5β-膽-9(11)-烯-12-酮-24-酸酯乙酸甲酯(1.20)將CrO3(8.0g,100wt％,80.0mmol)添加至存于AcOH(150mL)中的化合物1.19(8.0g,18.6mmol)的溶液中。在60℃下將所得反應(yīng)混合物加熱約24-36h。前體完全消失后，在真空下蒸發(fā)乙酸，并且使粗材料溶解于二乙醚(400mL)中。用水(2x100mL)、飽和鹽水溶液(100mL)洗滌有機(jī)層并且用MgSO4(40g)干燥。在真空下去除溶劑并且通過(guò)柱色譜[49(W)x600(L)mm,60-120目二氧化硅，120g]純化粗材料，其中用乙酸乙酯/己烷(1∶5)洗脫[每個(gè)溶離份10mL，3mL/min洗脫，通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)并且用UV光(254nm)燈來(lái)檢測(cè)；在EtOAc/己烷(1∶4)中化合物1.20的Rf＝0.28并且化合物1.19的Rf＝0.61]以獲得呈無(wú)色固體形式的化合物1.20(5g，產(chǎn)率60.5％)。表11闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表11實(shí)例93β-羥基-5β-膽烷-12-酮-24-酸酯乙酸甲酯(1.21)將10％Pd/C(30mg,10wt％)添加至存于EtOAc(30mL)中的化合物1.20(300mg,0.675mmol)的溶液中。在帕爾裝置(50psi)中將所得漿液氫化約16h。通過(guò)TLC[在EtOAc/己烷(3∶7)中化合物1.21的Rf＝0.44并且化合物1.20的Rf＝0.44；然而僅化合物1.20具有來(lái)自其烯酮發(fā)色團(tuán)的UV活性；此外化合物1.20的碳化微弱但化合物1.21的碳化鮮明]顯示，在起始材料完全消失后，通過(guò)小型硅藻土濾塞過(guò)濾粗反應(yīng)混合物并且在真空下去除溶劑以獲得呈無(wú)色固體形式的化合物1.21(270mg，產(chǎn)率90％)。表12闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表12實(shí)例105β-膽-3,12-二酮-24-酸甲酯(1.22)將NaOH(73mg,1.8mmol)添加至存于MeOH(10mL)中的化合物2.1(270mg,0.6mmol)的溶液中。在環(huán)境溫度下將所得反應(yīng)混合物攪拌約2h。如TLC所顯示，在反應(yīng)完成后，在真空下去除MeOH并且用乙酸乙酯(20mL)稀釋粗產(chǎn)物。用飽和鹽水溶液(10mL)洗滌有機(jī)層并且用MgSO4(5.0g)干燥。在真空下去除溶劑，粗材料不經(jīng)純化即用于酯化反應(yīng)中。在0℃下將SOCl2(0.1mL,1.35mmol)逐滴添加至存于MeOH(10mL)中的上述粗材料的溶液中。在環(huán)境溫度下將所得反應(yīng)混合物攪拌約1h。反應(yīng)完成后，在真空下去除MeOH。用EtOAc(30mL)稀釋粗反應(yīng)混合物，并且用水(3x10mL)、飽和鹽水溶液(15mL)洗滌有機(jī)層并且用MgSO4(5g)干燥。在真空下蒸發(fā)溶劑并且不經(jīng)純化即將粗產(chǎn)物用于氧化反應(yīng)中。經(jīng)約5分鐘以3等份將PCC(1.0g,4.6mmol)引入存于CH2Cl2(25mL)中的所獲得酯的溶液中。在環(huán)境溫度下將所獲得反應(yīng)混合物攪拌約3-4h。如TLC所顯示，在反應(yīng)完成后，通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾粗反應(yīng)混合物。在真空下去除溶劑并且通過(guò)柱色譜[19(W)x400(L)mm,60-120目二氧化硅，45g]純化粗材料，其中用乙酸乙酯/己烷(1∶6)洗脫[每個(gè)溶離份10mL，5mL/min洗脫，通過(guò)TLC用對(duì)茴香醛的碳化反應(yīng)來(lái)監(jiān)測(cè)，在EtOAc/己烷(2∶3)中化合物1.22的Rf＝0.57并且化合物1.21的Rf＝0.71]以獲得呈無(wú)色固體形式的化合物1.22(170mg，產(chǎn)率70.8％)。表13闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表13實(shí)例11脫氧膽酸甲酯(1.22-酯)在惰性氣氛和環(huán)境溫度下將LiAlH(O-tBu)(332mg,1.3mmol,)逐滴引入存于THF(10mL)中的化合物1.22(150mg,0.37mmol)的溶液中。攪拌約4-5小時(shí)后，用HCl水溶液(2mL,1N)使反應(yīng)混合物驟冷并且用EtOAc(30mL)稀釋粗混合物，將其用水(15mL)、飽和鹽水溶液(10mL)洗滌并用MgSO4(3g)干燥。在真空下去除溶劑，并且通過(guò)柱色譜[29(W)x500(L)mm,230-400目二氧化硅，50g]純化粗物質(zhì)，其中用MeOH/CH2Cl2(1∶20)洗脫[每個(gè)溶離份5mL，3mL/min洗脫，通過(guò)TLC用對(duì)茴香醛碳化來(lái)監(jiān)測(cè)；在MeOH/CH2Cl2(1∶9)中化合物1.22-酯的Rf＝0.42并且化合物1.22的Rf＝0.85]以獲得呈無(wú)色固體形式的脫氧膽酸甲酯(化合物1.22-酯)(110mg，產(chǎn)率72.8％)。表14闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表14實(shí)例11脫氧膽酸將存于H2O(2.0mL)中的LiOH(23mg,0.55mmol)溶液添加至存于THF(4mL)中的1.22-酯(110mg,0.27mmol)的溶液中。在環(huán)境溫度下將所得反應(yīng)混合物攪拌約2-3h。通過(guò)TLC[在MeOH/CH2Cl2(1∶9)中化合物DCA的Rf＝0.35并且化合物1.22-酯的Rf＝0.42]顯示，在酯消失后，用乙酸乙酯稀釋粗反應(yīng)混合物(10mL)并且將其與飽和鹽水溶液一起研磨以獲得有機(jī)層的澄清分離物。用飽和NH4Cl溶液(10mL)洗滌有機(jī)層并且用MgSO4(3.0g)干燥。在真空下去除溶劑并且通過(guò)與甲苯(3x5mL)共沸來(lái)去除任何痕量的水以獲得呈無(wú)色固體形式的脫氧膽酸(DCA)(100mg，產(chǎn)率94.3％)。表15闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表15實(shí)例1至11中所述實(shí)例性制程的產(chǎn)物的產(chǎn)率闡述于表16中。表16：合成DCA制程的總產(chǎn)率實(shí)例129α-羥基-5β-雄甾烷-3,17-二酮(2)向存于DMF(150mL)中的9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮1(30.0g,99.3mol)的溶液中添加10％Pd/C(2.1g)并且在帕爾裝置(60psi)中將所得漿液氫化12h。如TLC所顯示，在起始材料完全消失后，通過(guò)小型墊過(guò)濾粗反應(yīng)混合物并且在真空下去除溶劑以提供無(wú)色固體(30.0g)。在0℃下使此固體與丙酮(90mL.)合并且將所得漿液攪拌1h。然后將其過(guò)濾，用冷(0℃)丙酮(30mL)洗滌，并且在相同過(guò)濾漏斗中于真空和室溫下干燥以獲得化合物2(26.0g,86％)。表17闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表17實(shí)例135β-雄甾-9(11)-烯-3,17-二酮(3)經(jīng)15分鐘于惰性氣氛和10℃下向存于DCM(520mL)中的化合物2(26.0g,85.4mmol)的溶液中添加濃硫酸(7.53g,76.8mmol)。使溫度升高至25℃并且將所得溶液攪拌2h。在此時(shí)如TLC所顯示，無(wú)任何起始材料殘余。通過(guò)添加10％NaHCO3水溶液(200mL)終止反應(yīng)。分離各層并且用DCM(2x100毫升)將水層萃取兩次。合并有機(jī)層并且依次用水(100mL)和飽和鹽水溶液(100mL)洗滌。然后用Na2SO4(75g)干燥有機(jī)相并過(guò)濾。在真空下蒸發(fā)濾液以提供呈灰白色固體形式的化合物3(23.0g,94％)。不經(jīng)進(jìn)一步純化即將此產(chǎn)物“原樣”用于下一步驟中。表18闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表18實(shí)例143α-羥基-5β-雄甾-9(11)-烯-17-酮(4)在惰性氣氛下將三叔丁氧基氫化鋁鋰(1.0M,84.4mL,84.4mmol)的THF溶液添加至存于THF(230mL)中的化合物3(23.0g,80.4mmol)的冷(-40℃)溶液中。將所得反應(yīng)混合物攪拌2h。如TLC所顯示，在此時(shí)確定反應(yīng)完成，并且通過(guò)添加1NHCL(200mL)和乙酸乙酯(230mL)的混合物使反應(yīng)混合物驟冷。分離所得二相混合物并且用乙酸乙酯(2x100mL)將水層萃取兩次。合并有機(jī)相并且依次用水(150mL)和飽和鹽水溶液(100mL)洗滌。然后用Na2SO4(75g)干燥有機(jī)相并過(guò)濾。在真空下蒸發(fā)濾液以提供呈灰白色固體形式的化合物4(23.0g)。不經(jīng)進(jìn)一步純化即將上述粗產(chǎn)物“原樣”用于下一步驟中。表19闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表19實(shí)例15(Z)-3α-羥基-5β-孕甾-9(11),17(20)-二烯(6)經(jīng)1h在25℃下將存于THF中的叔丁醇鉀溶液(1M,230mL,231mmol)逐滴添加至存于THF(150mL)中的乙基三苯基溴化鏻(88.7g,239mmol)的懸浮液中。在25℃下將所得暗紅色混合物另外攪拌1h。在25℃下將存于THF(230mL)中的化合物4(23.0g,79.7mmol)的溶液緩慢添加至紅色混合物中。將所得混合物攪拌3-4h，在此時(shí)通過(guò)TLC確定反應(yīng)已完成。通過(guò)添加飽和NH4Cl水溶液(75mL)來(lái)終止反應(yīng)。分離各相并且用EtOAc(3x150mL)將水層萃取三次。合并有機(jī)部分，用飽和鹽水溶液(100mL)洗滌，用Na2SO4(75g)干燥并過(guò)濾。在真空下濃縮濾液并且通過(guò)柱色譜[49mm(W)x600mm(L),60-120目二氧化硅，300g]純化粗固體，其中用乙酸乙酯/己烷(1∶9)洗脫。合并含產(chǎn)物溶離份并且將其濃縮，此提供呈白色固體形式的化合物6(19.1g,80.0％)。表20闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表20實(shí)例16(Z)-3α-乙酰氧基-5β-孕甾-9(11),17(20)-二烯(7a)使化合物6(19.0g,63mmol)溶于CH2Cl2(380mL)中。在25℃和氮?dú)夥障乱来翁砑尤野?17.6mL,126.6mmol)、DMAP(0.772g,6mmol)和乙酸酐(8.98mL,94mmol)。在25℃下將所得溶液攪拌2h，在此時(shí)通過(guò)TLC確定反應(yīng)已完成。通過(guò)添加冰水(100mL)來(lái)終止反應(yīng)并且分離各相。用DCM(3x150mL)將水層萃取三次。合并有機(jī)部分并且用飽和鹽水溶液(100mL)洗滌，用無(wú)水Na2SO4(50g)干燥并過(guò)濾。在真空下濃縮濾液以獲得呈灰白色固體形式的化合物7a(22.0g，產(chǎn)率95％)。表21闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表21實(shí)例17(E)-3α-乙酰氧基-5β-膽-9(11),16,22-三烯-24-酸甲酯(8a)在0℃和惰性氣氛下將乙基二氯化鋁(104.5mL，192mmol，1.8M存于甲苯中)添加至存于DCM(100mL)中的丙炔酸甲酯(13.58mL,153mmol)溶液中。將所得溶液攪拌15min然后添加化合物7a(22g,64.3mmol)。在0℃下另外攪拌20min后，使溫度升高至25℃并且另外保持18h。在此時(shí)通過(guò)TLC確定反應(yīng)已完成，并且將混合物傾倒入冷(0℃)水(200mL)中。分離各相并用DCM(150mL)萃取水層。合并有機(jī)層并且依次用水(200mL)和飽和鹽水溶液(100mL)洗滌。然后用無(wú)水Na2SO4(40g)干燥并過(guò)濾。在真空下濃縮濾液并且通過(guò)在甲醇(280mL)中漿化來(lái)純化所得固體以獲得呈白色固體形式的化合物8a(17.5g68％)。表22闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表22實(shí)例183α-乙酰氧基-5β-膽-9(11)-烯-24-酸甲酯(9a)向存于EtOAc(350mL)中的化合物8a(17.5g,41mmol)的溶液中添加PtO2(4.37g)，并且在帕爾裝置(70psi)中將所得漿液氫化14-16h。在此時(shí)通過(guò)TLC確定反應(yīng)已完成。通過(guò)小型硅藻土過(guò)濾混合物并且在真空下去除溶劑，此可獲得呈白色固體形式的化合物9a(17.0g,96.0％)。不經(jīng)進(jìn)一步純化即將上述產(chǎn)物用于下一步驟中。表23闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表23實(shí)例193α-乙酰氧基-5β-膽-9(11),16-二烯-24-酸甲酯(8b)在0℃和惰性氣氛下將乙基二氯化鋁(14.2mL，25mmol，1.8M存于甲苯中)添加至存于DCM(60mL)中的丙烯酸甲酯(1.89mL,20mmol)溶液中。將所得溶液攪拌15min然后添加化合物7a(3g,8.7mmol)。在0℃下另外攪拌20min后，使溫度升高至25℃并且在所述溫度下另外保持18h。在此時(shí)通過(guò)TLC確定反應(yīng)已完成，然后將混合物傾倒入冷(0℃)水(60mL)中。分離各相并用DCM(60mL)萃取水層。合并有機(jī)層并且依次用水(50mL)和飽和鹽水溶液(100mL)洗滌。然后用無(wú)水Na2SO4(5g)干燥并過(guò)濾。在真空下濃縮濾液，從而提供化合物8b(2.6g,70％)。表24闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表24實(shí)例203α-乙酰氧基-5β-膽-9(11)-烯-24-酸甲酯(9a)向存于EtOAc(60mL)中的化合物8a(3g,7mmol)的溶液中添加10％Pd/C(300mg,10％wt/wt)，并且在帕爾裝置(70psi)中將所得漿液氫化14-16h。在此時(shí)通過(guò)TLC(存于己烷中的10％乙酸乙酯)來(lái)確定反應(yīng)已完成。通過(guò)小型硅藻土過(guò)濾混合物并且在真空下去除溶劑，此可獲得呈白色固體形式的化合物9a(2.6g,86％)。表25闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表25實(shí)例213α-乙酰氧基-5β-膽-9(11)-烯-12-酮-24-酸甲酯(10a)將CrO3(17.0g,170mmol)添加至存于AcOH(270mL)中的化合物9a(17g,39.5mmol)的溶液中。在50℃下將所得混合物加熱24-36h。通過(guò)TLC所顯示，在起始材料完全消失后，在真空下蒸發(fā)溶劑并且將粗材料溶于乙酸乙酯(400mL)和水(200mL)中。分離兩相并且用水(2x100mL)將有機(jī)層洗滌兩次，然后用飽和鹽水溶液(100mL)洗滌一次。然后將有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4(40g)干燥并過(guò)濾。在真空下濃縮濾液并且通過(guò)柱色譜[49mm(W)x600mm(L),60-120目二氧化硅，120g]純化所得固體，其中用乙酸乙酯/己烷(1∶5)洗脫[每個(gè)溶離份10mL，3mL/min洗脫，通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)并且用UV光(254nm)燈來(lái)檢測(cè)]。合并含產(chǎn)物溶離份并且在真空下將其濃縮以獲得呈白色固體形式的化合物10a(8.8g，產(chǎn)率50％)。表26闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表26實(shí)例223α-乙酰氧基-5β-膽烷-12-酮-24-酸甲酯(11a)將10％Pd/C(900mg)添加至存于EtOAc(150mL)中的化合物10a(2.0g,4.5mmol)的溶液中并且于50℃下在帕爾裝置(50psi)內(nèi)將所得漿液氫化16h。在此時(shí)通過(guò)TLC確定反應(yīng)已完成。通過(guò)小型硅藻土過(guò)濾混合物并且在真空下去除溶劑，此可提供呈白色固體形式的化合物11a(1.6g，產(chǎn)率80％)。表27闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表27實(shí)例233α-乙酰氧基-12α-羥基-5β-膽烷-24-酸甲酯(12a)在環(huán)境溫度下將三叔丁氧基氫化鋁鋰(1M,22.4mL,22.4mmol)的THF溶液逐滴添加至存于THF(25mL)中的化合物11a(2.5g,5.6mmol)的溶液中。另外攪拌4-5h后，通過(guò)TLC來(lái)確定反應(yīng)已完成。通過(guò)添加HCL(1M,10mL)水溶液來(lái)終止反應(yīng)并且用EtOAc(30mL)稀釋混合物。分離各相并且依次用水(15mL)和飽和鹽水溶液(10mL)洗滌有機(jī)相。然后將有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4(3g)干燥并過(guò)濾。在真空下濃縮濾液并且通過(guò)柱色譜[29mm(W)x500mm(L),60-120目二氧化硅，50g]純化所得固體，其中用EtOAc/己烷(2∶8)洗脫[每個(gè)溶離份5mL，通過(guò)TLC用對(duì)茴香醛碳化來(lái)監(jiān)測(cè)]。合并含產(chǎn)物溶離份并且將其在真空下濃縮以獲得呈白色固體形式的化合物12a(2.3g,91％)。表28闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表28實(shí)例24脫氧膽酸(DCA)將存于H2O(2.0mL)中的LiOH(187mg,4.4mmol)的溶液添加至存于THF(8mL)和MeOH(8mL)中的化合物12a(500mg,1.11mmol)的溶液中。在50℃下將所得混合物攪拌3-4h。通過(guò)TLC所顯示，在起始材料完全消失后，在真空下濃縮反應(yīng)混合物。合并水(10mL)與3NHCL(1mL)的混合物并且將其冷卻至0℃，然后將其添加至粗產(chǎn)物中。在0℃下攪拌1h后，過(guò)濾所沉淀固體然后用水(10mL)和己烷(20mL)洗滌。在真空和室溫下干燥獲得呈白色固體形式的脫氧膽酸(DCA，400mg，產(chǎn)率91％)。表29闡述產(chǎn)物的所測(cè)得特性。表29實(shí)例25將原代人脂細(xì)胞與不同濃度的使用9-HAD作為起始材料來(lái)合成的合成脫氧膽酸鈉或如下所述自西格瑪獲得的牛源脫氧膽酸鈉一起培養(yǎng)。材料脂細(xì)胞(森生物公司(Zen-Bio)cat號(hào)SA-1096)96孔板(US科學(xué)(USScientific)cat號(hào)施樂(lè)士達(dá)(cellstar)第655180號(hào))無(wú)血清RPMI培養(yǎng)基(聯(lián)發(fā)科(Mediatech)cat號(hào)17-105-CV)脫氧膽酸鈉(DC)(西格瑪cat號(hào)D6750)合成去氧甘膽酸鈉(歇拉島(Kythera))PBS(1x)MTS分析試劑盒(普洛麥格(Promega)cat號(hào)G3580)脂細(xì)胞到達(dá)分化階段并且以13,000細(xì)胞/孔的密度存于96孔板中。獲得兩個(gè)板并且用相同樣品處理每個(gè)板。在37℃下將細(xì)胞與5％CO2一起培養(yǎng)24小時(shí)。通過(guò)將20mg膽汁酸溶于2mL培養(yǎng)基(無(wú)血清)中來(lái)制備每種膽汁酸(合成和非合成DCA)的1％儲(chǔ)備溶液。使用1％儲(chǔ)備溶液通過(guò)稀釋來(lái)制備以下11種溶液：0.005％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.05％、0.06％、和0.1％、以及0％(僅培養(yǎng)基)。在室溫下用150μL1xPBS(磷酸緩沖鹽溶液)將細(xì)胞洗滌2x。通過(guò)將板上側(cè)翻轉(zhuǎn)并且將液體倒入容器中而自96孔板的孔中依次去除培養(yǎng)基和PBS。在最后一次PBS洗滌后，每孔添加80μL樣品。將每種濃度的特定膽汁酸添加至8個(gè)孔中并且在37℃下與5％CO2一起培養(yǎng)1小時(shí)。然后將板自培養(yǎng)器中移出并且倒出溶液。將100μLMTS試劑(3-(4,5-二乙基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓，內(nèi)鹽)的稀溶液(1mLRPMI中的40μL)直接添加至各孔中。在37℃下將板與5％CO2一起培養(yǎng)直至對(duì)照(無(wú)膽汁酸)孔變色為橙-棕色，然后將其裝載至分析96孔板的分光光度計(jì)上。樣品是在490nm波長(zhǎng)設(shè)定下運(yùn)行。使用來(lái)自普洛麥格的比色分析(MTS)試劑盒來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞生存力。結(jié)果展示經(jīng)合成NaDC或西格瑪-NaDC處理后細(xì)胞存活率的劑量依賴性降低(參見(jiàn)圖2)。在此實(shí)驗(yàn)中兩種分子都表現(xiàn)類似的溶胞行為，此表明合成NaDC和牛源西格瑪-NaDC在其殺滅脂肪細(xì)胞的能力上具有相同功能。上述實(shí)驗(yàn)和實(shí)例并非意欲限制本發(fā)明。應(yīng)理解根據(jù)本發(fā)明原則可作出許多修改和變化。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3