本發(fā)明涉及了一種質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，尤其是涉及了一種家蠶中部絲腺生物反應(yīng)器雙啟動(dòng)子通用型質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

piggyBac轉(zhuǎn)座子最初是從粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)TN-368細(xì)胞株的基因組中分離得到的，是目前發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座活性最高的DNA轉(zhuǎn)座子。piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)是一種非病毒載體，轉(zhuǎn)座效率較高。與sleeping beauty相比，piggyBac載體容量較大，可攜帶18kb,可以實(shí)現(xiàn)多基因的共表達(dá)，且轉(zhuǎn)座片段被切除后不會(huì)在原位點(diǎn)留下印跡(footprint)，基因組可以實(shí)現(xiàn)切除后精確修復(fù)，在可逆轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用中具有重要作用。

piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺生物反應(yīng)器的研究開(kāi)展了十幾年，世界各國(guó)的科學(xué)家致力于外源基因的表達(dá)，已經(jīng)建成了以絲素蛋白輕鏈啟動(dòng)子(Fib-L Promoter)、絲素蛋白重鏈啟動(dòng)子(Fib-H Promoter)和絲膠蛋白1啟動(dòng)子(Ser1Promoter)表達(dá)外源蛋白的轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺生物反應(yīng)器。

由于piggyBac載體多數(shù)含有兩個(gè)表達(dá)框，具有較多的元件和相同的酶切位點(diǎn)，所以，每次表達(dá)不同的外源基因時(shí)，需要從頭構(gòu)建質(zhì)粒，組裝啟動(dòng)子、信號(hào)肽、外源基因、polyA等結(jié)構(gòu)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，工作效率低下。

另一方面，但縱觀十幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外家蠶生物反應(yīng)器的研究結(jié)果，轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺生物反應(yīng)器的外源蛋白表達(dá)效率都很低，不管是絲膠啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的外源基因，還是絲素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的外源基因，極大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的表達(dá)量都沒(méi)有在達(dá)到繭層量的1％左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到科學(xué)家們期望的象表達(dá)蠶絲蛋白那樣的高效表達(dá)水平。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決背景技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提出了一種家蠶中部絲腺生物反應(yīng)器雙啟動(dòng)子通用型質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，具體是利用常規(guī)構(gòu)建質(zhì)粒的生物技術(shù)方法構(gòu)建一種不含目的基因，但擁有其它所有必需元件的通用型質(zhì)粒。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案的步驟如下：

一、一種家蠶中部絲腺生物反應(yīng)器雙啟動(dòng)子通用型質(zhì)粒：

所述的質(zhì)粒為pBac[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-18s rRNA-promoter-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA]，是以piggyBac轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)并帶有Amp抗性基因，包括piggyBac轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)轉(zhuǎn)座臂PBL和PBR，以及兩個(gè)轉(zhuǎn)座臂之間的兩個(gè)功能表達(dá)框。

一個(gè)功能表達(dá)框是A3啟動(dòng)子啟動(dòng)的綠色熒光蛋白基因表達(dá)框，即A3Promoter–EGFP-SV40，另一個(gè)功能表達(dá)框是包含家蠶絲膠蛋白1基因啟動(dòng)子、18s rRNA啟動(dòng)子、絲素蛋白輕鏈基因信號(hào)肽、六聚組氨酸、腸激酶酶切位點(diǎn)和家蠶絲素蛋白輕鏈基因3’末端序列的表達(dá)框，即Ser1Promoter-18s rRNA promoter-Fibroin L chain signal peptide-His6-DDDDK-Fibroin L chain PolyA。

所述的DDDDK-FLPA之間含有專(zhuān)一性的ApaI和NheI的兩個(gè)酶切位點(diǎn)，兩個(gè)酶切位點(diǎn)用于將質(zhì)粒特異性切開(kāi)連接外源基因后形成有功能的質(zhì)粒。

二、一種家蠶中部絲腺生物反應(yīng)器雙啟動(dòng)子通用型質(zhì)粒的構(gòu)建方法，該方法的步驟如下：

1)通過(guò)分子生物學(xué)方法構(gòu)建包含[絲膠蛋白1基因啟動(dòng)子575-海腎螢光素酶基因-SV40]-[絲膠蛋白1基因啟動(dòng)子4023-螢火蟲(chóng)螢光素酶基因-SV40]-[A3基因啟動(dòng)子-EGFP-SV40]([Ser 575-Rluc-SV40]-[Ser 4023-Fluc-SV40]-[A3-GFP-SV40])的質(zhì)粒piggy-14413，以質(zhì)粒piggy-14413為模板，質(zhì)粒piggy-14413的堿基序列如SEQ ID NO.1，以如SEQ ID NO.2的ggtaccGTTGGCGGTCTTTGGATCG序列1和如SEQ ID NO.3的gaattccttaagGCACACACACTACATACCATGTATTTG序列2為引物，采用PCR擴(kuò)增獲得片段長(zhǎng)為583bp的絲膠基因啟動(dòng)子，其堿基序列如SEQ ID NO.4；

2)用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切質(zhì)粒piggy-5257，質(zhì)粒piggy-5257的堿基序列如SEQ ID NO.5，得到長(zhǎng)度為4549bp，包含18s rRNA基因啟動(dòng)子-絲素輕鏈蛋白信號(hào)肽-六聚組氨酸-腸激酶酶切位點(diǎn)序列-家蠶絲素蛋白輕鏈3’序列(18s rRNA-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)和Amp抗性基因的片段；

連接步驟1)獲得的絲膠蛋白1基因啟動(dòng)子與包含18s rRNA基因啟動(dòng)子-絲素輕鏈蛋白信號(hào)肽-六聚組氨酸-腸激酶酶切位點(diǎn)序列-家蠶絲素蛋白輕鏈3’序列和Amp抗性基因的片段，得到包含絲膠蛋白1基因啟動(dòng)子-18s rRNA基因啟動(dòng)子-絲素輕鏈蛋白信號(hào)肽-六聚組氨酸-腸激酶酶切位點(diǎn)序列-家蠶絲素蛋白輕鏈3’序列(Ser 1-18s rRNA-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)的質(zhì)粒piggy-5140；

3)用AflII和BglII、ScaI酶切步驟2)獲得的piggy-5140質(zhì)粒，得到長(zhǎng)度為2493bp的包含絲膠蛋白1基因啟動(dòng)子-18s rRNA基因啟動(dòng)子-絲素輕鏈蛋白信號(hào)肽-六聚組氨酸-腸激酶酶切位點(diǎn)序列-家蠶絲素蛋白輕鏈3’序列 (Ser1-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)的片段；

4)用AflII和BglII雙酶切包含A3基因啟動(dòng)子-綠色熒光蛋白基因-SV40(A3-GFP-SV40)和Amp抗性基因的質(zhì)粒piggy-6212，質(zhì)粒piggy-6212的堿基序列如SEQ ID NO.6，得到長(zhǎng)度為5870bp的包含A3基因啟動(dòng)子-綠色熒光蛋白基因-SV40(A3-GFP-SV40)的片段；

5)連接步驟3)獲得的包含絲膠蛋白1基因啟動(dòng)子-18s rRNA基因啟動(dòng)子-絲素輕鏈蛋白信號(hào)肽-六聚組氨酸-腸激酶酶切位點(diǎn)序列-家蠶絲素蛋白輕鏈3’序列的片段與步驟4)獲得的包含A3基因啟動(dòng)子-EGFP-SV40的片段，得到包含A3基因啟動(dòng)子-EGFP-SV40-絲膠基因啟動(dòng)子-18s rRNA基因啟動(dòng)子-絲素輕鏈蛋白信號(hào)肽-六聚組氨酸-腸激酶酶切位點(diǎn)序列-家蠶絲素蛋白輕鏈3’序列([A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-18s rRNA-promoter-FLSP-His6-DDDDK-FLPA])的家蠶中部絲腺生物反應(yīng)器雙啟動(dòng)子通用型質(zhì)粒piggy-8363質(zhì)粒作為本發(fā)明所述的質(zhì)粒，其堿基序列如SEQ ID NO.7。

三、所述質(zhì)粒用于構(gòu)建表達(dá)各種外源基因的donor質(zhì)粒的應(yīng)用。

本發(fā)明先設(shè)計(jì)引物，用PCR的方法獲得獲得絲膠蛋白1基因啟動(dòng)子的序列；再分別用限制性?xún)?nèi)切酶酶切相應(yīng)的片段，電泳得到目的條帶后，切膠回收，用T4連接酶將相應(yīng)的片段相連，使所需的元件(Ser Promoter-18s rRNA promoter-Fibroin L chain signal peptide-His6-DDDDK-Fibroin L chain PolyA)依次連接；然后將標(biāo)記基因與上述元件整合到同一個(gè)質(zhì)粒，得到含有雙啟動(dòng)子的通用型質(zhì)粒，最終如圖1所示。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明質(zhì)?？蓪?duì)于任意一種外源基因，只需經(jīng)一步酶切連接反應(yīng)，就將任何一種外源基因?qū)胭|(zhì)粒，構(gòu)建成有功能的能夠表達(dá)外源基因的質(zhì)粒，且可以利用雙啟動(dòng)子啟動(dòng)外源基因表達(dá)，旨在提高外源基因的表達(dá)量。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明Ser1和18s rRNA雙啟動(dòng)子通用型質(zhì)粒的組成示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

本發(fā)明的實(shí)施例如下：

(1)設(shè)計(jì)引物，以piggy-14413質(zhì)粒(SEQ ID NO.1)為模板，獲得絲膠蛋白1基因啟動(dòng)子(SEQ ID NO.4)。并在啟動(dòng)子5’端加EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)，在3’端加KpnI的酶切位點(diǎn)。用EcoRⅠ和KpnI雙酶切PCR產(chǎn)物，得到593bp的片段，即絲膠蛋白1基因啟動(dòng)子，然后膠回收；用EcoRⅠ和KpnI雙酶切piggy-5257 質(zhì)粒(SEQ ID NO.5)，得到4549bp的片段，膠回收；將所得到的2個(gè)片段連接，連接后的質(zhì)粒命名為piggy-5140質(zhì)粒。

(2)用AflII和BglII、ScaI酶切piggy-5140質(zhì)粒，得到長(zhǎng)度為2493bp的片段；用AflII和BglII雙酶切piggy-6212質(zhì)粒(SEQ ID NO.6)，得到長(zhǎng)度為5870bp的片段，連接上述兩目的片段，得到piggy-8363質(zhì)粒(SEQ ID NO.7)，即家蠶中部絲腺生物反應(yīng)器雙啟動(dòng)子通用型質(zhì)粒。

(3)用ApaI和NheI雙酶切piggy-8363質(zhì)粒，得到長(zhǎng)度為8361bp的包含[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-18s rRNA promoter-FLSP-His6-DDDDK-FLPA和Amp抗性基因的基因序列。將上游端帶有ApaI酶切粘性末端序列、下游端帶有NheI酶切粘性末端序列的T4連接酶基因與上述片段連接，構(gòu)建成家蠶中部絲腺生物反應(yīng)器表達(dá)T4連接酶基因的質(zhì)粒piggy-9887，該質(zhì)粒包含的表達(dá)框序列為[A3-EGFP-SV40]-[Ser1promoter-18s rRNA promoter-FLSP-His6-DDDDK-T4Ligase-FLPA]。

上述結(jié)果說(shuō)明，利用家蠶中部絲腺生物反應(yīng)器雙啟動(dòng)子通用型質(zhì)粒piggy-8363，僅僅一步就能夠得到在家蠶中部絲腺表達(dá)T4連接酶基因的質(zhì)粒。

采用轉(zhuǎn)基因家蠶技術(shù)將該雙啟動(dòng)子質(zhì)粒導(dǎo)入家蠶基因組，獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶的T4連接酶基因表達(dá)量，比用單個(gè)絲膠蛋白1啟動(dòng)子啟動(dòng)的T4連接酶基因表達(dá)量高1.2倍，結(jié)果差異達(dá)到顯著水平。

說(shuō)明利用本發(fā)明的家蠶中部絲腺生物反應(yīng)器雙啟動(dòng)子通用型質(zhì)粒構(gòu)建轉(zhuǎn)基因家蠶的donor質(zhì)粒，操作程序簡(jiǎn)單，工作效率高，而且外源基因的表達(dá)量也有顯著提高。