本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種多肽化合物分子，及該化合物的制備方法與其在制備用于提升動(dòng)物機(jī)體的免疫能力及對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答能力的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：生物體的遺傳基因被存儲(chǔ)在多聚脫氧核苷酸鏈上，遺傳基因編碼著執(zhí)行生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)多種多樣，它們行使著各種生物學(xué)功能維持生命活動(dòng)。蛋白質(zhì)的種類雖然多不勝舉，但它們基本上都是由20個(gè)自然界存在的天然氨基酸組成。由于氨基酸的組成和排列順序的差異導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的千差萬別。一般來說，含有50個(gè)以上氨基酸的分子被稱為蛋白質(zhì)，一般超過10個(gè)氨基酸的肽鏈被稱為多肽，少于10個(gè)氨基酸的肽鏈被稱做寡肽。目前發(fā)現(xiàn)最小的功能小肽只有2個(gè)氨基酸，通常較為常見的是由4個(gè)以上氨基酸組成的功能肽段。由于人類基因組計(jì)劃的完成和人類蛋白組計(jì)劃的開展，將會(huì)有越來越多的蛋白質(zhì)功能片段被發(fā)現(xiàn)并被作為藥物應(yīng)用到生物醫(yī)藥領(lǐng)域中來。蛋白質(zhì)的功能片段通常是指被發(fā)現(xiàn)具備某種特定生物學(xué)功能的天然多肽片段，它們通常是幾十個(gè)至兩個(gè)氨基酸組成的肽類片段，被鑒定和發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)功能片段可通過人工合成的途徑制備?，F(xiàn)已開發(fā)并在臨床上得到應(yīng)用的多肽藥物有“催產(chǎn)素”、“胸腺肽α1”、“胸腺五肽”等，有在天然肽鏈的基礎(chǔ)上進(jìn)行人工改構(gòu)制備成為用于治療消化道出血和肢端肥大癥的多肽藥物“奧曲肽”和抗凝血作用的“水蛭肽”等。蛋白質(zhì)中的功能片段常常能篩選到含有幾十個(gè)或小到只有二個(gè)氨基酸組成的多肽片段，它們?yōu)槿斯ず铣啥嚯墓δ芷尾⑺鼈兺度霊?yīng)用奠定了基礎(chǔ)。在蛋白質(zhì)、多肽或寡肽中，單一氨基酸的缺失、增加或被替換；氨基端(N端)或羧基端(C端)被封閉；序列中或游離端被添加化學(xué)基團(tuán)都會(huì)使得蛋白質(zhì)、多肽或寡肽原有的生物學(xué)活性發(fā)生改變。設(shè)計(jì)、篩選和發(fā)現(xiàn)具有新的功能肽段或?qū)ふ腋咝щ亩问撬幬镩_發(fā)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，一方面，提供一種多分支的多肽化合物，其結(jié)構(gòu)式為：(XAXBXCXDXE-X)2KY，或{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY，或{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY；其中，XA為極性氨基酸分子，XB和XE為堿性氨基酸分子(可相同也可不相同)，XC和XD為非極性氨基酸分子(可相同也可不相同)，K為賴氨酸(Lys,K)，X和Y為空或任意一個(gè)或多個(gè)氨基酸或化學(xué)基團(tuán)。(XAXBXCXDXE-X)2KY結(jié)構(gòu)見式4：{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY結(jié)構(gòu)見式5：{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY結(jié)構(gòu)見式6：X和Y為空、或任意一種氨基酸，或任意個(gè)氨基酸組成的肽片段，或能將氨基酸或肽片段連接起來的化學(xué)基團(tuán)，X和Y可相同，可不同；例如X為空，Y為甘氨酸(Gly，G)。XA選自極性氨基酸，可為半胱氨酸(Cys，C)、甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬酰胺(Asn，N)或谷氨酰胺(Gln，Q)；優(yōu)選半胱氨酸(Cys，C)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬酰胺(Asn，N)或谷氨酰胺(Gln，Q)；更優(yōu)選半胱氨酸(Cys，C)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)或谷氨酰胺(Gln，Q)。XB和XE選自堿性氨基酸，可分別為精氨酸(Arg，R)、賴氨酸(Lys，K)或組氨酸(His,H)，可相同或不同；XB優(yōu)選精氨酸(Arg，R)或賴氨酸(Lys，K)。XC和XD選自非極性氨基酸，可分別為丙氨酸(Ala，A)、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、脯氨酸(Pro，P)、苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))、色氨酸(Trp，W)或蛋氨酸(Met，M)，可相同或不同；XC優(yōu)選丙氨酸(Ala，A)、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、脯氨酸(Pro，P)、苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))或色氨酸(Trp，W)，更優(yōu)選丙氨酸(Ala，A)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)或脯氨酸(Pro，P)；XD優(yōu)選亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)或脯氨酸(Pro，P)。本發(fā)明還包括在所述多肽化合物基礎(chǔ)之上通過化學(xué)修飾、改造而產(chǎn)生的衍生物，如：所述多肽化合物與有機(jī)酸或無機(jī)酸形成的鹽類化合物；所述的多肽化合物所帶有的羥基可形成但不限于所形成的醚、酯、苷或甙等的化合物；所述的多肽化合物所帶有的巰基可形成但不限于所形成的硫醚、硫苷，或與半胱氨酸或含半胱氨酸的肽所形成的含有二硫鍵的化合物；所述的多肽化合物所帶有的氨基可形成但不限于所形成的酰化物、烴化物、與糖類物質(zhì)所形成的苷類物質(zhì)等；所述的多肽化合物所帶有的羧基可形成但不限于所形成的酯、酰胺類化合物等；所述的多肽化合物所帶有的亞氨基可形成但不限于所形成的苷、?；铩N化物等；所述的多肽化合物所帶有的酚羥基可形成但不限于所形成的酯、醚、苷、甙類化合物，與有機(jī)堿或無機(jī)堿所形成的鹽類化合物；所述的多肽化合物與金屬離子所形成的配合物、絡(luò)和物或螯合物；所述的多肽化合物所形成的水合物或溶劑物。第二方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其含有上述的多肽化合物、其幾何異構(gòu)體、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化合物以及可藥用載體或賦形劑的藥物組合物。第三方面，本發(fā)明提供制備上述多肽化合物的方法，(XAXBXCXDXE-X)2KY合成路線見式1，先把Y固定在WANG固相樹脂上，再通過縮合連接賴氨酸(Lys,K)；進(jìn)而在KY中K的兩個(gè)氨基末端與兩個(gè)XAXBXCXDXE-X片段連接，形成兩分支肽(XAXBXCXDXE-X)2KY-WANG固相樹脂，可以先合成好XAXBXCXDXE-X片段，再與WANG固相樹脂-YK縮合，或者在WANG固相樹脂-YK的基礎(chǔ)上依次連接X、XE、XD、XC、XB、XA；最后將二分支肽從WANG固相樹脂上裂解下來，得到二拷貝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物(XAXBXCXDXE-X)2KY。{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY合成路線見式2，先把Y固定在WANG固相樹脂上，再通過縮合連接賴氨酸(Lys,K)，形成KY-WANG固相樹脂；再在KY中K的兩個(gè)氨基末端與另外兩個(gè)賴氨酸K的羧基端通過縮合連接，形成兩分支骨架K2KY-WANG固相樹脂；進(jìn)而在“K2”的每個(gè)賴氨酸K的兩個(gè)氨基末端通過縮合連接XAXBXCXDXE-X，形成四分支肽{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY-WANG固相樹脂；最后將四分支肽從WANG固相樹脂上裂解下來，得到四拷貝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY。{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY合成路線見式3，先把Y固定在WANG固相樹脂上，再通過縮合連接賴氨酸(Lys,K)，形成KY-WANG固相樹脂；再在KY中K的兩個(gè)氨基末端與另外兩個(gè)賴氨酸K的羧基端通過縮合連接，形成兩分支骨架K2KY-WANG固相樹脂；再在K2KY-WANG固相樹脂中“K2”的每個(gè)K的兩個(gè)氨基末端與另外兩個(gè)賴氨酸K的羧基端通過縮合連接，形成四分支骨架K4K2KY-WANG固相樹脂；進(jìn)而在“K4”的每個(gè)賴氨酸K的兩個(gè)氨基末端通過縮合連接XAXBXCXDXE-X，形成八分支肽{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY-WANG固相樹脂；最后將八分支肽從WANG固相樹脂上裂解下來，得到八拷貝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY。在將K的羧基端與Y-WANG固相樹脂縮合前，需要先將K的兩個(gè)氨基保護(hù)起來，優(yōu)選叔丁氧羰基(Boc)保護(hù)法和芴甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)法。所述另外兩個(gè)賴氨酸的羧基與KY中K的兩個(gè)氨基縮合前，先將該每個(gè)賴氨酸的兩個(gè)氨基保護(hù)起來；XAXBXCXDXE-X的羧基與該每個(gè)賴氨酸的氨基縮合前，先將XAXBXCXDXE-X中的氨基保護(hù)起來；保護(hù)方法優(yōu)選叔丁氧羰基(Boc)保護(hù)法和芴甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)法。具體步驟為：步驟一：用Fmoc保護(hù)法將賴氨酸K中的兩個(gè)氨基保護(hù)起來；步驟二：用多肽自動(dòng)合成儀，將KY固定在WANG固相樹脂上，連接順序?yàn)椋篧ANG固相樹脂-YK；制備二拷貝的多肽化合物時(shí)，在KY的賴氨酸活化后的兩個(gè)氨基端上繼續(xù)縮合連接另外兩個(gè)XAXBXCXDXE-X，得到固定在WANG固相樹脂上的二拷貝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物(XAXBXCXDXE-X)2KY；或在KY的賴氨酸活化后的兩個(gè)氨基端上繼續(xù)縮合連接另外兩個(gè)賴氨酸K，且該每個(gè)賴氨酸K上的兩個(gè)氨基已被Fmoc保護(hù)，制備得到兩分支骨架K2KY-WANG固相樹脂；制備四拷貝的多肽化合物時(shí)，在兩分支骨架“K2”的每個(gè)賴氨酸K活化后的兩個(gè)氨基末端繼續(xù)進(jìn)行兩個(gè)XAXBXCXDXE-X的縮合，得到固定在WANG固相樹脂上的四拷貝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY；或在兩分支骨架“K2”的每個(gè)賴氨酸K活化后的兩個(gè)氨基末端繼續(xù)進(jìn)行兩個(gè)賴氨酸K的縮合，該每個(gè)賴氨酸K上的兩個(gè)氨基已被Fmoc保護(hù)，制備得到四分支骨架K4K2KY-WANG固相樹脂；制備八拷貝的多肽化合物時(shí)，在四分支骨架“K4”的每個(gè)賴氨酸K活化后的兩個(gè)氨基末端繼續(xù)進(jìn)行兩個(gè)XAXBXCXDXE-X的縮合，得到固定在WANG固相樹脂上的八拷貝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY；最后用TFA法將目的多肽化合物從WANG固相樹脂裂解下來，得到多肽化合物粗品；步驟三：用色譜柱(型號(hào)為DaisoC18，10μm,50x250mm)純化多肽化合物粗品，流動(dòng)相A為(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流動(dòng)相B為90％乙腈/水，流速為每分鐘25毫升，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220納米；收集流出峰溶液，再經(jīng)過冷凍干燥，得到呈白色絮狀的多肽化合物。第四方面，本發(fā)明提供上述多肽化合物或上述方法制備得到的多肽化合物在制備人或動(dòng)物用免疫藥物或增強(qiáng)免疫功能藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的多肽化合物將多拷貝的三類(三類為極性氨基酸分子、堿性氨基酸分子和非極性氨基酸分子)、共五個(gè)氨基酸分子共價(jià)連接，形成分支狀的多肽化合物。該多肽化合物有望成為多種藥物的有效成分，在制備預(yù)防、治療多種病癥的藥物用都會(huì)有所應(yīng)用，特別是在制備增強(qiáng)免疫能力藥物中會(huì)廣泛應(yīng)用，還可以作為分子示蹤劑使用，抑制血管新生的使用。本發(fā)明闡述的多肽化合物由于是非天然分子結(jié)構(gòu)，對(duì)生理環(huán)境下的降解酶不敏感，因此能有效延長(zhǎng)該多肽化合物在生物體內(nèi)的作用半衰期，使其生物學(xué)作用在體內(nèi)更加持久。具體實(shí)施方式本發(fā)明設(shè)計(jì)和制備出一種含有多拷貝XAXBXCXDXE-X的分支狀多肽分子(XAXBXCXDXE-X)2KY，或{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY，或{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY，其中，XA為極性氨基酸分子，為半胱氨酸(Cys，C)、甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬酰胺(Asn，N)或谷氨酰胺(Gln，Q)；XB和XE為堿性氨基酸分子(可相同也可不相同)，為精氨酸(Arg，R)、賴氨酸(Lys，K)或組氨酸(His,H)中的一種或兩種，可相同可不同；XC和XD為非極性氨基酸分子(可相同也可不相同)，為丙氨酸(Ala，A)、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、脯氨酸(Pro，P)、苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))、色氨酸(Trp，W)或蛋氨酸(Met，M)中的一種或兩種，可相同可不同；K為含有兩個(gè)活性氨基的賴氨酸FmocLys-(Fmoc)-OH，X和Y為空或任意一個(gè)氨基酸或任意多個(gè)氨基酸組成的肽片段或能將氨基酸、肽片段連接起來的化學(xué)基團(tuán)。本發(fā)明的多肽化合物通過變化XA、XB、XC、XD、XE的種類用以適應(yīng)治療多種疾病，尤其是提高人或動(dòng)物機(jī)體的體液免疫及細(xì)胞免疫能力，從而開發(fā)出一種可在臨床應(yīng)用(人用或動(dòng)物用)涉及增強(qiáng)免疫功能的藥物。1963年美國科學(xué)家R.B.Merrifield發(fā)明創(chuàng)立了將目的肽的氨基酸的羧基端(C端)固定在不溶性樹脂上，樹脂上結(jié)合的氨基酸的氨基端(N端)與有待連接的氨基酸的羧基端進(jìn)行縮合反應(yīng)達(dá)到延長(zhǎng)肽鏈的固相合成法；也就是從多肽的羧基端(C端)開始逐個(gè)氨基酸縮合并向多肽段的氨基端(N端)方向不斷延伸。因此，在進(jìn)行氨基酸的縮合反應(yīng)時(shí)，要將有待連接的氨基酸上的氨基及側(cè)鏈基團(tuán)保護(hù)起來避免發(fā)生反應(yīng)。目前常用的有叔丁氧羰基(Boc)保護(hù)法和芴甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)法，因此每連接上一個(gè)氨基酸就要經(jīng)歷一次脫保護(hù)的過程(即固相載體上的氨基先脫保護(hù)，再同過量的有待連接的下一個(gè)目標(biāo)氨基酸的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)以延長(zhǎng)肽鏈)。通過這樣的步驟反復(fù)多次地進(jìn)行下去，即：縮合、洗滌、脫保護(hù)、中和、洗滌，再進(jìn)入下一輪縮合(連接目標(biāo)氨基酸)，直至達(dá)到所需要合成的目標(biāo)肽鏈長(zhǎng)度。合成完成后采用TFA法將目的多肽從樹脂上裂解下來，得到目的肽的粗品。純化過程如下：一般情況下，合成直鏈多肽時(shí)，使用的是帶有一個(gè)活性氨基的賴氨酸(Lys，K)Fmoc-Lys(Boc)-OH，其側(cè)鏈的氨基被BOC-OH保護(hù)不參與縮合反應(yīng)。因此賴氨酸(Lys，K)中只有一個(gè)氨基可以發(fā)生縮合反應(yīng)，氨基酸被逐一連接肽鏈得以沿直鏈延長(zhǎng)。然而，合成本發(fā)明闡述的分支骨架時(shí)，分支點(diǎn)是一個(gè)帶有兩個(gè)活性氨基的賴氨酸Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，賴氨酸的側(cè)鏈氨基也參與縮合反應(yīng)，因此從該賴氨酸(Lys，K)處繼續(xù)進(jìn)行氨基酸縮合反應(yīng)就會(huì)形成分支鏈，形成分支骨架“>KY-WANG固相樹脂”，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行下一循環(huán)的賴氨酸Fmoc-Lys(Fmoc)-OH縮合，就形成四分支骨架“>K2KY-WANG固相樹脂”；再繼續(xù)進(jìn)行Fmoc-Lys(Fmoc)-OH縮合，形成八分支骨架“>K4K2KY-WANG固相樹脂”。本發(fā)明是以KY帶有兩個(gè)活性氨基的賴氨酸(Lys，K，F(xiàn)moc-Lys(Fmoc)-OH)為分支點(diǎn)，同時(shí)縮合連接兩個(gè)用于下一步的氨基酸。若連接的是XAXBXCXDXE-X，則形成的是含二拷貝XAXBXCXDXE-X的兩分支(XAXBXCXDXE-X)2KY肽分子?；蛘呦冗B接兩個(gè)K(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)形成兩分支骨架，且“K2”的兩個(gè)用于下一步的氨基酸K各自帶兩個(gè)活性氨基，就形成了帶有四個(gè)活性氨基的分支點(diǎn)供下一步縮合氨基酸(XAXBXCXDXE-X)。如此按照XAXBXCXDXE-X的序列進(jìn)行縮合延長(zhǎng)肽鏈即形成了含有四拷貝XAXBXCXDXE-X的四分支{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY肽分子。還可以先連接兩個(gè)K(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)形成兩分支骨架，再連接四個(gè)K(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)形成四分支骨架，且“K4”的四個(gè)用于下一步的氨基酸K各自帶兩個(gè)活性氨基，就形成了帶有八個(gè)活性氨基的分支點(diǎn)供下一步縮合氨基酸(XAXBXCXDXE-X)。如此按照XAXBXCXDXE-X的序列進(jìn)行縮合延長(zhǎng)肽鏈即形成了含有八拷貝XAXBXCXDXE-X的八分支{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY肽分子。以此類推，可以形成含有十六拷貝、三十二拷貝、……XAXBXCXDXE-X的多分支肽分子。使用WANG固相樹脂合成完成后，采用TFA法將肽鏈從WANG固相樹脂上裂解下來得到以上的兩分支、四分支、八分支、……的肽分子。多肽合成目前成為常規(guī)技術(shù)。多肽合成及純化的原理和操作參見由盛樹力主編，科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社(1998年)出版的“多肽激素的當(dāng)代理論和應(yīng)用”一書的第三章“多肽的化學(xué)合成和純化”。本發(fā)明合成制備多肽化合物的方式可以參照以上固相合成方式，但并不局限于此合成方式。以下結(jié)合具體實(shí)施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容，并對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但這些實(shí)施例絕非對(duì)本發(fā)明有任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書的啟示下對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中所作的任何變動(dòng)都將屬于本發(fā)明。實(shí)施例1：拷貝肽片段的合成本發(fā)明的多肽化合物不論是兩分支、還是四分支、八分支，都具有相同的拷貝肽片段XAXBXCXDXE-X。該拷貝肽片段中XA為極性氨基酸分子，選自半胱氨酸(Cys，C)、甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬酰胺(Asn，N)或谷氨酰胺(Gln，Q)；XB和XE為堿性氨基酸分子(可相同也可不相同)，選自精氨酸(Arg，R)、賴氨酸(Lys，K)及組氨酸(His,H)中的一種或兩種；XC和XD為非極性氨基酸分子(可相同也可不相同)，選自丙氨酸(Ala，A)、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、脯氨酸(Pro，P)、苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))、色氨酸(Trp，W)及蛋氨酸(Met，M)中的一種或兩種；X為空或任意一個(gè)氨基酸或任意多個(gè)氨基酸組成的肽片段或能將氨基酸、肽片段連接起來的化學(xué)基團(tuán)，組合方式見表1-4，但不限于此。合成時(shí)，可采用有機(jī)化學(xué)Fmoc保護(hù)的氨基酸固相合成方法。具體操作如下：步驟一：選擇商業(yè)原料“X-WANG固相樹脂”或“XE-WANG固相樹脂”作為起始，保護(hù)基團(tuán)采用Fmoc保護(hù)法將X或XE末端的氨基保護(hù)起來；步驟二：選用XE或XD進(jìn)行氨基酸的逐一縮合延長(zhǎng)肽鏈，合成XAXBXCXDXE-X拷貝肽片段:本實(shí)施例中拷貝肽片段的合成是在多肽自動(dòng)合成儀(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐個(gè)氨基酸縮合延伸，合成完成后采用TFA法將目的多肽從WANG固相樹脂上裂解下來。采用多肽自動(dòng)合成儀(ABI433A型)，先把X或XE固定在WANG固相樹脂(WANG固相樹脂為固相肽合成中Fmoc保護(hù)方式載體)上，再通過縮合連接氨基酸(XE、XD、XC、XB、XA或XD、XC、XB、XA)，實(shí)際的連接順序?yàn)椋篧ANG固相樹脂-X-XEXDXCXBXA，就會(huì)得到固定在WANG固相樹脂上的拷貝肽片段。最后采用TFA法將目的拷貝肽片段從WANG固相樹脂上裂解下來，就得到了XAXBXCXDXE-X拷貝肽片段粗品。步驟三：純化XAXBXCXDXE-X拷貝肽片段采用色譜柱(型號(hào)為DaisoC18，10μm,50×250mm)，色譜操作流動(dòng)相A為(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流動(dòng)相B為90％乙腈/水，流速為每分鐘25毫升，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220納米。收集流出峰溶液，再經(jīng)過冷凍干燥。得到呈白色絮狀的XAXBXCXDXE-X拷貝肽片段，經(jīng)密封包裝后放入冰箱保存待用；其純度可＞99％。XA、XB、XC、XD、XE均可通過商業(yè)途經(jīng)采購獲得。在制備本發(fā)明的多肽化合物時(shí)，也可以用可外購的WANG固相樹脂-X或WANG固相樹脂-XE為原料，按照上述方法在X或XE的末端縮合氨基酸，得到本發(fā)明的拷貝肽片段，表1中列出部分合成得到的拷貝肽片段，并測(cè)得其質(zhì)譜分子量。表1拷貝肽片段XAXBXCXDXE-X的各基團(tuán)列表表1結(jié)果表明，本發(fā)明合成出的拷貝肽片段質(zhì)譜分子量與理論分子量的差距不到1％，說明該拷貝肽片段確證為對(duì)應(yīng)實(shí)施例的拷貝肽片段。此實(shí)施例部分是為了公開拷貝肽片段的內(nèi)容，并不是對(duì)本發(fā)明的限制，實(shí)際合成時(shí)可按以下實(shí)施例中的說明進(jìn)行。按照本發(fā)明闡述的方式制備分支骨架，其分支節(jié)點(diǎn)的氨基酸選取Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，其攜帶的兩個(gè)活性氨基為后續(xù)的氨基酸縮合連接反應(yīng)提供了分支的位點(diǎn)，可完成兩分支骨架“>KY-WANG固相樹脂”、四分支骨架“>K2KY-WANG固相樹脂”或八分支骨架“>K4K2KY-WANG固相樹脂”、……的合成。再按常規(guī)肽鏈延長(zhǎng)反應(yīng)選取胺基被保護(hù)起來的氨基酸，進(jìn)行分支節(jié)點(diǎn)后的肽鏈延長(zhǎng)從而制備出本發(fā)明的兩分支肽類分子(XAXBXCXDXE-X)2KY、四分支肽類分子{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY或八分支肽類分子{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY。鑒于肽鏈的延長(zhǎng)過程已是成熟技術(shù)，合成步驟的繁復(fù)細(xì)節(jié)在此不再贅述。實(shí)施例2：兩分支肽類分子(XAXBXCXDXE-X)2KY的合成本發(fā)明提供的二拷貝XAXBXCXDXE-X多肽化合物(XAXBXCXDXE-X)2KY的結(jié)構(gòu)與合成線路見式1，其中，XA為極性氨基酸分子，XB和XE為堿性氨基酸分子，XC和XD為非極性氨基酸分子，K為含有兩個(gè)活性氨基的賴氨酸FmocLys-(Fmoc)-OH，X和Y為空或任意一個(gè)或多個(gè)氨基酸或化學(xué)基團(tuán):本實(shí)施例采用有機(jī)化學(xué)Fmoc保護(hù)的氨基酸固相合成方法。具體操作如下：步驟一：保護(hù)基團(tuán)采用Fmoc保護(hù)法將賴氨酸的氨基保護(hù)起來；步驟二：合成(XAXBXCXDXE-X)2KY多肽化合物:本實(shí)施例中多肽的合成是在多肽自動(dòng)合成儀(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐個(gè)氨基酸縮合延伸，合成完成后采用TFA法將目的多肽從WANG固相樹脂上裂解下來。采用多肽自動(dòng)合成儀(ABI433A型)，先把Y固定在WANG固相樹脂(WANG固相樹脂為固相肽合成中Fmoc保護(hù)方式載體)上，再通過縮合連接賴氨酸(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)，實(shí)際的連接順序?yàn)椋篧ANG固相樹脂-Y-Lys,形成具有分支節(jié)點(diǎn)的兩分支骨架“>KY-WANG固相樹脂”；由于其末端的賴氨酸具有雙活化的氨基，進(jìn)而在“>KY-WANG固相樹脂”中K的兩個(gè)活性氨基末端與另外兩個(gè)XAXBXCXDXE-X片段發(fā)生反應(yīng)，就會(huì)得到兩分支肽的延伸(XAXBXCXDXE-X)2KY-WANG固相樹脂，即固定在WANG固相樹脂上的二拷貝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物(XAXBXCXDXE-X)2KY-WANG固相樹脂。此步驟中，合成時(shí)可以按照實(shí)施例1先合成好XAXBXCXDXE-X片段，再與WANG固相樹脂-Y-Lys縮合；或者，在“>KY-WANG固相樹脂”中K的兩個(gè)活性氨基末端依次連接X、XE、XD、XC、XB、XA。最后采用TFA法將目的多肽化合物從WANG固相樹脂上裂解下來，就得到了(XAXBXCXDXE-X)2KY多肽化合物粗品。步驟三：純化(XAXBXCXDXE-X)2KY多肽化合物采用色譜柱(型號(hào)為DaisoC18，10μm,50×250mm)，色譜操作流動(dòng)相A為(含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流動(dòng)相B為90％乙腈/水，流速為每分鐘25毫升，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220納米。收集流出峰溶液，再經(jīng)過冷凍干燥。得到呈白色絮狀的(XAXBXCXDXE-X)2KY多肽化合物，經(jīng)密封包裝后放入冰箱保存待用；其純度可＞99％。XA、XB、XC、XD、XE均可通過商業(yè)途經(jīng)采購獲得。在制備本發(fā)明的多肽化合物時(shí)，也可以用可外購的WANG固相樹脂-Y為原料，按照上述方法在Y的末端縮合氨基酸，得到本發(fā)明的多肽化合物。按照本實(shí)施例方法合成一系列兩分支肽類分子(XAXBXCXDXE-X)2KY，見表2。表2兩分支肽分子(XAXBXCXDXE-X)2KY的各基團(tuán)列表實(shí)施例3：四分支肽類分子{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY的合成本發(fā)明提供的四拷貝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY的結(jié)構(gòu)與合成線路見式2，該結(jié)構(gòu)也可以表達(dá)為(XAXBXCXDXE-X)4K2KY，各基團(tuán)的定義同實(shí)施例2:本實(shí)施例采用有機(jī)化學(xué)Fmoc保護(hù)的氨基酸固相合成方法。具體操作如下：步驟一：保護(hù)基團(tuán)采用Fmoc保護(hù)法將賴氨酸的氨基保護(hù)起來；步驟二：合成{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY多肽化合物:本實(shí)施例中多肽的合成是在多肽自動(dòng)合成儀(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐個(gè)氨基酸縮合延伸，合成完成后采用TFA法將目的多肽從WANG固相樹脂上裂解下來。采用多肽自動(dòng)合成儀(ABI433A型)，先把Y固定在WANG固相樹脂(WANG固相樹脂為固相肽合成中Fmoc保護(hù)方式載體)上，再通過縮合連接賴氨酸(賴氨酸Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)，實(shí)際的連接順序?yàn)椋篧ANG固相樹脂-Y-Lys,形成具有分支節(jié)點(diǎn)的兩分支骨架“>KY-WANG固相樹脂”；由于其末端的賴氨酸具有雙活化的氨基，與另外兩個(gè)賴氨酸(K，此時(shí)其兩個(gè)氨基被保護(hù))的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)就會(huì)得到兩分支骨架的延伸K2KY-WANG固相樹脂，此時(shí)在KY的賴氨酸氨基端上連接有兩個(gè)具有雙活化氨基的賴氨酸(K)，形成具有分支節(jié)點(diǎn)的四分支骨架“>K2KY-WANG固相樹脂”；在“K2”的每個(gè)具有雙活化氨基的賴氨酸(K)上繼續(xù)進(jìn)行與兩個(gè)XAXBXCXDXE-X片段的縮合，就得到了固定在WANG固相樹脂上的四拷貝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY-WANG固相樹脂。此步驟中，合成時(shí)可以按實(shí)施例1先合成好XAXBXCXDXE-X片段，再與K2KY-WANG固相樹脂縮合；或者在“>K2KY-WANG固相樹脂”中K的兩個(gè)活性氨基末端依次連接X、XE、XD、XC、XB、XA。最后采用TFA法將目的多肽化合物從WANG固相樹脂上裂解下來，就得到了{(lán)(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY多肽化合物粗品。步驟三：純化{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY多肽化合物同實(shí)施例2。最終得到呈白色絮狀的{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY多肽化合物，經(jīng)密封包裝后放入冰箱保存待用；其純度可＞99％。按照本實(shí)施例方法合成一系列四分支肽類分子{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY，具體基團(tuán)的選擇見表3。表3四分支肽類分子{(XAXBXCXDXE-X)2K}2KY的各基團(tuán)列表實(shí)施例XAXBXCXDXEXY實(shí)施例XAXBXCXDXEXY4-1TKLPR空G4-9SKLIK空G4-2SRPLRGA4-10CRLAKA空4-3CRLPRGG4-11SRLFRGW4-4TRPLR空G4-12TKPPR空G4-5SKLLKG空4-13TRPLK空G4-6QKAPH空G4-14SKILR空G4-7YRFMKAC4-15CHVMKPI4-8CKWAH空A4-16NHLWHND實(shí)施例4：八分支肽類分子{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY的合成本發(fā)明提供的八拷貝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY的結(jié)構(gòu)與合成線路見式3，該結(jié)構(gòu)也可以表達(dá)為(XAXBXCXDXE-X)8K4K2KY，各基團(tuán)的定義同實(shí)施例2:本實(shí)施例采用有機(jī)化學(xué)Fmoc保護(hù)的氨基酸固相合成方法。具體操作如下：步驟一：保護(hù)基團(tuán)采用Fmoc保護(hù)法將賴氨酸的氨基保護(hù)起來；步驟二：合成{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY多肽化合物:本實(shí)施例中多肽的合成是在多肽自動(dòng)合成儀(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)逐個(gè)氨基酸縮合延伸，合成完成后采用TFA法將目的多肽從WANG固相樹脂上裂解下來。采用多肽自動(dòng)合成儀(ABI433A型)，先把Y固定在WANG固相樹脂(WANG固相樹脂為固相肽合成中Fmoc保護(hù)方式載體)上，再通過縮合連接賴氨酸(Lys,K)，實(shí)際的連接順序?yàn)椋篧ANG固相樹脂-Y-Lys,形成具有分支節(jié)點(diǎn)的兩分支骨架“>KY-WANG固相樹脂”；由于其末端的賴氨酸具有雙活化的氨基，與另外兩個(gè)賴氨酸(K，此時(shí)其兩個(gè)氨基被保護(hù))的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)就會(huì)得到兩分支骨架的延伸K2KY-WANG固相樹脂，此時(shí)在KY的賴氨酸氨基端上連接有兩個(gè)具有單活化氨基的賴氨酸(K，此時(shí)其兩個(gè)氨基被保護(hù))，形成四分支骨架“>K2KY-WANG固相樹脂”；在“K2”的兩個(gè)具有單活化氨基的賴氨酸末端再分別與另外兩個(gè)賴氨酸(K，此時(shí)其兩個(gè)氨基被保護(hù))的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)就會(huì)得到四分支骨架的延伸K4K2KY-WANG固相樹脂，此時(shí)在K2KY的末端賴氨酸氨基端上連接有四個(gè)具有雙活化氨基的賴氨酸(K)，形成具有分支節(jié)點(diǎn)的八分支骨架“>K4K2KY-WANG固相樹脂”；在“>K4K2KY-WANG固相樹脂”的“K4”每個(gè)具有雙活化氨基的賴氨酸(K)上繼續(xù)進(jìn)行與兩個(gè)XAXBXCXDXE-X片段的縮合，就得到了固定在WANG固相樹脂上的八拷貝XAXBXCXDXE-X的多肽化合物{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY-WANG固相樹脂。此步驟中，合成時(shí)可以先合成好XAXBXCXDXE-X片段，再與{(K)2K}2KY-WANG固相樹脂縮合；或者在“>K4K2KY-WANG固相樹脂”中K的兩個(gè)活性氨基末端依次連接X、XE、XD、XC、XB、XA。最后采用TFA法將目的多肽化合物從WANG固相樹脂上裂解下來，就得到了{(lán)({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY多肽化合物粗品。步驟三：純化{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY多肽化合物同實(shí)施例2。最終得到呈白色絮狀的{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY多肽化合物，經(jīng)密封包裝后放入冰箱保存待用；其純度可＞99％。按照本實(shí)施例方法合成一系列八分支肽類分子{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY，具體基團(tuán)的選擇見表4。表4八分支肽類分子{({XAXBXCXDXE-X}2K)2K}2KY的各基團(tuán)列表實(shí)施例XAXBXCXDXEXY實(shí)施例XAXBXCXDXEXY8-1TKLPR空G8-9SKLIK空G8-2SRPLRGA8-10CRLAKA空8-3CRLPRGG8-11SRLFRGW8-4TRPLR空G8-12TKPPR空G8-5SKLLKG空8-13TRPLK空G8-6QKAPH空G8-14SKILR空G8-7YRFMKAC8-15CHVMKPI8-8CKWAH空A8-16NHLWHND由于本發(fā)明的多肽化合物是一類具有生物活性的有機(jī)分子，它們的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)決定了它們的生物學(xué)作用。單一氨基酸在蛋白質(zhì)或肽序列中的改變都有可能導(dǎo)致其生物學(xué)活性的改變，下面通過具體實(shí)驗(yàn)例來對(duì)本發(fā)明提供的多肽化合物的生物活性及其功效進(jìn)行闡述。實(shí)驗(yàn)例一：本發(fā)明多肽化合物在禽類動(dòng)物(雞)中的免疫效果實(shí)驗(yàn)新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus,NDV)能夠與雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象，這是一種特異性的抗體中和反應(yīng)，其原理是根據(jù)病毒的血凝素可凝集紅細(xì)胞，但若先用特異性抗體與病毒作用，然后再加入紅細(xì)胞后則不出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集，稱為血凝抑制試驗(yàn)(HemagglutinationInhibitiontest,HI),檢測(cè)所用的抗血清稀釋的最高倍數(shù)即是抗體的滴度。待測(cè)抗體的滴度越高，說明免疫的效果越好。HI方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.敏感性強(qiáng)，可以檢測(cè)到微量的抗體，結(jié)果也較為準(zhǔn)確，是較敏感的血清學(xué)檢測(cè)反應(yīng)之一；2.特異性強(qiáng)，病毒凝集紅細(xì)胞只能被特異性的抗體所抑制；3.檢測(cè)速度快，1次HI試驗(yàn)只需2小時(shí)左右即可判定結(jié)果；4.HI試驗(yàn)對(duì)環(huán)境要求不高，操作簡(jiǎn)單快捷，一次可檢測(cè)大量的樣品。將本發(fā)明實(shí)施例2-1至實(shí)施例2-16、實(shí)施例4-1至實(shí)施例4-16、實(shí)施例8-1至實(shí)施例8-16的多肽化合物在雛雞中進(jìn)行抗體滴度的檢測(cè)：給SPF雛雞接種雞新城疫活疫苗(CS2株，成都天邦生物制品有限公司出品)和本發(fā)明的多肽化合物，然后檢測(cè)多肽化合物在SPF雛雞體內(nèi)對(duì)新城疫活疫苗的HI抗體生成效果，從而得到本發(fā)明多肽化合物對(duì)新城疫活疫苗(抗原)的免疫效果。實(shí)驗(yàn)方法為：選取7日齡無特定病原(SpecificPathogenFree)雞(簡(jiǎn)稱為SPF雛雞)。將SPF雛雞分為8組，每組12只。在SPF雛雞的翅膀腋部皮下按以下組別接種。然后各組同時(shí)飼養(yǎng)在隔離器內(nèi)。接種后第14天翅下靜脈采血約1ml，分離血清進(jìn)行HI檢測(cè)，以實(shí)施例2-5、2-6、4-9、4-12、8-13和8-14(依序?qū)?yīng)表5中實(shí)驗(yàn)組1-實(shí)驗(yàn)組6)為例，檢測(cè)結(jié)果見表5(僅列出部分多肽化合物的檢測(cè)結(jié)果)，其它實(shí)施例結(jié)果與表5差別不大，不一一贅述。具體操作參見由郭鑫主編，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社2007年出版的《動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》?？瞻捉M：注射0.3ml生理鹽水；對(duì)照組：接種0.3ml雞新城疫活疫苗(簡(jiǎn)稱“疫苗”，CS2株)；實(shí)驗(yàn)組：接種混合有0.2μg本發(fā)明多肽化合物的疫苗0.3ml。表5SPF雛雞免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果注：陰性是指HI的抗體滴度為零；實(shí)驗(yàn)期間各組SPF雛雞飲食活動(dòng)未見異常，未見不良反應(yīng)，未發(fā)生SPF雛雞死亡，表明本發(fā)明的多肽化合物使用安全。表5結(jié)果表明疫苗中添加了本發(fā)明多肽化合物(實(shí)驗(yàn)組1-8)后，HI的抗體滴度均值比空白組和對(duì)照組(僅有疫苗)有所提高，說明本發(fā)明多肽化合物與疫苗聯(lián)用具有良好的免疫增強(qiáng)效果，與對(duì)照組相比平均提高HI抗體滴度1以上。實(shí)驗(yàn)例二：本發(fā)明多肽化合物在多拷貝基團(tuán)相同的情況下，不同分支對(duì)免疫效果的影響實(shí)驗(yàn)按實(shí)驗(yàn)例一方法對(duì)兩組本發(fā)明的多肽化合物(組Ⅰ和組Ⅱ)進(jìn)行免疫效果的實(shí)驗(yàn)，這兩組多肽化合物中同一組的多肽化合物多拷貝基團(tuán)相同，僅是分支數(shù)量不同，這兩組化合物是從實(shí)施例中隨機(jī)選取的。以實(shí)施例2-1、2-3、4-1、4-3、8-1和8-3為例，檢測(cè)結(jié)果見表6，其它實(shí)施例結(jié)果與表5差別不大，不一一贅述。實(shí)驗(yàn)分組：空白組：注射0.3ml生理鹽水；對(duì)照組：接種0.3ml雞新城疫活疫苗(簡(jiǎn)寫“疫苗”，CS2株)；實(shí)驗(yàn)組：接種混合有0.2μg實(shí)施例的疫苗0.3ml；實(shí)驗(yàn)期間各組SPF雛雞飲食活動(dòng)未見異常，未見不良反應(yīng)，未發(fā)生SPF雛雞死亡，表明本發(fā)明的多肽化合物使用安全。表6結(jié)果表明，隨著多肽片段拷貝數(shù)量的增加，也就是分支數(shù)量的增多，對(duì)雛雞的免疫應(yīng)答效果有所增強(qiáng)，免疫增強(qiáng)效果得到進(jìn)一步提升，意味著生物學(xué)效果與肽片段拷貝數(shù)量呈正相關(guān)的作用機(jī)制。表6SPF雛雞免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果注：陰性是指HI的抗體滴度為零。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下所做出的若干改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本
發(fā)明內(nèi)容。當(dāng)前第1頁1 2 3