本發(fā)明屬于現(xiàn)代生物技術(shù)之細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大鼠施旺細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

施旺細(xì)胞(schwanncellsscs)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)特有的、最主要的膠質(zhì)細(xì)胞，在周圍神經(jīng)的發(fā)生及損傷后的再生中起著重要的作用。它是周圍神經(jīng)纖維的鞘細(xì)胞，排列成串，包裹著周圍神經(jīng)纖維的軸突，反復(fù)包卷形成的同心圓板層，形成髓鞘。施旺細(xì)胞可分泌細(xì)胞粘附分子、多種神經(jīng)營養(yǎng)因子(ntfs)和細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)和引導(dǎo)周圍神經(jīng)軸突的再生。

施旺細(xì)胞能大量持續(xù)分泌生長因子vegf、tgf、pdgf等各種生物活性物質(zhì)以及分泌基質(zhì)。以往研究表明神經(jīng)和血管相伴行，近來進(jìn)一步的研究探討了其中的分子機(jī)制。mukouyama等研究發(fā)現(xiàn)小鼠小動脈特異性地與外周感覺神經(jīng)伴行，外周感覺神經(jīng)或施旺氏細(xì)胞的缺失可以導(dǎo)致小動脈生成障礙。施旺氏細(xì)胞在血管的動脈樣分化和成熟中具有重要作用。近來發(fā)現(xiàn)，vegf不僅在血管新生中發(fā)生著重要作用，還可以減小施旺細(xì)胞培養(yǎng)時的應(yīng)急反應(yīng)，增加在心肌內(nèi)的生存率，從而改善心梗后心功能。目前國內(nèi)外對于大鼠施旺細(xì)胞的分離與培養(yǎng)的研究較少，分離方法不成熟，獲得的細(xì)胞純度低，數(shù)量少。本發(fā)明旨在提供一種操作簡單、高效的獲得生長狀態(tài)好、純度高的大鼠施旺細(xì)胞的方法，建立一套完善可靠的大鼠施旺細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

根據(jù)上述問題，本發(fā)明提供了一種大鼠施旺細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，該方法操作簡單，細(xì)胞產(chǎn)量和成活率高，是一種較為理想的大鼠施旺細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，可以滿足多種生理生化實驗的要求。

本發(fā)明采用的的技術(shù)方案如下：

(1)將組織處理器械浸泡于濃度75％乙醇水溶液，再置于無菌操作臺紫外滅菌30min，將器械取出，在無菌操作臺里晾干；

(2)選取2～3周的雄性sd大鼠，頸椎脫臼法處死，將處死后的大鼠用75％乙醇浸泡10s；

(3)將大鼠腹面向上固定于板上，局部常規(guī)消毒，用眼科剪剪去大鼠腿部被毛，分離腿部肌肉截取坐骨神經(jīng)，將組織放入預(yù)冷無菌含雙抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的鏈霉素)pbs液(濃度為0.008～0.015m，ph為7.2～7.4)中洗滌除去血漬，去除外膜；

(4)無菌條件下，在預(yù)冷的pbs(濃度為0.008～0.015m，ph為7.2～7.4)中用眼科剪將神經(jīng)組織剪成1mm×1mm的碎塊；

(5)用37℃預(yù)熱的ii型膠原酶結(jié)合iv型膠原酶混合消化；

(6)用10ml含10％大鼠血清、雙抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的鏈霉素)、4～6μg/ml胰島素的dmem/f12(1∶1)混合培養(yǎng)基(簡稱混合培養(yǎng)基)終止消化，所得濾液100～200g離心10min，去掉上清液，保留沉淀；

(7)組織塊貼壁法接種細(xì)胞至鋪多聚賴氨酸包被的的6孔培養(yǎng)板中；

(8)倒置在37℃孵箱中孵育1～2h，沿孔邊緩慢加入混合培養(yǎng)基，置于37℃、5％co2環(huán)境中培養(yǎng)；

(9)24h小時后加入1ml的3～5μg/ml的阿糖胞苷處置48h，以除去成纖維細(xì)胞；

(10)接種72h初次換液，換液后同時加入1ml的20～30ng/ml的成纖維細(xì)胞生長因子(bfgf)純化細(xì)胞和1ml的4～6μm的福司柯林促進(jìn)施旺細(xì)胞增殖；

本發(fā)明在步驟(10)之后還包括以下步驟：

(11)細(xì)胞傳代純化細(xì)胞：培養(yǎng)7～9天，細(xì)胞增殖達(dá)到70～80％時進(jìn)行傳代，用pbs(濃度為0.01m，ph為7.2～7.4)清洗2～3次，用0.25％的胰酶消化2～3分鐘，用含大鼠血清的dmem/f12(1∶1)培養(yǎng)基終止消化，350g離心去上清，加入10ml含10％大鼠血清、雙抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的鏈霉素)、5μg/ml胰島素、ph為7.4的dmem/f12(1∶1)混合培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，按照1∶2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，記為p1，每個孔板的培養(yǎng)基中加入1ml的20～30ng/ml的成纖維細(xì)胞生長因子(bfgf)以除去成纖維細(xì)胞；

(12)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與鑒定：施旺細(xì)胞爬片的制作，細(xì)胞免疫熒光鑒定。

其中，步驟(2)所選的大鼠體重100±10g，2～3周雄性sd大鼠。

其中，步驟(3)(4)所述的pbs已4℃預(yù)冷，pbs濃度為0.01m，ph為7.2～7.4，培養(yǎng)皿置于冰上，是為了使組織處于無菌、低溫的環(huán)境。

其中，步驟(5)所述消化環(huán)境為37℃co2培養(yǎng)箱，消化時間20min，消化酶混合液由0.1％～0.2％的ii型膠原酶和0.1％～0.2％的iv型膠原酶混勻制得，所述兩種酶混合比例1∶1～1∶1.5。

其中，步驟(6)所述培養(yǎng)基為dmem/f12(1∶1)培養(yǎng)基，含10％大鼠血清，含100u/ml的青霉素、100u/ml的鏈霉素的雙抗，5μg/ml的胰島素。

其中，步驟(7)所述組織塊貼壁法是將組織均勻鋪在培養(yǎng)皿中。

其中，步驟(8)所述加入培養(yǎng)基過程應(yīng)緩慢，勿使組織塊漂起。

其中，步驟(9)所述阿糖胞苷濃度為5μg/ml。

其中，步驟(10)(11)所述的成纖維細(xì)胞生長因子濃度為25ng/ml，福司柯林濃度為5μm。

有益效果

本發(fā)明建立了一種簡單、高效的分離培養(yǎng)大鼠施旺細(xì)胞的方法，所得原代細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與鑒定：數(shù)量多、純度高、活性好，細(xì)胞成活率達(dá)95％以上，細(xì)胞純度達(dá)96％以上，通過免疫細(xì)胞化學(xué)等方法檢測細(xì)胞標(biāo)記物。

本發(fā)明采用sd大鼠為材料，來源廣泛。采用酶消化法和組織塊貼壁法相結(jié)合的分離方法，與單獨的組織塊貼壁法相比，其細(xì)胞遷出的速度更快，與單獨的酶消化法細(xì)胞，其細(xì)胞純度更高。

本發(fā)明采用阿糖胞苷、成纖維細(xì)胞生長因子、福司柯林等，可以在提高細(xì)胞camp水平的同時達(dá)到抑制成纖維細(xì)胞的效果。相對于磁珠分離法等其它方法，其技術(shù)更簡單易掌握，代價更低。

本發(fā)明采用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板，細(xì)胞生長狀態(tài)好，可滿足施旺細(xì)胞實驗的要求，多聚賴氨酸包被比apes包被制作更簡單，更易保存；本方法經(jīng)濟(jì)實用，簡便易行，有利于建立體外實驗?zāi)Ｐ图?xì)胞，研究施旺細(xì)胞的特性，為后續(xù)的實驗提供可靠的細(xì)胞資源。

附圖說明

圖1培養(yǎng)4d的大鼠施旺細(xì)胞圖片(100×)

圖2培養(yǎng)7d大鼠腦施旺細(xì)胞免疫熒光圖片(100×)

圖3培養(yǎng)7d大鼠腦施旺細(xì)胞核免疫熒光圖片(100×)

具體實施方式

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非另有說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。

下面結(jié)合附圖和實例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不限于下述實施例。

在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。

本實驗所用的實驗儀器與試劑如下：

外科手術(shù)器械一套，倒置顯微鏡(xds-1a，上海)，熒光顯微鏡(leica，美國)，恒溫孵育箱(heraeus，美國)，低溫離心機(jī)(td24b-ws，上海)，超低溫冰箱(中科美菱)，移液槍(eppendorf，美國)，電子分析天平(sartorius，美國)，超凈工作臺(hj-cj-1d，上海)，co2細(xì)胞培養(yǎng)箱(sanyomco-17ai，日本)。

dmem/f12(1∶1)購于corning公司，青霉素-鏈霉素雙抗于gibco購買，大鼠血清購買于bioind公司，多聚賴氨酸共買于美國gibco公司，nephrin抗體、阿糖胞苷購買于美國sigma，成纖維細(xì)胞生長因子(bfgf)購買于美國peprotech，福司柯林購買于美國sigma，pbs自制(8.0gnal、0.2gkcl、0.2gkh2po4、1.44gna2hpo4溶于1000ml去離子水中，調(diào)整ph為7.2～7.4，非特殊指出，本專利所用的pbs皆為此配方)，胰酶購買于bioind公司，ii型膠原酶和iv型膠原酶購買于德國serva公司，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、離心管購于美國corning公司。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案包括如下步驟：

(1)將組織處理器械浸泡于濃度75％乙醇水溶液，再置于無菌操作臺紫外滅菌30min，將器械取出，在無菌操作臺晾干，選取2～3周的體重100±10g雄性sd大鼠，頸椎脫臼法處死，將處死后的大鼠用75％乙醇浸泡10s；

(2)將大鼠腹面向上固定于板上，局部常規(guī)消毒，用眼科剪剪去大鼠腿部被毛，分離腿部肌肉截取坐骨神經(jīng)，將組織放入預(yù)冷無菌含雙抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的鏈霉素)pbs液(濃度為0.01m，ph為7.2～7.4)中洗滌除去血漬，剝離外膜；

(3)在另一個60mm培養(yǎng)皿中加入預(yù)冷的pbs(濃度為0.01m，ph為7.2～7.4)，無菌條件下，用眼科剪將神經(jīng)組織剪成1mm×1mm的碎塊；

(4)用37℃預(yù)熱的ii型膠原酶結(jié)合iv型膠原酶混合消化，37℃co2培養(yǎng)箱消化20min，所述混合消化酶溶液由0.15g/l的ii型膠原酶和0.15g/l的iv型膠原酶(1∶1.2)混合并且攪勻后制得；

(5)加入10ml含10％大鼠血清、雙抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的鏈霉素)、5μg/ml胰島素、ph為7.4的dmem/f12(1∶1)混合培養(yǎng)基(簡稱混合培養(yǎng)基)終止消化，所得濾液150g離心10min，去掉上清液，保留沉淀；

(6)組織塊貼壁法將沉淀細(xì)胞接種至鋪多聚賴氨酸包被的的6孔培養(yǎng)板中：將組織均勻貼于培養(yǎng)板底部；

(7)倒置在37℃孵箱中孵育1.5h，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，沿孔邊緩慢加入dmem/f12(1∶1)混合培養(yǎng)基，置于37℃、5％co2環(huán)境中培養(yǎng)；

(8)培養(yǎng)24h小時后可以看見少量細(xì)胞已從一些組織周圍遷出，并隨著時間增加逐漸增多，主要有兩種細(xì)胞：一種為成纖維細(xì)胞，呈圓形或不規(guī)則形狀，邊界不清；一種為施旺細(xì)胞，呈梭形或紡錘形，邊界清晰，有兩極，加入1ml的4μg/ml的阿糖胞苷處置48h，以除去成纖維細(xì)胞；

(9)接種72h初次換液，換液后同時加入1ml的25ng/ml的成纖維細(xì)胞生長因子(bfgf)除去成纖維細(xì)胞和1ml的5μm的福司柯林促進(jìn)增殖，7～9天后融合成網(wǎng)狀，仍有少量成纖維細(xì)胞；

(10)細(xì)胞傳代純化：培養(yǎng)7～9天，細(xì)胞增殖達(dá)到70～80％時進(jìn)行傳代，用pbs(濃度為0.01m，ph為7.2～7.4)清洗2～3次，用0.25％的胰酶消化2～3分鐘，用含大鼠血清的dmem/f12(1∶1)培養(yǎng)基終止消化，350g離心去上清，加入10ml含10％大鼠血清、雙抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的鏈霉素)、5μg/ml胰島素、ph為7.4的dmem/f12(1∶1)混合培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，按照1∶2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，記為p1，每個孔板的培養(yǎng)基中加入1ml的25ng/ml的成纖維細(xì)胞生長因子(bfgf)以除去成纖維細(xì)胞；

(11)細(xì)胞爬片的制作：a.取p1代細(xì)胞，pbs液洗滌1～2次；b.用0.25％胰蛋白酶消化3～5min，用dmem/f12(1∶1)混合培養(yǎng)基終止消化，離心收集沉淀；c.用dmem/f12(1∶1)混合培養(yǎng)基重懸，在細(xì)胞計數(shù)板中央放置計數(shù)專用的蓋玻片，用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計數(shù)板凹蹧處流出懸液，至蓋玻片被液體充滿為止，置顯微鏡下計數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)(四大格細(xì)胞總數(shù)/4×10⁴)，對于壓線的細(xì)胞只計數(shù)在上線和左線者，對于細(xì)胞團(tuán)按單個細(xì)胞計數(shù)。計數(shù)完成后再加入培養(yǎng)基將調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁶/ml；d.培養(yǎng)皿內(nèi)放入多聚賴氨酸處理后的玻璃爬片，加入細(xì)胞懸液，37℃co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

(12)施旺細(xì)胞免疫熒光鑒定：a.細(xì)胞爬片用pbs液沖洗3次，每次3min，4％多聚甲醛固定20～30min，pbs洗3次，每次10min；b.0.2％滲透液triton-100室溫(15-25℃)下孵育10min，pbs洗3次，每次10分鐘；c.5％bsa室溫封閉1h，吸去封閉液。加入nephrin抗體(用1％bsa稀釋)于冰箱4℃過夜孵育；d.pbs洗3次，滴加羊抗鼠pe熒光二抗igg(用1％bsa稀釋)，在室溫下置于濕盒內(nèi)孵育45min，pbs洗3次，自然晾干后在顯微鏡下觀察。熒光拍照，計數(shù)陽性細(xì)胞。

施旺細(xì)胞表現(xiàn)為陽性，呈黃綠色熒光，計數(shù)陽性細(xì)胞與所有細(xì)胞數(shù)的比值，陽性率即細(xì)胞純度大于96％。

本發(fā)明所得到的大鼠施旺細(xì)胞數(shù)量多，p1代細(xì)胞成活率達(dá)95％以上，細(xì)胞純度達(dá)96％以上。

本發(fā)明分離所得施旺細(xì)胞可大量增殖，并且可以原代培養(yǎng)3～5代，為后續(xù)的實驗提供可靠的細(xì)胞資源。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此實施實例。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)作出任何修改，等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。