本發(fā)明涉及一種雙吲哚馬來酰亞胺生物堿HD-ZWM288的抗腫瘤新用途，具體涉及雙吲哚馬來酰亞胺生物堿HD-ZWM288在制備抗腫瘤微管抑制劑的應用。

背景技術：

腫瘤是目前嚴重危害人類健康和生活質量的一類疾病，作用于微管的抗腫瘤藥物是最有效的一類應用于臨床的藥物。該類藥物利用微管的動力學特性，或促進其解聚或促進其聚合，從而達到直接影響細胞有絲分裂，并影響細胞的諸多正常生理功能，使細胞分裂停止于有絲分裂期（G2/M期），最終以細胞凋亡的形式引起腫瘤細胞死亡。但是，已有的微管蛋白抑制劑，例如，臨床上廣泛應用的長春新堿、紫杉醇普遍存在著耐藥性、毒副作用等問題，極大的限制了這些藥物的療效和應用，因而，低毒抗耐藥的新型微管抑制劑的發(fā)現(xiàn)是腫瘤治療的一個研究熱點，對抗腫瘤新藥的發(fā)現(xiàn)具有重要而深遠的意義。

雙吲哚馬來酰亞胺生物堿HD-ZWM288是以天然產物為先導物優(yōu)化修飾得到的新雙吲哚馬來酰亞胺類生物堿。吲哚馬來酰亞胺生物堿類化合物具有蛋白激酶C抑制活性，但是是否具有其他重要的靶點作用及藥理活性，值得深入研究?；谶@一原因，我們利用微管靶點的篩選系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)HD-ZWM288具有促進微管解聚、破壞微管動態(tài)不平衡性、破壞紡錘體、阻滯細胞有絲分裂、引起細胞凋亡的通路和機制；具有腫瘤抗新生血管作用，并且動物抗腫瘤試驗有效。是一種非常具有開發(fā)前景的化療藥物。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是研究雙吲哚馬來酰亞胺生物堿HD-ZWM288抗腫瘤微管抑制劑的新用途。

為了進行本發(fā)明的實驗研究，首先合成得到雙吲哚馬來酰亞胺生物堿HD-ZWM288純品，制成實驗用藥樣品。雙吲哚馬來酰亞胺生物堿HD-ZWM288合成路線附圖1 ：

雙吲哚馬來酰亞胺生物堿HD-ZWM288促進微管蛋白的解聚、影響微管的動態(tài)平衡作用

免疫熒光實驗：

將蓋玻片鋪于24孔板中，取對數生長期的人乳腺癌MCF-7細胞接種到24孔培養(yǎng)板中的圓形蓋玻片上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜爬片，然后用 HD-ZWM-288處理細胞24 h。然后取出，進行免疫熒光染色：

（1）棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，用甲醇/丙酮1:1室溫固定5 min。

（2）PBS洗滌5 min。

（3）加入0.1%的Triton-100 10 min。

（4）用PBS-TX洗滌3次，每次5 min。

（5）加入一抗，室溫避光孵育4h

（6）吸掉一抗，PBS-TX洗滌3次，每次5 min。加入二抗室溫避光1-2h。

（7）吸掉二抗，，DAPI（2 μg/ml）室溫避光染色15 min，條件下進行。

（8）吸掉PBS-TX后，在載玻片上滴加抗熒光淬滅劑，將爬片反蓋于載玻片上。共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

結果見附圖2A

提取細胞微管

取對數生長期的人乳腺癌MCF-7細胞接種到6孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，然后用0.1 μM VCR（長春新堿）和HD-ZWM-288（0.25 μM和0.5 μM）分別處理細胞24 h。

（1）棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次。

（2）加入100 μl微管提取低滲溶液，置于37度5 min. 度

（3）4度下14000 rpm 離心10分鐘，取上清于新EP管中，這一部分為可溶的微管二聚體，沉淀則含有不溶性的聚合微管，將沉淀重新溶解在100 μl低滲溶液中。

（4）將兩部分還有蛋白的溶液加入與之等體積的2×SDS-PAGE sample buffer，置于95度滅活5 min，之后用Western blot方法對蛋白含量進行分析。

結果見附圖2B

影響微管的動態(tài)平衡

方法：牛腦微管蛋白（>97％純的微管蛋白）加入10ML的G-PEM緩沖液（80 mM PIPES, 2 mg MgCl2, 0.5 mM EGTA, 1.0 mM GTP, pH 6.9）、5％甘油、0.1％DMSO中于 4℃混懸，然后加入供試品，按照試劑盒(Cat. BK004)的方法(Cytoskeleton Inc., Denver, USA)，樣品轉入96孔板，340nm熒光分光光度計(Perkin–Elmer/Wallac Inc., Freiburg, Germany) .測定，每分鐘一次共1h。

結果見附圖3

細胞周期的抑制作用

（1）取對數生長期的將人乳腺癌MCF-7細胞接種到6孔板中細胞密度為3×104/mL，培養(yǎng)過夜貼壁，用不同濃度的HD-ZWM-288作用于細胞24小時。

（2）消化收集細胞，2000 rpm 離心5分鐘，并用PBS洗2次，轉移至EP管中。

（3）每管用150 μL冷PBS懸浮細胞，滴加350 μL預冷的乙醇固定過夜。

（4）PBS洗滌2次，加入100 μL PBS重懸細胞，并加入1.5 μL RnaseA（10 mg/ml）于37度孵育30 min

（5）每管加入5 μL PI（1 mg/mL）,于4度避光1 h。加入適量PBS于流式管中，調整細胞濃度為1×106/mL上流式細胞儀檢測。計數20 000個細胞，檢測完后用CELLQuest軟件分析細胞群體中G1、S、G2/ M期細胞百分率。

結果見附圖4

雙吲哚馬來酰亞胺生物堿HD-ZWM288對腫瘤細胞的生長抑制作用

方法：取對數生長期的以上細胞株制成細胞懸液，接種于96 孔板，每孔100 μl，細胞密度為5000-10000/孔。置于37度、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜貼壁后，分別用不同濃度的HD-ZWM-288處理細胞，同時設陰性對照組，即細胞中含有相同濃度的DMSO的對照組。繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h和48 h后，每孔加入MTT（5 g/L）溶液12 μl，37度培養(yǎng)4 h，吸去上清液，加入150 μl DMSO，避光10 min后，振蕩搖勻，使結晶充分溶解。用酶標分析儀于570 nm測定各孔OD值。重復三次取平均值。并且用軟件計算IC50值。

結果見表1

表1 HD-ZWM-288對多種腫瘤細胞和正常細胞的的細胞毒活性

MTT實驗測定HD-ZWM-288對多種腫瘤細胞和正常細胞的的細胞毒活性，將細胞置于不同濃度的HD-ZWM-288處理細胞12-24 h，HD-ZWM-288作用于腫瘤細胞MCF-7、MDA-MB-231、U87、K562、A549、HELA和正常細胞RPE-1和 HUVEC 48 h后的IC50結果如表1所示，從中發(fā)現(xiàn)HD-ZWM-288能夠顯著抑制人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231的增殖，尤其對MCF-7細胞株的毒性效果最好，IC50是0.62 μM，并呈現(xiàn)劑量依賴性和時間依賴性。同時檢測了HD-ZWM-288對另外兩種正常細胞（RPE-1和HUVEC）的細胞毒活性。如表所示，HD-ZWM-288對這兩種正常細胞的細胞毒活性比腫瘤細胞低，HD-ZWM-288處理48 h，RPE-1和HUVEC的IC50分別是4.01和5.92 μM。

雙吲哚馬來酰亞胺生物堿HD-ZWM288抗新生血管作用

劃痕實驗

（1）先用Marker筆在6孔板背后用直尺均勻劃橫線，大約每隔0.5-1 cm一道，每孔至少穿過5條線。

（2）在每個孔中加入約5×105個細胞，過夜貼壁。

（3）用進口200 μL的槍頭比著直尺盡量重疊于橫線劃痕。

（4）用PBS沖洗細胞三次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。

（5）放入置于37度，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每間隔一定時間拍照。

結果見附圖5

管形成實驗

（1）從-20度冰箱中取出Matrigel膠，在4度放置約1 h使其融化。融化后將其鋪于96孔板，每孔50 μL，置于37度培養(yǎng)箱中使其凝固。

（2）將HUVEC細胞懸液鋪于已有凝固的Matrigel膠的孔內，每孔100 μL。加入不同濃度的HD-ZWM-288，置于培養(yǎng)箱中孵育。

（3）觀察到出現(xiàn)管形成后，置于10×objective lens下觀察，選取五個視野拍照。

（4）用Motic Image Plus 2.0軟件處理。管形成定義為分支點的形成。

結果見附圖6

雞胚尿囊膜實驗

（1）雞胚準備：選購新鮮北京白雞種蛋若干枚，先用蒸餾水洗凈，用1:1000新潔爾滅浸泡3 min，置于溫度為37度、濕度為40%-60%的培養(yǎng)箱中孵育7天，氣室朝上放于蛋托上。

（2）用照蛋燈觀察篩選出有正常血管的種蛋，并造假氣室，即在氣室頂端用牙科鉆打1-2 mm小孔。同時在正對雞胚的位置也打磨一個小孔，并滴一滴滅菌水，再用洗耳球在氣室小孔處吸氣。最后，用醫(yī)用膠布貼住蛋身小孔，此孔向上置于孵箱中穩(wěn)定1-2天。

（3）開窗：在蛋身小孔的位置,兩條卵黃靜脈之間的卵殼投影部位，用牙科細砂輪打一個約1.5 cm×1 cm的長方形窗口，用鑷子揭去蛋殼，在殼膜上滴加1滴滅菌水，使尿囊膜與蛋殼分開，并剪除卵殼膜。

（4）加藥：在開窗的位置，將無菌明膠海綿小塊置于相對無血管區(qū)，然后用微量注射器向小塊內加入稀釋藥物。分為陰性對照組（生理鹽水組）和給藥組（HD-ZWM-288組，10 μg、50 μg、100 μg、200 μg和300 μg）。給藥后用醫(yī)用透明膠紙封閉窗口，37℃孵育3天后觀察。

（5）結果觀察：揭去透明膠，在體式顯微鏡下進行觀察與拍照。

結果見附圖7

雙吲哚馬來酰亞胺生物堿HD-ZWM288體內移植瘤抑制作用

（1）建立MCF-7皮下移植瘤裸鼠模型：取處于對數生長期的MCF-7細胞，進行胰酶消化后，l000rpm離心5min，收集細胞沉淀，并用生理鹽水洗滌沉淀兩次，棄掉上清。用生理鹽水重懸細胞沉淀，使細胞密度為107個/只，用注射器吸取200 μL細胞懸液皮下接種到Balb/c無胸腺雌性裸鼠腋下。一個月后，待腫瘤長到合適大小，再取出搗碎用穿刺針將瘤塊接種到16-18g的SPF級Balb/c無胸腺雌性裸鼠腋下，于IVC-II型(智能型)獨立送風隔離籠具中進行飼養(yǎng)。

（2）分組及給藥：待腫瘤組織長至100mm3時，將裸鼠按照腫瘤大小隨機分為4組，每組6只，分別為陰性對照組（vehicle）、陽性對照長春新堿組（vincristin）和 HD-ZWM-288 高、低劑量組。每三天腹腔注射給藥，vincristin 注射液0.5 mg/kg，HD-ZWM-288 溶液15 mg/kg和30 mg/kg，同時陰性對照組給予等體積溶劑。給藥持續(xù)15天。

（3）腫瘤體積和裸鼠體重測量：分組后，每三天測量裸鼠的體重，并用游標卡尺測量腫瘤組織的長（L）和寬（W），計算腫瘤體積。腫瘤體積(mm3)計算公式為：L×W2×0.5

計算每組內所有小鼠腫瘤體積和體重的平均值，用Origin 8.0制作成體重和腫瘤體積增長折線圖。

（4）給藥結束后，將所有裸鼠處死取出腫瘤組織，進行拍照并稱重。每組拿出部分瘤塊用4%多聚甲醛固定用于切片，一部分儲存于-80℃保存，用于提取腫瘤蛋白。

HE染色

（1）將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水：將石蠟切片置于60-70℃恒溫烤箱中烘烤2 h,依次將載玻片放入二甲苯4 h、二甲苯4 h、二甲苯過夜。在依次轉入100%乙醇、100%乙醇、95%酒乙醇、75%乙醇，每次5分鐘。

（2）蘇木素-伊紅染色：將脫蠟后的片子用清水沖洗后，浸泡于蘇木素中染色30s，然后用自來水沖洗充分沖洗后放入伊紅染液5s，再用自來水沖洗。

（3）脫水：將染色后的片子置于自來水中沖洗后，依次將載玻片放入80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇，每次5分鐘。再依次轉入二甲苯、二甲苯，每步10分鐘)，置于通風柜中揮干二甲苯。

（4）封片：用中性樹膠滴在組織面用蓋玻片蓋上，免產生氣泡。封好片子后置于通風柜中晾干，再置于顯微鏡下觀察及拍照。

免疫組化染色

（1）將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水：將石蠟切片置于60-70℃恒溫烤箱中烘烤2 h,依次將載玻片放入二甲苯4 h、二甲苯4 h、二甲苯過夜。在依次轉入100%乙醇、100%乙醇、95%酒乙醇、75%乙醇，每次5分鐘。

（2）抗原修復，采用電爐加熱修復。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（PH 6.0）的容器中，電爐加熱至沸騰后斷電。間隔5-10 min后，反復1-2次。冷卻至室溫。

（3）3%H2O2去離子水孵育5-10 min，以消除內源性過氧化物酶活性。PBS沖洗，3 min×3次。

（4）滴加SP-9000試劑盒中的A液，室溫孵育10-15 min，甩去多余液體，勿洗。

（5）滴加適當比例稀釋的一抗，于濕盒中4度孵育過夜。PBS沖洗，3 min×3次。

（6）滴加B液，室溫或37度孵育10-15 min，PBS沖洗，3 min×3次。

（7）滴加C液，室溫或37度孵育10-15 min，PBS沖洗，3 min×3次。

（8）顯色劑DAB顯色：準備1 mL雙蒸水，加入DAB試劑盒中的試劑A一滴，混合均勻，然后將試劑B和C各一滴加入其中，再次混勻?，F(xiàn)用現(xiàn)配，滴加到切片上。室溫顯色2-10 min后，用自來水充分沖洗。

（9）蘇木素復染：用蘇木素染色液進行細胞核染色。置于自來水中沖泡，甩凈水。

（10）0.1%鹽酸酒精分色5-10 s，取出自來水沖洗10 min

（11）脫水：將染色后的片子置于自來水中沖洗后，依次將載玻片放入80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇，每次5分鐘。再依次轉入二甲苯、二甲苯，每步10分鐘)，置于通風柜中揮干二甲苯。

（12）封片：用中性樹膠滴在組織面用蓋玻片蓋上，免產生氣泡。封好片子后置于通風柜中晾干，再置于顯微鏡下觀察及拍照。

結果見附圖8

附圖1 HD-ZWM288的合成路線

附圖2 (A) α-tubulin和DAPI免疫熒光染色疊加圖片。觀察HD-ZWM288 對微管蛋白(tubulin)（綠色）結構的影響，并與長春新堿對比，發(fā)現(xiàn)藥物處理后，微管分布發(fā)生改變，細胞內微管長度縮短，微管由絲狀解聚為顆粒狀的微管蛋白，管狀的結構成為散點狀，密度變稀，高濃度下可見某些細胞內纖維狀微管斷裂甚至消失，與微管解聚劑長春新堿的作用類似；微管動態(tài)平衡破壞, 多極紡錘體形成, 細胞不能分裂）。(B) Western blot結果顯示，HD-ZWM-288能夠使聚合形式的tubulin蛋白表達水平下降，對可溶性微管蛋白的略有影響，總體的微管蛋白水平變化不大。

附圖3體外雙吲哚馬來酰亞胺生物堿HD-ZWM288對微管動態(tài)平衡的影響。結果表明，雙吲哚馬來酰亞胺生物堿HD-ZWM288以劑量依賴的方式減少的吸光度，影響微管蛋白的聚合速率，顯著抑制微管蛋白的聚合。

附圖 4 流式細胞儀測定結果表明，HD-ZWM288顯著使細胞周期阻滯在G2/M期

附圖 5結果所示， HD-ZWM-288可以以時間和劑量依賴的方式抑制HUVEC細胞的遷移。在低劑量下，從12 h至24 h，抑制率可以從40.1% 達到92.2%，在最高劑量1 μM下，抑制率從55.0%達到94.3%

附圖 6結果表明，HD-ZWM-288有較好的抑制管形成作用。作用一定的時間之后，HD-ZWM-288在濃度0.25 μM,，0.5 μM和1 μM，與溶劑對照組相比，管分支點的數量分別下降至47.1%,33.3%和12.7%。

附圖7 以明膠海綿載藥，載藥量分別為0 μg、10 μg、50 μg、100 μg、200 μg和300 μg，置于尿囊膜上孵育3天后觀察并進行血管的統(tǒng)計。由于雞胚不斷運動使得大部分雞胚尿囊膜上的載藥明膠海綿發(fā)生移位無法準確觀察，因此只計數海綿周圍及其下方一定范圍內的血管數。如圖所示，72 h 后，與溶劑對照組相比，50 μg 的血管數組表現(xiàn)出輕微的抑制，而100 μg和200 μg組有效地減少了雞胚尿囊膜上的血管數，并且伴隨著HD-ZWM-288劑量的增加，血管網絡有逐漸破壞的趨勢，統(tǒng)計結果表現(xiàn)出顯著性差異。結果表明，HD-ZWM-288能夠抑制雞胚尿囊膜的新生血管。

附圖8 (A, B) 與對照組裸鼠的腫瘤體積相比,給藥組（陽性藥VCR組和HD-ZWM-288組）的腫瘤體積增加明顯緩慢，說明HD-ZWM-288可以抑制腫瘤的生長。（C）給藥組的裸鼠體重不同程度減輕，陽性藥VCR組較HD-ZWM-288組毒性更大。(D) HE染色結果表明，對照組的腫瘤組織表現(xiàn)出豐富的血管和良好的增殖活力，而給藥組的腫瘤細胞則呈現(xiàn)出不同的程度的壞死。以上結果表明, HD-ZWM-288能顯著地抑制肝癌HepG-2腫瘤的生長，毒性較小。