本發(fā)明涉及一種獲取作為中間結(jié)果的終末期腎臟病信息，特別是涉及一種b細(xì)胞抗原受體h鏈cdr3的處理方法。
背景技術(shù)：
終末期腎臟病(endstagerenaldisease，esrd)，指各種慢性腎臟疾病的終末階段，與尿毒癥的概念類似，只是診斷標(biāo)準(zhǔn)有所差異。一般認(rèn)為當(dāng)小球濾過率降至15ml/(min.1.73m2)以下時即可診斷。也就是說當(dāng)慢性腎臟病到了5期時就進(jìn)入了終末期腎臟病階段。esrd患者往往伴有免疫功能極其低下，并發(fā)嚴(yán)重的感染是其生活質(zhì)量低下、發(fā)生死亡的主要原因，所以了解慢性腎功能不全患者不同階段的免疫狀態(tài)對指導(dǎo)臨床具有重要意義。在esrd患者的早期可無明顯不適，但隨著腎功能的進(jìn)行性下降，毒素在體內(nèi)進(jìn)一步蓄積，可引起尿毒癥的各種癥狀，如惡心、嘔吐、胃納差、皮膚瘙癢、口氨臭味、水腫等，并可出現(xiàn)貧血等一系列并發(fā)癥。腎臟疾病免疫發(fā)病機制認(rèn)識逐步深入，在各種腎小球疾病的發(fā)展過程中，在多種損傷因子作用下，腎臟內(nèi)炎癥、單核或巨噬細(xì)胞浸潤，各種趨化和粘附分子釋放，細(xì)胞損傷、凋亡和增生，特別是足細(xì)胞的損傷，凋亡和轉(zhuǎn)分化，引起大量蛋白尿，最后導(dǎo)致纖維化和腎小球硬化，是腎小球疾病發(fā)展、惡化、腎功能喪失的共同途徑。
近年來許多研究表明，慢性腎功能不全患者尤其發(fā)展到晚期的尿毒癥階段，由于腎功能衰竭導(dǎo)致體內(nèi)大量毒素的蓄積是引起機體的免疫抑制的重要原因。主要引起細(xì)胞免疫的缺陷，表現(xiàn)為輔助性/誘導(dǎo)性t細(xì)胞數(shù)量減低，抑制性/細(xì)胞毒性t細(xì)胞數(shù)量相對增高，其比值減低的一種免疫抑制狀態(tài)，我們知道輔助性t細(xì)胞也參與調(diào)節(jié)b細(xì)胞的分化和增殖，所以也間接的影響了體液免疫(cdl9表達(dá)低下)，導(dǎo)致體液免疫缺陷，抗體產(chǎn)生障礙。細(xì)胞與體液免疫的缺陷都可以引起患者嚴(yán)重感染的發(fā)生。引起免疫抑制的原因可能由于：慢性腎功 能不全患者體內(nèi)脂質(zhì)代謝是紊亂的，血清中抑制毒素如脂蛋白，特別是極低密度脂蛋白能改變淋巴細(xì)胞膜表面脂肪酸的結(jié)構(gòu)，引起il-2的生成減少，從而引起t細(xì)胞的增殖受到抑制，也影響了b細(xì)胞的生長和分化；而小分子的尿素氮、肌酐等亦可抑制淋巴細(xì)胞對植物血凝素的反應(yīng)，使得t細(xì)胞的轉(zhuǎn)化功能降低，這也是t細(xì)胞缺陷的一個重要原因。然而上述的研究并沒有能完全闡明esrd的免疫機制，治療的手段仍沒有根本變革。更為重要的是，由于esrd是多因素的、遺傳素質(zhì)、性激素和環(huán)境因素等相互作用引起疾病，而且esrd患者在體內(nèi)毒素聚集后又會影響患者免疫狀態(tài)。因此，從新的角度闡釋esrd的發(fā)病機制、對免疫系統(tǒng)影響以及尋找新的生物標(biāo)志物及治療靶點仍然是當(dāng)前esrd研究的主要目標(biāo)和挑戰(zhàn)之一。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
基于此，有必要針對上述問題，提供一種終末期腎臟病患者b細(xì)胞抗原受體h鏈cdr3的處理方法。
一種b細(xì)胞抗原受體h鏈cdr3的處理方法，包括以下步驟：
設(shè)置實驗組與對照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的外周血標(biāo)本；
分離各所述外周血標(biāo)本的b細(xì)胞，并分別提取所述外周血標(biāo)本b細(xì)胞中的dna；
采用多重pcr技術(shù)，擴增出b細(xì)胞受體h鏈的cdr3區(qū)；
對所述b細(xì)胞受體h鏈的cdr3區(qū)進(jìn)行高通量測序，并對所述實驗組及對照組中b細(xì)胞受體h鏈進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
在其中一個實施例中，采用多重pcr技術(shù)之前，所述處理方法還包括測定dna的含量以及檢測dna完整性的步驟。
在其中一個實施例中，采用熒光分析法測定dna的含量。
在其中一個實施例中，用瓊脂糖凝膠電泳法檢測dna完整性。
在其中一個實施例中，利用illuminamiseq平臺對cdr3區(qū)進(jìn)行高通量測序。
在其中一個實施例中，采用多重pcr技術(shù)，擴增出b細(xì)胞受體h鏈的cdr3區(qū)，包括構(gòu)建dna文庫，其具體包括：
計算所述實驗組及對照組中dna的取用量，稱取，并加入v區(qū)引物及j區(qū)引物多重pcr；
電泳檢測回收多重pcr產(chǎn)物；
加入末端修護(hù)混合液進(jìn)行末端修護(hù)反應(yīng)，并純化；
將純化后的產(chǎn)物在3’端連上a堿基；
在接頭連接反應(yīng)體系中進(jìn)行接頭連接；
通過pcr反應(yīng)富集經(jīng)過接頭修飾的dna片段，并對pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段后，純化回收，得到dna文庫。
在其中一個實施例中，構(gòu)建dna文庫后，還包括檢測所述dna文庫的插入片段范圍及對所述dna文庫的濃度進(jìn)行定量。
在其中一個實施例中，對所述實驗組及對照組中b細(xì)胞受體h鏈進(jìn)行數(shù)據(jù)分析包括：對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和預(yù)處理、對數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析、對序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析、構(gòu)建免疫組庫及對免疫組庫進(jìn)行差異分析。
在其中一個實施例中，分離各所述外周血標(biāo)本的b細(xì)胞包括：分離出所述外周血標(biāo)本的淋巴細(xì)胞及分離出所述淋巴細(xì)胞中的b細(xì)胞。
在其中一個實施例中，采用ficoll密度梯度離心法分離出所述外周血標(biāo)本的淋巴細(xì)胞。
上述處理方法通過高通量測序為基礎(chǔ)對終末期腎臟病患者已經(jīng)脫離人體的全血標(biāo)本單個核細(xì)胞bcr的cdr3區(qū)域進(jìn)行分析，有助于闡明esrd的發(fā)病機制，加深對這種疾病病因的理解，進(jìn)而為esrd疾病預(yù)防、診斷和治療提供新的契機。
附圖說明
圖1為本發(fā)明一實施例中b細(xì)胞抗原受體h鏈cdr3的處理方法的流程示意圖。
具體實施方式
為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施例的限制。
請參閱圖1，本發(fā)明的一個實施例是，一種b細(xì)胞抗原受體h鏈cdr3的處理方法，其包括如下步驟。
s110、設(shè)置實驗組與對照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的外周血標(biāo)本。
例如，本發(fā)明各實施例采用的外周血標(biāo)本，分別來自于在桂林解放軍第181醫(yī)院器官移植中心住院的esrd患者和同一時間段體檢的健康者6例。所有患者均符合美國腎臟病基金會k/doqi專家組對esrd患者診斷標(biāo)準(zhǔn)。esrd患者診斷標(biāo)準(zhǔn)：1.腎小球濾過率(gfr)《15ml/min并大多數(shù)患者伴有尿毒癥癥狀2.需要開始腎臟替代治療(透析或腎移植)。
其中esrd患者10例，女性3例，男性7例，年齡25～63歲，平均年齡35.64±11.27歲，病程0.2～8年。健康對照組6例，其中女性3例，男性3例，年齡為24～47歲，平均年齡33.47±9.61歲，為南方醫(yī)科大學(xué)附屬桂林解放軍第181醫(yī)院同一時間段體檢的健康者，無重大疾病史，無免疫方面的相關(guān)疾病、近期感染及腎臟方面疾病，本人或直系親屬無esrd病史。
例如，在室溫條件下，獲取脫離人體的外周靜脈血5ml置于5mledta抗凝真空采血管，蓋上蓋子后，將edta抗凝真空采血管輕輕顛倒混勻數(shù)次后，放入-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫總€標(biāo)本在收集后當(dāng)天分離出b細(xì)胞。
s120、分離各所述外周血標(biāo)本的b細(xì)胞，并分別提取所述外周血標(biāo)本b細(xì)胞中的dna。
例如，分離各所述外周血標(biāo)本的b細(xì)胞包括：分離出所述外周血標(biāo)本的淋巴細(xì)胞及分離出所述淋巴細(xì)胞中的b細(xì)胞。又如，采用ficoll密度梯度離心法分離出所述外周血標(biāo)本的淋巴細(xì)胞。
又如，步驟s120包括如下步驟：
s121、分離出所述外周血標(biāo)本的淋巴細(xì)胞。
具體地，步驟s122包括如下步驟：
(1)在離心管中按1：1比例加入適量淋巴細(xì)胞分離液，即淋巴細(xì)胞分離液與外周血的體積比為1：1。
(2)取肝素抗凝靜脈血用滴管沿離心管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心800g×25分鐘，即離心力rcf的值為800，離心時間為20min。
(3)離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。
(4)用平頭吸管吸出上、中層界面處絮狀液體，轉(zhuǎn)移至eppendorf管；離心細(xì)胞液800g×15分鐘，去液相，加入無菌pbslml洗滌，再用吸管吹勻細(xì)胞懸液；再次離心細(xì)胞液400g×15分鐘，去液相。又如，離心細(xì)胞液400g×15分鐘之后，靜置1～5分鐘，采用吸取法去液相。
(5)末次離心后，棄上清，加入含有10％小牛血清的rpmi1640，重懸細(xì)胞。取20μl細(xì)胞懸液與20μl0.5％溴酚蘭染液混合(1：1)，于血球計數(shù)板上計數(shù)。
s122、分離出淋巴細(xì)胞分離液中的b細(xì)胞。
s123、提取b細(xì)胞中的dna。
具體地，步驟s123包括如下步驟：
(1)取5000μlb細(xì)胞樣品放入10mledta抗凝管中。
(2)加20mg/ml蛋白酶k20μl，室溫放置15分鐘，在此期間顛倒混勻幾次，然后加入200μl結(jié)合液cb，立刻上下顛倒使其充分混勻，再在70℃水浴放置10分鐘。
(3)加100μl異丙醇，混勻。
(4)將混合液加入吸附柱，然后將吸附柱放入收集管中，10000rpm離心30秒，棄廢液。
(5)加500μlir(抑制物去除液)，12000rpm離心30秒，棄廢液。
(6)加700μlwb(漂洗液)，12000rpm離心30秒，棄廢液。
(7)再加500μlwb，12000rpm離心30秒，棄廢液。
(8)將吸附柱重新放回收集管中，13000rpm離心2分鐘，盡可能除去殘留的漂洗液。
(9)將吸附柱放入另一離心管中，加100μl已預(yù)熱的洗脫緩沖液eb，室溫放置3-5分鐘，12000rpm離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘。
(10)收集dna并存放在2-8℃冰箱中待用。
s130、測定中dna含量及完整性。
例如，步驟s130包括如下步驟：
s131、測定dna含量，例如，采用熒光分析法測定dna的含量。
具體地，步驟s131包括如下步驟：
配制dna染料工作液；
例如，dna染料為quant-ittmreagent，通過用quant-ittmbuffer將其稀釋200倍得到quant-ittmworkingsolution。
制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；
例如，分別取quant-ittmstandard1(100ng/μl)和quant-ittmstandard2(100ng/μl)0～10μl混合后，其中quant-ittmstandard1和quant-ittmstandard2的總體積為10μl，再與190μlquant-ittmworkingsolution混合后，按照
將dna待測液與dna染料工作液混合，室溫靜置2分鐘后，進(jìn)行熒光檢測；
分別取2～20μl的dna待測液與180～198μl的quant-ittmworkingsolution混合后，其中，dna待測液與quant-ittmworkingsolution總體積為200μl，室溫靜置2分鐘，使dna與染料充分結(jié)合，然后置于
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得出dna待測液的dna含量。
s132、測定dna完整性，例如，采用瓊脂糖凝膠電泳法測定dna的完整性。又如，測定dna待測液的完整性包括如下步驟。
具體地，將dna待測液在冰上融化后，充分混勻后離心，取3μldna樣品與加樣緩沖液混合后加入孔板，其中孔板中的一孔加入2μldnamarker，選用0.6％的瓊脂糖凝膠在120v電壓下電泳45分鐘，電泳至溴酚藍(lán)在凝膠中遷移出適當(dāng)距離，切斷電流，取出凝膠，在紫外燈下檢查并掃描圖像。
s140、采用多重pcr技術(shù)，擴增出b細(xì)胞受體h鏈的cdr3區(qū)。
例如，采用多重pcr技術(shù)，擴增出b細(xì)胞受體h鏈的cdr3區(qū)，包括構(gòu)建dna文庫，其具體包括：
計算所述實驗組及對照組中dna的取用量，稱取，并加入v區(qū)引物及j區(qū)引物多重pcr；
例如，取dna含量為500ng的所述dna待測液，加入設(shè)計好的v區(qū)家族引物和j區(qū)家族引物后用qiagenmμltiplexpcrkit進(jìn)行多重pcr，進(jìn)行30循環(huán)(cycles)。
電泳檢測回收多重pcr產(chǎn)物；
例如，電泳檢測回收100～190bp的多重pcr產(chǎn)物，并使用qiaquickgelextractionkit進(jìn)行回收。
加入末端修護(hù)混合液進(jìn)行末端修護(hù)反應(yīng)，并純化；
例如，在20℃條件下，加入10×endrepairbuffer及endrepairmix，進(jìn)行末端修復(fù)反應(yīng)，并使用qiaquickpcrpurificationkit進(jìn)行純化，得到第二樣本。
將純化后的產(chǎn)物在3’端連上a堿基；
例如，利用nebnextda-tailingmodμle在已補平末端的dna片段3’端加入腺嘌呤(a)。又如，在37℃的條件下，在第二樣本中加入nebnextda-tailingbuffer及nebnextda-tailingenzyme，反應(yīng)30分鐘。
在接頭連接反應(yīng)體系中進(jìn)行接頭連接；
例如，用adapteroligomix和dnaligase配制接頭連接反應(yīng)體系進(jìn)行接頭連接。
通過pcr反應(yīng)富集經(jīng)過接頭修飾的dna片段，并對pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段后，純化回收，得到dna文庫。
在本實施例中，將接頭連接后的產(chǎn)物pcr擴增后，對pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段后，使用qiaquickgelextractionkit進(jìn)行膠純化回收，溶于洗脫緩沖液中。
在本發(fā)明一實施例中，還包括檢測所述dna文庫的插入片段范圍及對所述dna文庫的濃度進(jìn)行定量。
例如，檢測所述基因文庫包括檢測所述基因文庫的插入片段范圍及定量測定所述基因文庫的濃度。又如，使用agilent2100bioanalyzer(agilentdna1000reagents)檢測文庫的插入片段范圍，又如，使用abisteponeplusreal-timepcrsystem(taqmanprobe)對文庫進(jìn)行濃度的定量。
s150、對所述b細(xì)胞受體(bcr)h鏈的cdr3區(qū)進(jìn)行高通量測序，對所述實驗組及對照組中b細(xì)胞受體h鏈進(jìn)行dna分析。
對所述實驗組及對照組中b細(xì)胞受體h鏈進(jìn)行dna分析，包括以下步驟：分析所述實驗組及對照組中b細(xì)胞受體h鏈的各個基因家族的表達(dá)頻率、v-j配對、堿基插入、缺失情況、以及cdr3區(qū)多樣性與長度分布特征，篩選出所述實驗組及對照組中高度克隆性擴增的dna序列、氨基酸序列和v-j組合，及所述實驗組與所述對照組中共有的dna序列、氨基酸序列和v-j組合，并根據(jù)獨特克隆數(shù)、辛普森指數(shù)和香農(nóng)威納系數(shù)分析所述實驗組及對照組的b細(xì)胞受體多樣性差異和克隆表達(dá)差異。
例如，按照預(yù)期上機數(shù)據(jù)量，在檢測合格的基因文庫加入0.5mmol/l的naoh溶液，變性30分鐘，使雙鏈dna片段變性形成單鏈dna。并將變性后的文庫加入到flowcell內(nèi)，與flowcell上的接頭進(jìn)行雜交，然后在簇生成平臺cbot上結(jié)合truseqpeclusterkitv3-cbot-hs試劑完成橋式pcr擴增。最后將制備好的flowcell采用illuminamiseq測序系統(tǒng)和truseqsbskit-hsv3試劑進(jìn)行上機測序。
例如，測序后還包括：對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和預(yù)處理、對所述測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析、對序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析、構(gòu)建免疫組庫、免疫組庫差異性分析及統(tǒng) 計學(xué)分析。
例如，對所述測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和預(yù)處理具體包括：在所述測序數(shù)據(jù)的序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析數(shù)據(jù)下機后，首先對原始數(shù)據(jù)做過濾處理，過濾的過程中，首先過濾掉含有接頭的序列；將平局質(zhì)量低于15(illumina0-41質(zhì)量體系)的reads去掉；對于未知堿基(n堿基)，要求堿基數(shù)不能多于5％；針對序列尾部質(zhì)量較差的序列，截取低質(zhì)量部分(質(zhì)量小于10的堿基)，保證截取后的序列平均質(zhì)量高于15，同時，截取后剩余序列的長度要求大于60。根據(jù)以上過濾條件，獲得過濾后的cleandata。過濾完成后，將pair-end(pe)數(shù)據(jù)的兩條序列拼接成一條完整的contig(片段重疊群)，在讀長是100的情況下，拼接過程分為兩步：1、將兩條序列的尾部比對，尋找匹配序列，這樣的拼接需要最小10個堿基的重疊，重疊區(qū)域堿基的匹配率要大于90％；2、鑒于免疫組庫捕獲區(qū)域的長短不同，在某些情況下會存在端序列被測通的情況，在第1部分尾部拼接剩下的序列中，嘗試用頭部將其繼續(xù)拼接。最終得到的合并后的序列及合并的序列contig的長度分布圖。
例如，利用高通量測序方法(illumina2000基因組分析儀)，對10個esrd患者和6個正常人的外周血b淋巴細(xì)胞bcrh鏈cdr3區(qū)域進(jìn)行測序。正常對照組中平均每個樣本獲得12243860.3條總比對數(shù)(totalreadsnumber)。esrd患病組中平均每個樣本獲得14266181.6條總比對數(shù)。然后對這些原始數(shù)據(jù)做過濾處理(濾掉含有接頭、平均質(zhì)量低于15、n堿基(n表示無法確定堿基信息)多于10％的同時reads)，將pair-end(pe)數(shù)據(jù)的兩條序列拼接成一條完整的contig，最終得到的合并后的序列。對照組中平均有10674277.8條優(yōu)質(zhì)序列，即，bcrh鏈cdr3序列(totalgoodsequences-totalbcrhcdr3sequences),esrd患病組平均有11537754.7條優(yōu)質(zhì)序列。高克隆(highlyenpendedclone)在本分析中的定義是某個cdr3序列的表達(dá)量超過了總的cdr3序列的0.1％。
例如，對所述測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析具體包括：使用milaboratory開發(fā)的mitcr對b細(xì)胞受體進(jìn)行自動校正，校正由pcr、測序等原因帶來的序列錯誤。比對完成后，自動統(tǒng)計cdr3克隆的表達(dá)及插入缺失情況。
例如，對所述測序數(shù)據(jù)的序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析具體包括：根據(jù)比對分析得到 的結(jié)果，得到比對得到v基因序列的最后位點，d基因的起始位點，d基因的終止位點及j基因的起始位點，通過位點信息找到v-d-j插入缺失的堿基并統(tǒng)計其長度分布。根據(jù)比對找到的cdr3區(qū)域，并統(tǒng)計cdr3序列的長度分布。
例如，對所述測序結(jié)果進(jìn)行分析還包括：
1、免疫組庫的構(gòu)建，其具體包括：根據(jù)比對分析得到的結(jié)果，統(tǒng)計每一個克隆的表達(dá)情況，分別統(tǒng)計dna序列，氨基酸序列，v-j組合三種不同分辨率情況下得到的各個樣本的表達(dá)情況。例如，為了衡量樣品的多樣性，分別統(tǒng)計和計算各個樣本的distinctclone數(shù)，辛普森系數(shù)及香農(nóng)威納系數(shù)，三個系數(shù)分別針對dna、氨基酸、v-j組合三種不同的分辨率。對于每一個樣本中每個克隆的表達(dá)情況，按照dna序列、氨基酸序列、v-j組合三種不同分辨率統(tǒng)計每個克隆的表達(dá)。篩選出各細(xì)胞亞群的高度克隆性擴增(頻率大于0.5％)的dna序列，氨基酸序列，v-j組合。在b細(xì)胞發(fā)育過程中，tcr的v、d、j基因片段發(fā)生重排，結(jié)果在v-j片段間或在v-d-j片段間可隨機插入不同數(shù)量的核苷酸，形成具有高度多樣性的可變區(qū)cdr3，其在長度和氨基酸序列上存在較大差異，即cdr3序列決定了一個獨特的tcr克隆型，通過免疫組庫的建立，統(tǒng)計每一個克隆的表達(dá)情況，為后續(xù)的分析提供數(shù)據(jù)支持。
2、免疫組庫的差異分析，其主要包括：樣本多樣性差異和克隆表達(dá)差異兩部分。其中，樣本多樣性差異旨在找出樣品間整體克隆表達(dá)模式的差別，表達(dá)差異則旨在找出差異顯著的克隆。樣本多樣性差異首先針對的是每個樣本計算出的多樣性系數(shù)，即distinct(uniq)clone數(shù)，辛普森和香農(nóng)威納系數(shù)。根據(jù)不同組間樣本屬性，針對的是dna序列、氨基酸序列、v-j組合三種分辨率，統(tǒng)計計算差異顯著性。進(jìn)一步地，在dna序列、氨基酸序列和v-j組合三個層面進(jìn)行分析，使用泊松分布等相應(yīng)的檢驗方案計算出每一個差異對的p值，同時使用fdr和bonferroni對p值做校正。
例如，對bcrh鏈的v區(qū)基因使用頻率分布，并對v基因使用頻率做了t檢驗，其中，ighv1-24在實驗組的頻率為1.098大于對照組0.76166，ighv1-24是上調(diào)基因(p<0.05)。ighv3-20在實驗組的頻率為0.41小于對照組0.685，ighv3-20是下調(diào)的基因(p<0.05)。
又如，對bcrh鏈的d區(qū)基因使用頻率分布，并對d基因使用頻率做了t檢驗，其中，ighd4/or14-4a在實驗組的使用頻率為0.25小于對照組0.35，ighd4/or14-4a是下調(diào)基因(p<0.05)。ighd4/or14-4b在實驗組的頻率為0.208小于對照組0.293，ighd4/or14-4b是下調(diào)的基因(p<0.05)。
又如，對bcrh鏈的j區(qū)基因使用頻率分布，并對j基因使用頻率做了t檢驗，其中，ighj5在實驗組的頻率為11.42小于對照組13.13，ighj5是下調(diào)基因(p<0.05)。
進(jìn)一步地，對bcrh鏈的v區(qū)基因和j區(qū)基因進(jìn)行了組合分析，其中v-j組合(ighv3-20，ighj5)在實驗組的頻率為0.021小于正常組0.083，v-j組合(ighv3-20，ighj5)為下調(diào)基因(p<0.05)；v-j組合(ighv3-64d，ighj3)在實驗組的頻率0小于對照組0.017，v-j組合(ighv3-64d，ighj3)為下調(diào)基因(p<0.05)；v-j組合(ighv3-20，ighj4)在實驗組的頻率為0.137小于對照組0.318，v-j組合(ighv3-20，ighj4)為下調(diào)基因(p<0.05)；v-j組合(ighv1-69，ighj1)在實驗組的頻率為0.042小于對照組0.11，v-j組合(ighv1-69，ighj1)為下調(diào)基因(p<0.05)；v-j組合(ighv3-9，ighj1)在實驗組的頻率為0.073大于對照組0.02，v-j組合(ighv3-9，ighj1)為上調(diào)基因(p<0.05)；v-j組合(ighv1-46，ighj3)在實驗組的頻率為0.216大于對照組0.143，v-j組合(ighv1-46，ighj3)為上調(diào)基因(p<0.05)；v-j組合(ighv3-48，ighj1)在實驗組的頻率為0.057大于對照組0.017，v-j組合(ighv3-48，ighj1)為上調(diào)基因(p<0.05)；v-j組合(ighv2-i，ighj3)在實驗組的頻率為0.054大于對照組0.03，v-j組合(ighv2-i，ighj3)為上調(diào)基因(p<0.05)。
例如，對所述實驗組及對照組中b細(xì)胞受體h鏈進(jìn)行dna分析之后，還包括步驟：得到所述實驗組及對照組的b細(xì)胞抗原受體h鏈cdr3的圖譜模型得到esrd患者的圖譜模型，例如，所述圖譜模型包括：上調(diào)基因：ighv1-24，v-j組合(ighv3-9，ighj1)，v-j組合(ighv1-46，ighj3)，v-j組合(ighv3-48，ighj1)，v-j組合(ighv2-i，ighj3)；下調(diào)基因：ighv3-20，ighd4/or14-4a，ighd4/or14-4b，ighj5，v-j組合(ighv3-20，ighj5)，v-j組合(ighv3-49， ighj5)，v-j組合(ighv3-64d，ighj3)，v-j組合(ighv3-20，ighj4)，v-j組合(ighv1-69，ighj1)。這些上調(diào)基因可能參與某些bcr特異性的b淋巴細(xì)胞克隆性增殖的現(xiàn)象，破壞bcr的多樣性。而bcr的多樣性對健康起著至關(guān)重要的作用，免疫蛋白的亞型越多，越能有效抵抗病原體，亞型越少越容易感染疾病。這些下調(diào)基因可能參與抑制某些bcr特異性的b淋巴細(xì)胞克隆性增殖,而使得某些b淋巴細(xì)胞亞型顯著減少。
上述處理方法通過高通量測序為基礎(chǔ)對終末期腎臟病患者已經(jīng)脫離人體的全血標(biāo)本單個核細(xì)胞bcr的cdr3區(qū)域進(jìn)行分析，有助于闡明esrd的發(fā)病機制，加深對這種疾病病因的理解，進(jìn)而為esrd疾病預(yù)防、診斷和治療提供新的契機。然而，本文的研究數(shù)據(jù)只是初步階段，該圖譜模型只能夠作為后續(xù)分析診斷的參考依據(jù)，如何利用該圖譜模型還有待于進(jìn)一步的醫(yī)學(xué)研究，需要更多的標(biāo)本數(shù)以及更深入的研究才有可能作為更進(jìn)一步的參考依據(jù)。
上述b細(xì)胞抗原受體h鏈cdr3的處理方法，設(shè)計合理可行，能夠有效地獲取作為中間結(jié)果的終末期腎臟患者的相關(guān)信息，這些信息可用于終末期腎臟患者免疫狀態(tài)的后續(xù)分析，對這些信息進(jìn)一步進(jìn)行驗證分析和研究有助于研究排斥反應(yīng)的發(fā)生機制并指導(dǎo)免疫抑制藥物的個體化合理應(yīng)用，進(jìn)而有助于提高終末期腎臟患者的治療。
需要補充的是，本發(fā)明的直接目的不是獲得診斷結(jié)果或健康狀況，而只是對已經(jīng)脫離人體的體液，即外周血，進(jìn)行處理或檢測以獲取作為中間結(jié)果的信息的方法，或處理該信息的方法，根據(jù)目前的醫(yī)學(xué)知識和本發(fā)明所公開的內(nèi)容，從所獲得的信息本身不能夠直接得出疾病的診斷結(jié)果，但是采用對所述實驗組及對照組中b細(xì)胞受體h鏈進(jìn)行dna分析的結(jié)果或所述實驗組及對照組的b細(xì)胞抗原受體h鏈cdr3的圖譜模型，能夠作為中間數(shù)據(jù)對esrd疾病預(yù)防、診斷和治療提供新的契機。
以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。
以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳 細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。