本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微生物來源的抗草甘膦基因的修飾、一種包含抗草甘膦基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建、一種具有商業(yè)潛力的高抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的培育，以及通過雜交方法獲得具有商業(yè)潛力的高抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻新品種的方法。

背景技術(shù)：

水稻是中國(guó)最重要的糧食作物之一，提供了60％人群的主食。雜草是影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)主要通過人工除草結(jié)合翻耕及灌水等管理方式來控制稻田雜草，需要投入大量人力、物力。隨著中國(guó)城鎮(zhèn)化速度加快，許多水稻種植地區(qū)勞動(dòng)力短缺問題日益突出，促使水稻栽培方式由移栽向直播轉(zhuǎn)變，人工除草也逐漸被化學(xué)除草取代?；瘜W(xué)除草是目前最經(jīng)濟(jì)有效的雜草管理方法，可以有效減少糧食產(chǎn)量損失和大大減低勞動(dòng)力成本。草甘膦是20世紀(jì)70年代由孟山都公司開發(fā)的除草劑，可以與莽草酸途徑中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate3-phosphatesynthase，epsps)結(jié)合，抑制芳香族氨基酸的合成(steinrückenandamrhein,1980)，從而可以達(dá)到高效廣譜的除草目的。由于莽草酸途徑只存在于植物、微生物、及低等動(dòng)物apicomplexanparasites中，人和哺乳動(dòng)物中尚未發(fā)現(xiàn)莽草酸途徑的存在，所以草甘膦對(duì)人畜相對(duì)安全(herrmann,1995)。同時(shí)草甘膦具有價(jià)格低廉、在環(huán)境中易降解等特點(diǎn)，因此成為目前使用最廣泛的廣譜型除草劑。由于草甘膦對(duì)水稻有毒性，草甘膦在稻田中的使用比較少，局限于苗前處理。開發(fā)抗草甘膦水稻，可以拓寬稻田除草劑使用的種類、降低生產(chǎn)成本、促進(jìn)直播生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展。

通過轉(zhuǎn)基因方法將抗草甘膦基因轉(zhuǎn)入水稻是培育抗草甘膦水稻的重要途徑?？紤]到抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的生產(chǎn)安全性，獲得的轉(zhuǎn)基因水稻需要在田間生產(chǎn)條件下對(duì)草甘膦呈現(xiàn)高抗性，在使用高劑量草甘膦處理時(shí)轉(zhuǎn)基因水稻的主要農(nóng)藝性狀不發(fā)生改變。盡管目前有較多的抗草甘膦基因，但是只有極少數(shù)基因(玉米tipsepsps、cp4epsps)被應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)，因此培育抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻以新型的高抗草甘膦基因?yàn)榛A(chǔ)。

一些微生物來源的基因由于其序列特征在水稻中的表達(dá)可能存在異常，為了提高微生物來源的基因在水稻中的表達(dá)，需要對(duì)微生物來源的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化以提高植物偏愛密碼 子的使用頻率、去除可以形成復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列、去除富含at堿基的序列同時(shí)去除常用的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)以利于基因工程操作。

通過遺傳轉(zhuǎn)化方法可以獲得大量的轉(zhuǎn)基因水稻植株，但是由于組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的體細(xì)胞變異及外源基因插入產(chǎn)生位置效應(yīng)等因素，需要耗費(fèi)大量的人力、物力和時(shí)間進(jìn)行理想轉(zhuǎn)基因水稻株系的篩選，限制了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。通過雜交手段將理想轉(zhuǎn)基因株系中的外源基因整合特征導(dǎo)入新的水稻品種，可以克服一些水稻品種難以進(jìn)行組織培養(yǎng)、難以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化等問題，加快新型轉(zhuǎn)基因水稻的培育速度。

目前我國(guó)水稻種植中，一半以上的水稻種植面積是雜交稻品種。雜交稻極大的促進(jìn)了我國(guó)水稻產(chǎn)量的增加，對(duì)保障我國(guó)糧食安全具有重要意義。然而雜交稻生產(chǎn)過程中面臨雜種純度低影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)等問題，通過培育抗草甘膦水稻恢復(fù)系品種，可以有效解決雜交稻制種中種子純度低的問題，促進(jìn)雜交水稻生產(chǎn)，為我國(guó)的糧食產(chǎn)量的提高做出貢獻(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種修飾的抗草甘膦基因及抗草甘膦水稻的培育方法。

本發(fā)明所述目的基因是一種人工合成和修飾的抗草甘膦基因i.variabilis-mepsps基因(該基因的原始序列由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)劉子鐸教授課題組克隆并提供(來源于微生物材料)，通過對(duì)原始序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化及人工合成得到新的i.variabilis-epsps蛋白編碼序列i.variabilis-mepsps)。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的秈稻遺傳轉(zhuǎn)化法，將所述的i.variabilis-mepsps基因?qū)胧荏w水稻品種明恢86。通過pcr方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株陽(yáng)性率，利用southernblot確定不同轉(zhuǎn)基因家系i.variabilis-mepsps的拷貝數(shù)，通過反向pcr方法分離得到i.variabilis-mepsps基因側(cè)翼序列，利用northernblot和westernblot確定i.variabilis-mepsps基因的表達(dá)，田間草甘膦抗性試驗(yàn)確定轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)草甘膦的抗性等過程，最終獲得i.variabilis-mepsps基因單拷貝整合在基因間區(qū)且i.variabilis-mepsps基因表達(dá)正常的高抗草甘膦水稻品種gt28。gt28可以與三系雜交中的不育系品種雜交，進(jìn)而獲得高抗草甘膦且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的雜交稻新品種。i.variabilis-mepsps基因在gt28中的整合特征可以通過有性雜交或體細(xì)胞雜交技術(shù)重組到新的水稻種質(zhì)中去，進(jìn)而培育農(nóng)藝性狀優(yōu)良且高抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻衍生新品種(系)。

本發(fā)明公開了i.variabilis-mepsps基因的獲得、植物表達(dá)載體的構(gòu)建、水稻遺傳轉(zhuǎn)化、高抗草甘膦水稻品種gt28的分子鑒定和田間抗草甘膦試驗(yàn)、gt28與不育系品種的雜交及雜 種的分子鑒定、草甘膦抗性鑒定等過程。

本發(fā)明的具體步驟是：

先以pcambia1300質(zhì)粒為基礎(chǔ)載體，構(gòu)建去除選擇標(biāo)記hpt基因的載體p130，再將人工合成的i.variabilis-mepsps基因和帶有5’引導(dǎo)序列utr的葉綠體定位信號(hào)肽編碼序列mctp插入其多克隆位點(diǎn)，形成相應(yīng)的植物表達(dá)載體pu130-i.variabilis-mepsps。將水稻品種明恢86的成熟種子消毒后誘導(dǎo)胚性愈傷組織。將含有表達(dá)載體pu130-i.variabilis-mepsps的農(nóng)桿菌菌株與胚性愈傷組織進(jìn)行共培養(yǎng)后，在含有草甘膦的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性愈傷組織的篩選，將篩選出來的抗性愈傷組織在分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化，當(dāng)分化的小植株長(zhǎng)到2cm左右時(shí)，切掉原生根，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根，當(dāng)新根生長(zhǎng)到2cm左右時(shí)，煉苗后移栽到溫室。這些再生小苗即為t0代轉(zhuǎn)基因植株。

在t0代植株生長(zhǎng)期間，通過pcr方法檢測(cè)i.variabilis-mepsps在轉(zhuǎn)基因植株中的整合，利用southernblot方法檢測(cè)i.variabili-mepsps在轉(zhuǎn)基因植株的拷貝數(shù)，對(duì)i.variabilis-mepsps單拷貝整合的轉(zhuǎn)基因植株分單株收種。在t1代，轉(zhuǎn)基因植株分家系進(jìn)行種植，利用反向pcr的方法確定i.variabilis-mepsps在這些轉(zhuǎn)基因家系中的整合位點(diǎn)，對(duì)i.variabilis-mepsps整合在基因間區(qū)的家系分單株收種。收獲后的種子在含有草甘膦的培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)篩選得到純合的轉(zhuǎn)基因單株。通過進(jìn)一步northernblot和westernblot檢測(cè)、田間草甘膦抗性檢測(cè)等相關(guān)試驗(yàn)，最終獲得具有商業(yè)潛力的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻家系gt28。通過gt28與水稻不育系品種雜交，對(duì)雜種進(jìn)行southernblot、westernblot及田間草甘膦抗性檢測(cè)的過程確定通過雜交方法可以獲得高抗草甘膦雜交稻新品種。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)修飾后得到的i.variabilis-mepsps基因相比原始基因序列g(shù)c含量顯著降低，可以避免i.variabilis-mepsps基因在水稻中異常轉(zhuǎn)錄和翻譯；i.variabilis-mepsps基因相比原始基因序列限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)數(shù)量顯著降低，有利于基因工程操作。

(2)植物表達(dá)載體pu130-i.variabilis-mepsps的t-dna區(qū)不包含i.variabilis-mepsps基因以外的其它篩選標(biāo)記基因，利用該載體獲得轉(zhuǎn)基因植株具有較高的生物安全性。

(3)本發(fā)明中抗草甘膦基因i.variabilis-mepsps基因整合入雜交稻恢復(fù)系品種明恢86基因組中，絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)草甘膦呈現(xiàn)高抗性。

(4)本發(fā)明通過southernblot、側(cè)翼序列分離、northernblot及westernblot方法篩選到i.variabilis-mepsps基因以單拷貝形式整合到基因間區(qū)且表達(dá)正常的轉(zhuǎn)基因株系gt28。gt28 轉(zhuǎn)基因純合后代在受到相當(dāng)于10倍農(nóng)業(yè)推薦劑量草甘膦處理時(shí)，主要農(nóng)藝性狀不發(fā)生改變，可以應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

(5)本發(fā)明培育的gt28與水稻不育系品種的雜交后代在受到相當(dāng)于10倍農(nóng)業(yè)推薦使用劑量草甘膦處理時(shí)，雜交后代的主要農(nóng)藝性狀不發(fā)生改變，可以利用草甘膦有效解決雜交稻制種中偽雜種的問題及降低雜交稻生產(chǎn)過程中控制雜草的生產(chǎn)成本。

(6)i.variabilis-mepsps基因在gt28整合特征可以通過雜交、回交的方式，導(dǎo)入到其它水稻品種，進(jìn)而加快培育農(nóng)藝性狀優(yōu)良且高抗草甘膦的水稻新品種或新品系的速度，避免重新進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化過程中涉及的一系列關(guān)鍵技術(shù)問題(例如一些水稻品種難以進(jìn)行組織培養(yǎng)、或難以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化、或因i.variabilis-mepsps基因拷貝數(shù)及i.variabilis-mepsps基因整合位點(diǎn)確定相對(duì)困難等問題。)

附圖說明

序列表seqidno：1是人工合成和修飾的抗草甘膦基因i.variabilis-mepsps的核苷酸全序列。序列長(zhǎng)度為1374bp。

序列表seqidno：2是在i.variabilis-mepsps基因序列的5’末端加入sphⅰ內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列、3’末端加入終止密碼子taa和sacⅰ內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列后，人工合成的dna片段序列。序列長(zhǎng)度為1389bp。

序列表seqidno：3是經(jīng)過密碼子優(yōu)化的葉綠體定位信號(hào)肽編碼序列(簡(jiǎn)稱mctp)。序列長(zhǎng)度為225bp。

序列表seqidno：4是在mctp的5’末端加入引導(dǎo)序列utr、3’末端加入tgc序列后，人工合成的dna片段序列。序列長(zhǎng)度為340bp。

序列表seqidno：5是植物表達(dá)載體pu130-i.variabilis-mepsps的全長(zhǎng)序列。長(zhǎng)度為10525bp。

序列表seqidno：6是轉(zhuǎn)基因家系gt28水稻外源基因插入位點(diǎn)相鄰的5’基因組側(cè)翼序列。序列長(zhǎng)度為377bp。

序列表seqidno：7是轉(zhuǎn)基因家系gt28水稻的插入外源基因序列。序列長(zhǎng)度為4247bp。序列表seqidno：8是轉(zhuǎn)基因家系是gt28水稻外源基因插入位點(diǎn)相鄰的3’基因組側(cè)翼序列。序列長(zhǎng)度為200bp。

序列表seqidno：9-16是本發(fā)明所涉及到的相關(guān)pcr引物對(duì)的序列。

序列表seqidno：17是來源于微生物的i.variabilis-epsps原基因的核苷酸序列。序列長(zhǎng)度為1374bp。

序列表seqidno：18是來源于微生物的i.variabilis-epsps原基因的蛋白質(zhì)序列。編碼457個(gè)氨基酸。

圖1：是商用載體pcambia1300的圖譜，本發(fā)明利用其骨架構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體。

圖2：本發(fā)明構(gòu)建的植物轉(zhuǎn)化載體pu130-i.variabilis-mepsps結(jié)構(gòu)示意圖。該載體是在pcambia1300的基礎(chǔ)上改造而來，在多克隆位點(diǎn)處連接了外源基因i.variabilis-mepsps的表達(dá)框架及去除了選擇標(biāo)記hpt基因的表達(dá)框架。

圖3：本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因家系gt28的拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果。用hind?；蛘遱acⅰ對(duì)轉(zhuǎn)化載體和水稻基因組dna進(jìn)行酶切，用dig標(biāo)記i.variabilis-mepsps探針進(jìn)行雜交，野生型(非轉(zhuǎn)基因)水稻明恢86沒有雜交條帶，轉(zhuǎn)化載體pu130-i.variabilis-mepsps和gt28有雜交條帶。附圖標(biāo)記說明：m：為dig標(biāo)記marker；泳道1、2和3分別表示轉(zhuǎn)化載體、野生型明恢86、gt28的基因組dna用hindⅲ酶切；泳道4、5和6分別表示轉(zhuǎn)化載體、野生型明恢86、gt28的基因組dna用sacⅰ酶切。

圖4：i.variabilis-mepsps基因在gt28的插入位點(diǎn)分析結(jié)果。i.variabilis-mepsps基因在轉(zhuǎn)基因水稻家系gt28中整合在第11號(hào)染色體上。

圖5：本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因家系gt28的特征性pcr膠圖。附圖標(biāo)記說明：泳道1和2分別以gt28和野生型明恢86基因組dna為模板，用引物gt28-f(見seqidno：15)和iva-2(見seqidno：14)進(jìn)行擴(kuò)增；泳道3和4分別以gt28和野生型明恢86基因組為模板，用引物gt28-r(見seqidno：16)和ubi-2(見seqidno：13)進(jìn)行擴(kuò)增。附圖標(biāo)記說明：m代表dnamarker，從上到下條帶大小依次為5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp和100bp。

圖6：本發(fā)明克隆的i.variabilis-mepsps基因在轉(zhuǎn)基因家系gt28中的表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果。附圖標(biāo)記說明：圖6中的a圖：利用northernblot對(duì)i.variabilis-mepsps在gt28的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行檢測(cè)。雜交使用的探針為dig標(biāo)記的i.variabilis-mepsps探針。圖6中的b圖是rna上樣量。圖6中的c圖是利用westernblot對(duì)i.variabilis-mepsps基因在轉(zhuǎn)基因家系gt28中的翻譯進(jìn)行檢測(cè)(使用的抗體為抗i.variabilis-epsps多克隆抗體，購(gòu)自上海佑隆生物科技有限公司)。 圖6中的d是蛋白的上樣量。

圖7：本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因家系gt28的草甘膦抗性。附圖標(biāo)記說明：gt28表示轉(zhuǎn)i.variabilis-mepsps基因明恢86純合株系；mh86表示野生型明恢86。

圖8：本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因家系gt28與水稻不育系品種雜交后代(ⅱ-32a×gt28)分子檢測(cè)結(jié)果。附圖標(biāo)記說明：圖8中的a圖表示雜種ⅱ-32a×gt28的southernblot結(jié)果。泳道m(xù)代表dig標(biāo)記marker；泳道1-5分別代表轉(zhuǎn)化載體、野生型明恢86、野生型明恢86與不育系ⅱ-32a的雜種(ⅱ-32a×mh86)、gt28、gt28與水稻不育系ⅱ-32a的雜種(ⅱ-32a×gt28)的基因組dna用hindⅲ酶切，用dig標(biāo)記i.variabilis-mepsps探針進(jìn)行雜交的結(jié)果。圖8中的b圖是利用westernblot對(duì)i.variabilis-mepsps基因在gt28與水稻不育系ⅱ-32a的雜種(ⅱ-32a×gt28)中的翻譯進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果(使用的抗體為抗i.variabilis-epsps多克隆抗體，購(gòu)自上海佑隆生物科技有限公司)，在圖8的b圖中：mh86、ⅱ-32a×mh86、gt28和ⅱ-32a×gt28分別代表野生型明恢86、野生型明恢86與不育系ⅱ-32a的雜種、轉(zhuǎn)基因家系gt28、轉(zhuǎn)基因家系gt28與不育系ⅱ-32a的雜種。圖8中的c圖是蛋白的上樣量。

圖9：本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因家系gt28與水稻不育系品種雜交后代(ⅱ-32a×gt28)的草甘膦抗性結(jié)果。附圖標(biāo)記說明：ⅱ-32a×mh86和ⅱ-32a×gt28分別表示野生型明恢86與水稻不育系ⅱ-32a的雜種及轉(zhuǎn)基因家系gt28與不育系ⅱ-32a的雜種。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：i.variabilis-epsps和ctp序列的密碼子優(yōu)化

本發(fā)明所用目的基因i.variabilis-mepsps的原始序列是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)劉子鐸教授課題組從微生物即細(xì)菌isoptericolavariabilis中克隆獲得(基因功能驗(yàn)證也是在微生物中驗(yàn)證的，并沒有在植物特別是沒有在說到轉(zhuǎn)化中進(jìn)行驗(yàn)證，參見文獻(xiàn)：yis,etal.characterizationofanewtypeofglyphosate-tolerant5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthasefromisoptericolavariabilis.jmolcatalb:enzym.2015,111:1-8)，原始基因命名為的i.variabilis-epsps，其核苷酸序列如seqidno：17所示，編碼氨基酸的序列如seqidno：18所示，不同密碼子的使用頻率如表1所示。對(duì)原始i.variabilis-epsps基因進(jìn)行分析，將其應(yīng)用于抗草甘膦水稻的培育可能存在如下問題。(1)原始i.variabilis-epsps基因中堿基a的含量為11.4％，堿基c的含量為40.8％，堿基g的含量為36.1％，堿基t的含量為11.7％，其gc含量高達(dá)76.9％。由于在植物中表達(dá)的基因gc含量應(yīng)介于30％-70％，所以原始的i.variabilis-epsps基因在植物中的表達(dá)可能存在問題；(2)用dnaman軟件對(duì)原始i.variabilis-epsps基因序列進(jìn)行分 析，其序列包含46種限制性內(nèi)切酶的121個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，這些限制性內(nèi)切酶包括一些常用的限制性內(nèi)切酶如nocⅰ、sacⅰ、sphⅰ、xhoⅰ等，所以原始i.variabilis-epsps基因直接應(yīng)用于基因工程操作存在困難；(3)原始i.variabilis-epsps基因中一些非最優(yōu)密碼子如丙氨酸密碼子gcg、脯氨酸密碼子ccc、精氨酸密碼子cgg等過多使用不僅導(dǎo)致序列g(shù)c含量提高而且可能導(dǎo)致翻譯異常；(4)原始i.variabilis-epsps基因中天冬氨酸密碼子全部采用gac，而谷氨酸密碼子全部采用gag，可能導(dǎo)致蛋白翻譯異常。

本發(fā)明以不同密碼子在單子葉植物中的使用頻率為依據(jù)，在不改變編碼氨基酸序列的前提下對(duì)來自微生物源的原始i.variabilis-epsps基因序列進(jìn)行修飾。修飾后的i.variabilis-epsps基因命名為i.variabilis-mepsps，其核苷酸序列如seqidno：1所示，密碼子使用頻率如表1所示。經(jīng)測(cè)定本發(fā)明修飾的i.variabilis-mepsps基因序列中：(1)堿基a的含量為16.0％、堿基c的含量為34.4％、堿基g的含量為32.5％、堿基t的含量為17.2％，其gc含量降低到66.9％，本發(fā)明修飾的i.variabilis-mepsps基因序列與原基因i.variabilis-epsps序列的同源性為80.8％，但是本發(fā)明修飾的基因編碼的氨基酸序列與原始來源基因編碼的氨基酸序列完全相同；(2)用dnaman軟件對(duì)i.variabilis-mepsps基因序列進(jìn)行分析，限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)降低到32種限制性內(nèi)切酶的54個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，不存在一些常用的限制性內(nèi)切酶如nocⅰ、sacⅰ、sphⅰ、xhoⅰ等的識(shí)別位點(diǎn)；(3)丙氨酸、脯氨酸和精氨酸等氨基酸的最優(yōu)密碼子使用頻率提高；(4)42個(gè)密碼子的使用頻率相比原始序列發(fā)生改變，導(dǎo)致修飾后的序列最優(yōu)密碼子與非最優(yōu)密碼子的使用頻率更加均衡，利于蛋白質(zhì)表達(dá)。同時(shí)我們?cè)谛揎椀膇.variabilis-mepsps基因序列的5’末端添加了sphⅰ內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列g(shù)catgc，在3’末端依次添加了終止密碼子taa和sacⅰ內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列g(shù)agctc，構(gòu)成如seqidno：2所示的序列，進(jìn)行化學(xué)合成，用于植物表達(dá)載體構(gòu)建。

本發(fā)明所使用的葉綠體定位信號(hào)肽編碼序列ctp原始序列是擬南芥epsps的葉綠體定位信號(hào)肽的編碼序列，從ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得(genebank:x06613.1)。ctp序列的長(zhǎng)度為225bp，含有22.7％的堿基a、25.3％的堿基c、23.6％的堿基g和28.4％的堿基t。根據(jù)不同密碼子在單子葉植物中的使用頻率對(duì)ctp序列進(jìn)行優(yōu)化得到如seqidno：3所示的序列，我們將該序列命名為mctp序列。mctp序列含有20.9％的堿基a、37.3％的堿基c、26.7％的堿基g和15.1％的堿基t，mctp序列與原始ctp序列的同源性為70.27％，相比原始序列40個(gè)密碼子的使用頻率發(fā)生改變(如表1所示)。在mctp序列的5’末端添加了bamhⅰ內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列g(shù)gatcc和長(zhǎng)度為106bp的引導(dǎo)序列utr，在3’末端添加了tgc序列使mctp序列的3’末端形成sphⅰ內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列g(shù)catgc，最終形成如seqidno：4所示的 序列，進(jìn)行化學(xué)合成。

表1密碼子使用頻率統(tǒng)計(jì)

實(shí)施例2：植物表達(dá)載體的構(gòu)建

本發(fā)明所用的原始轉(zhuǎn)化載體為農(nóng)桿菌ti雙元載體pcambia1300(由澳大利亞pcambia實(shí)驗(yàn)室，centerfortheapplicationofmolecularbiologytointernationalagriculture提供)。用xhoⅰ+ecorⅰ雙酶切pcambia1300(圖1)，然后用t4dna聚合酶抹成平末端，形成中間載體p130。再用hindⅲ+bamhⅰ雙酶切p130連入玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子；進(jìn)一步用bamhⅰ+sacⅰ雙酶切后，連入seqidno：2所示的序列和seqidno：4所示的序列形成最終表達(dá)載體pu130-i.variabilis-mepsps(序列見seqidno：5，構(gòu)建圖見圖2)。將pu130-i.variabilis-mepsps轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌eha105中，將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌菌株置于-70℃保存待用。

實(shí)施例3：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻明恢86的遺傳轉(zhuǎn)化

愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)主要參考現(xiàn)有文獻(xiàn)。通過梯度試驗(yàn)確定水稻品種明恢86(為常規(guī)品種，材料來源由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存)抗性愈傷組織篩選所需最適的草甘膦濃度為200mg/l(農(nóng)桿菌介導(dǎo)的明恢86的轉(zhuǎn)化的操作過程步驟見3.1-3.8所述)。

3.1愈傷組織誘導(dǎo)

將成熟的水稻明恢86種子去殼，然后依次用75％的乙醇處理1min，0.15％氯化汞種子 表面消毒15min；用滅菌水洗種子5次；將種子放在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(ms培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加2.5mg/l2，4-d，0.8g/l水解酪蛋白，0.6g/l脯氨酸，0.5g/l谷氨酰胺，30g/l麥芽糖和3g/lphytagel)；將接種后的種子置于黑暗處培養(yǎng)4周(培養(yǎng)溫度28±1℃)。

3.2愈傷組織繼代培養(yǎng)

挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷組織，放于繼代培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)成分與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同)，黑暗下培養(yǎng)3周(溫度28±1℃)。

3.3農(nóng)桿菌培養(yǎng)

在含有50mg/l卡那霉素的la培養(yǎng)基(10g/ltryptone,5g/lyeastextract,10g/lnacl,15g/l瓊脂粉,ph7.0)預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌2d(溫度為28±1℃)；將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基(1/2ms培養(yǎng)基大量元素成分、1/2ms培養(yǎng)基微量元素成分、1/2ms培養(yǎng)基鐵鹽成分和ms培養(yǎng)基維生素成分基礎(chǔ)上添加2.5mg/l2,4-d，0.8g/l水解酪蛋白，0.6g/l脯氨酸，30g/l麥芽糖，10g/l葡萄糖和100μm乙酰丁香酮，其中本發(fā)明所用到的ms培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分或稱ms基本培養(yǎng)基參見：murashige和skoog，1962文獻(xiàn)，為本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，下同)，在搖床上以28℃，200rpm的條件培養(yǎng)2h。

3.4農(nóng)桿菌侵染

將愈傷組織轉(zhuǎn)移至滅好菌的三角瓶?jī)?nèi)；調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至od600值為0.3左右；將愈傷組織在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30min；轉(zhuǎn)移愈傷組織至滅好菌的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基(1/2ms培養(yǎng)基大量元素成分、1/2ms培養(yǎng)基微量元素成分、1/2ms培養(yǎng)基鐵鹽成分和ms培養(yǎng)基維生素成分基礎(chǔ)上添加2.5mg/l2,4-d，0.6g/l脯氨酸，30g/l麥芽糖，10g/l葡萄糖，100μm乙酰丁香酮和8g/l瓊脂粉)上培養(yǎng)3d(培養(yǎng)溫度19℃)。

3.5愈傷組織洗滌和選擇培養(yǎng)

用滅菌水洗滌愈傷組織10次；然后將愈傷組織浸泡在含500mg/l的羧芐青霉素的滅菌水中30min；轉(zhuǎn)移愈傷組織至滅好菌的濾紙上吸干；再轉(zhuǎn)移愈傷組織至選擇培養(yǎng)基(ms培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加2.5mg/l2，4-d，0.6g/l脯氨酸，200mg/l草甘膦，500mg/l羧芐青霉素，30g/l麥芽糖和8g/l瓊脂粉)上選擇培養(yǎng)3次，每次培養(yǎng)2周。

3.6分化

將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上(ms培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加2mg/lkt，0.2mg/lnaa，2mg/l6-ba，0.2mg/liaa，0.8g/l水解酪蛋白，0.6g/l脯氨酸，30g/l麥芽糖和3g/lphytagel)，光照(2000lux)下培養(yǎng)(溫度26±1℃)。

3.7生根

剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根，然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(1/2ms培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加20g/l蔗糖和3g/lphytagel)中，2000lux光照培養(yǎng)3周(溫度26±1℃)。

3.8移栽

洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保持土壤濕潤(rùn)。

實(shí)施例4：轉(zhuǎn)基因植株的pcr檢測(cè)

采用ctab法提取水稻葉片總dna(文獻(xiàn)：murry&thompson，1980)。pcr引物的設(shè)計(jì)利用primer3軟件完成(http://bioinformatics.hzau.edu.cn/)。用于i.variabilis-mepsps基因擴(kuò)增的兩條引物分別是i.variabilis-mepsps-f(見seqidno：9)和i.variabilis-mepsps-r(見seqidno：10)。用引物i.variabilis-mepsps-f和i.variabilis-mepsps-r擴(kuò)增到得到的pcr產(chǎn)物大小是576bp。pcr反應(yīng)體系：50ng模板dna，2μl10×pcrbuffer(mg²⁺plus)，0.4μldntp(10mm)，0.3μli.variabilis-mepsps–f引物(10μm)，0.3μli.variabilis-mepsps–r引物(10μm)，1utaqdnapolymerase，補(bǔ)ddh2o至20μl。pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s；重復(fù)32個(gè)循環(huán)；72℃終延伸8min。擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)所有t0代植株進(jìn)行pcr檢測(cè)，分析i.variabilis-mepsps在轉(zhuǎn)基因植株中的整合情況。一共檢測(cè)t0代轉(zhuǎn)化植株72株，其中60株轉(zhuǎn)化植株為i.variabilis-mepsps陽(yáng)性植株。

實(shí)施例5：轉(zhuǎn)基因植株i.variabilis-mepsps拷貝數(shù)檢測(cè)

利用southern雜交對(duì)60個(gè)可育的i.variabilis-mepsps家系進(jìn)行i.variabilis-mepsps拷貝數(shù)分析。利用ctab法抽提轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片總dna(參見文獻(xiàn)：murry&thompson，1980)，southern雜交分析方法參見roche公司的地高辛應(yīng)用手冊(cè)?？俤na用hindiii或者sacⅰ酶切，以地高辛標(biāo)記的i.variabilis-mepsps基因的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為雜交探針進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)southern雜交結(jié)果，共確定19個(gè)轉(zhuǎn)基因株系為單拷貝轉(zhuǎn)基因株系。

實(shí)施例6：轉(zhuǎn)基因植株i.variabilis-mepsps整合位點(diǎn)分析

采用反向pcr方法對(duì)19份i.variabilis-mepsps單拷貝整合的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行插入位點(diǎn)及插入序列完整性分析。取1μg基因組dna，用hind?；蛘遱acⅰ進(jìn)行酶切，然后用t4dna連接酶進(jìn)行連接。取0.5μl連接產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)巢式pcr，第一輪pcr反應(yīng)體系為50ng模板dna，10μl2×kodbuffer，4μldntp(8mm)，0.4μl10μmubi-1(序列見seqidno： 11)，0.4μl10μmiva-1(序列見seqidno：12)，0.4μlkodpolymerase，補(bǔ)ddh2o至20μl。pcr反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，98℃變性10s，68℃退火4.5min；重復(fù)30個(gè)循環(huán)；68℃終延伸10min。第二輪pcr反應(yīng)體系為0.5μl第一輪pcr產(chǎn)物，10μl2×kodbuffer，4μldntp(8mm)，0.4μl10μmubi-2(序列見seqidno：13)，0.4μl10μmiva-2(序列見seqidno：14)，0.4μlkodpolymerase，補(bǔ)ddh2o至20μl。pcr反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，98℃變性10s，68℃退火4.5min；重復(fù)38個(gè)循環(huán)；68℃終延伸10min。對(duì)第二輪pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離、回收和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，確定i.variabilis-mepsps在水稻基因組插入位點(diǎn)。根據(jù)插入位點(diǎn)的序列信息，在插入位點(diǎn)的上游和下游分別設(shè)計(jì)引物，利用特征性pcr對(duì)插入位點(diǎn)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。最終確定i.variabilis-mepsps表達(dá)框架插入位點(diǎn)處不存在基因且i.variabilis-mepsps表達(dá)框架中ubiquitin1啟動(dòng)子和35spolya沒有任何缺失的轉(zhuǎn)化家系gt28。i.variabilis-mepsps基因在轉(zhuǎn)基因家系gt28的拷貝數(shù)分析結(jié)果見圖3所示，插入位點(diǎn)分析結(jié)果見圖4所示，特征性pcr結(jié)果見圖5所示。對(duì)轉(zhuǎn)基因家系gt28進(jìn)行特征性pcr的兩對(duì)引物分別是gt28-f/iva-2和gt28-r/ubi-2。ubi-2、iva-2、gt28-f、gt28-r的序列分別如seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15、seqidno：16所示。特征性pcr反應(yīng)體系：50ng模板dna，2μl10×pcrbuffer(mg²⁺plus)，0.4μldntp(10mm)，10μm的引物gt28-f(或者gt28-r)和10μm的引物iva-2(或者ubi-2)各0.3μl，1utaqdnapolymerase，補(bǔ)ddh2o至20μl。pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s；重復(fù)32個(gè)循環(huán)；72℃終延伸8min。擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)施例7：純合陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因單株篩選

對(duì)轉(zhuǎn)基因家系gt28的t1代株系分單株收種，將收獲后的成熟種子在含有草甘膦的培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。草甘膦培養(yǎng)基發(fā)芽試驗(yàn)具體操作步驟如下：將轉(zhuǎn)基因家系gt28的t1代的成熟種子去殼，先用75％的乙醇浸泡消毒1min，然后將75％的乙醇倒掉，再用0.15％的升汞溶液消毒15min；最后將0.15％的升汞倒掉，用滅菌水洗5次。將消毒后的種子分別接種于草甘膦濃度為0和30mg/l的1/2ms培養(yǎng)基上(ms培養(yǎng)基參照：murashige和skoog，1962文獻(xiàn)，為本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基)，2000lux光照培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為26±1℃，培養(yǎng)時(shí)間為16小時(shí)光照/8小時(shí)暗培養(yǎng))5天后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。以理論值計(jì)算，若消毒的種子在含0mg/l草甘膦的條件下應(yīng)具有100％的發(fā)芽活力，則在含草甘膦的1/2ms培養(yǎng)基上，陽(yáng)性純合轉(zhuǎn)基因單株的發(fā)芽率為100％，雜合轉(zhuǎn)基因單株的發(fā)芽率為75％左右，陰性純合單株的發(fā)芽率為0％。 通過草甘膦培養(yǎng)基發(fā)芽試驗(yàn)挑選出gt28純合陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因單株。

實(shí)施例8：i.variabilis-mepsps基因在純合陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)

當(dāng)gt28的純合株系和野生型明恢86生長(zhǎng)至苗期，用trizol試劑(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取rna，用蛋白抽提液(含20mmph8.0tis-hcl，137mmnacl，10％glycerol，1％tritonx-100，2mmedta和2×proteaseinhibitor)提取總蛋白。nouthernblot的分析方法參照roche公司的地高辛應(yīng)用手冊(cè)。i.variabilis-mepsps蛋白多克隆抗體通過在大腸桿菌e.colibl21(de3)中表達(dá)帶有g(shù)st標(biāo)簽的i.variabilis-mepsps蛋白，利用glutathionesepharose4b(購(gòu)自ge公司)純化表達(dá)出的蛋白，將純化的i.variabilis-mepsps蛋白免疫兔子得到。按照常用的westernblot的分析方法進(jìn)行操作。根據(jù)northernblot結(jié)果，本發(fā)明的i.variabilis-mepsps基因在轉(zhuǎn)基因家系gt28純合陽(yáng)性株系中可以正常轉(zhuǎn)錄；根據(jù)westernblot結(jié)果i.variabilis-mepsps基因在轉(zhuǎn)基因家系gt28的純合陽(yáng)性株系中可以翻譯成蛋白(見圖6)。

實(shí)施例9：轉(zhuǎn)基因家系gt28在田間對(duì)草甘膦抗性的檢測(cè)

2015年夏季，在湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)的試驗(yàn)田中進(jìn)行水稻轉(zhuǎn)基因家系gt28對(duì)草甘膦抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)。首先在水稻的分蘗盛期，對(duì)gt28轉(zhuǎn)基因純合和陰性株系噴施840g/ha草甘膦(草甘膦使用濃度為840mg/l)，噴施草甘膦20天后轉(zhuǎn)基因純合株系正常生長(zhǎng)而轉(zhuǎn)基因陰性株系全部死亡(見圖7的右邊)。另外對(duì)gt28轉(zhuǎn)基因純合株系在田間分別用5個(gè)不同劑量的草甘膦進(jìn)行處理，5個(gè)劑量分別為0g/ha、840g/ha、1680g/ha、3360g/ha和8400g/ha(對(duì)應(yīng)的草甘膦使用濃度分別為0mg/l、840mg/l、1680mg/l、3360mg/l和8400mg/l)，每個(gè)處理重復(fù)3次。草甘膦處理過程如下：播種后10d，對(duì)處于三葉期的試驗(yàn)材料進(jìn)行第一次草甘膦處理，處理14d后每個(gè)處理隨機(jī)取20個(gè)水稻植株移栽到田間，移栽15d后進(jìn)行第二次草甘膦處理。對(duì)試驗(yàn)材料的考查內(nèi)容包括水稻成熟期的株高、有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)、每穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、單株產(chǎn)量等。gt28農(nóng)藝性狀考查結(jié)果如表2所示，根據(jù)結(jié)果gt28t3代轉(zhuǎn)基因純合株系的主要農(nóng)藝性狀在各處理間不存在顯著性差異。

表2不同劑量草甘膦處理下gt28轉(zhuǎn)基因純合株系的農(nóng)藝性狀

表1的說明：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用lsd法分析，同一列數(shù)據(jù)后具有相同字母“a”或者“a”分別表示在p＝0.05或者p＝0.01水平上沒有差異。

實(shí)施例10：gt28與不育系水稻品種(ⅱ-32a)的雜交及雜種ⅱ-32a×gt28的分子檢測(cè)

將gt28轉(zhuǎn)基因純合株系播種于田間，10d后播種不育系水稻品種ⅱ-32a(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)，保證gt28和ⅱ-32a花期相遇。待ⅱ-32a抽穗開花后，授予gt28轉(zhuǎn)基因純合株系的花粉。待種子成熟后，收獲雜種ⅱ-32a×gt28。將雜種ⅱ-32a×gt28播種到田間，在苗期提取基因組dna及總蛋白(按常規(guī)方法)，進(jìn)行southernblot和westernblot檢測(cè)，具體步驟分別見實(shí)施例5和實(shí)施例8所述。結(jié)果如圖8所示。本發(fā)明修飾的i.variabilis-mepsps基因可以通過有性雜交的方式由父本進(jìn)入雜交后代，且在雜交后代中正常表達(dá)。

實(shí)施例11：雜種ⅱ-32a×gt28的草甘膦抗性檢測(cè)

在苗期對(duì)非轉(zhuǎn)基因雜種ⅱ-32a×mh86和轉(zhuǎn)基因雜種ⅱ-32a×gt28噴施3360g/ha草甘膦(草甘膦使用濃度為3360mg/l)，噴施7d后非轉(zhuǎn)基因雜種ⅱ-32a×mh86全部死亡，轉(zhuǎn)基因雜種ⅱ-32a×gt28正常生長(zhǎng)(圖9)。在田間對(duì)轉(zhuǎn)基因雜種ⅱ-32a×gt28分別用4個(gè)不同劑量的草甘膦進(jìn)行處理(4個(gè)劑量分別是0g/ha、840g/ha、3360g/ha和8400g/ha；對(duì)應(yīng)的草甘膦使用濃度分別是0mg/l、840mg/l、3360mg/l和8400mg/l)，每個(gè)處理重復(fù)3次。草甘膦處理過程如下：播種后10d，對(duì)處于三葉期的試驗(yàn)材料進(jìn)行第一次草甘膦處理，處理14d后每個(gè)處理隨機(jī)取20個(gè)水稻植株移栽到田間，移栽15d后進(jìn)行第二次草甘膦處理。對(duì)試驗(yàn)材料的考查內(nèi)容包括水稻成熟期的株高、有效穗數(shù)、穗長(zhǎng)、每穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、單株產(chǎn)量等。ⅱ-32a×gt28農(nóng)藝性狀考查結(jié)果如表3所示，根據(jù)結(jié)果ⅱ-32a×gt28的主要農(nóng)藝性狀在各處理間不存在顯著性差異。

表3不同劑量草甘膦處理下ⅱ-32a×my28農(nóng)藝性狀

表2的說明：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用lsd法分析，同一列數(shù)據(jù)后具有相同的字母“a”和“a”分別表示在p＝0.05或者p＝0.01水平上沒有差異。

參考文獻(xiàn)：

1.herrmannkm(1995)theshikimatepathway:earlystepsinthebiosynthesisofaromaticcompounds.plantcell7:907-919

2.murashigetandskoogf(1962)arevisedmediumforrapidgrowthandbio-assayswithtobaccotissuecultures.physiolplant15:473-497；

3.murrymg,thompsonwf(1980)rapidisolationofhighmolecularweightplantdna.nuleicacidsres8:4321-4325；

4.steinrückenhc,amrheinn(1980)theherbicideglyphosateisapotentinhibitorof5-enolpyruvylshikimicacid-3-phosphatesynthase.biochembiophysrescommun94:1207-1212；

5.yis,etal,(2015)characterizationofanewtypeofglyphosate-tolerant5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthasefromisoptericolavariabilis.jmolcatalb:enzym111:1-8。