本發(fā)明屬于藥物合成領(lǐng)域，具體涉及一種具有ALK與EGFR雙重活性的抑制劑、其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：EGFR(EpidermalGrowthFactorReceptor)是跨膜蛋白酪氨酸激酶erbB受體家族的一員。通過(guò)與其配體-例如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的結(jié)合，EGFR在細(xì)胞膜上可以形成同源二聚體，或者與家族中其他的受體(比如erbB2，erbB3，或erbB4)形成異源二聚體。這些二聚體的形成，可引起EGFR細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的酪氨酸殘基磷酸化，從而激活細(xì)胞內(nèi)多個(gè)下游的信號(hào)通路。這些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、生存及抗凋亡中起重要作用。EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路失調(diào)，包括配體及受體的表達(dá)增高、EGFR基因擴(kuò)增以及突變等，可促進(jìn)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，并在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管形成中起重要作用。因此，EGFR是抗癌藥物開(kāi)發(fā)的合理靶點(diǎn)。第一代小分子EGFR抑制劑，包括吉非替尼(易瑞沙TM)和厄洛替尼(特羅凱TM)，在肺癌治療中顯示出較好的療效，已作為一線藥物用于治療伴隨EGFR激活突變的非小細(xì)胞肺癌NSCLC(NewEnglandJournalofMedicine(2008)Vol.358,1160-74，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications(2004)Vol.319,1-11)。相對(duì)于野生型(WT)EGFR而言，激活突變型EGFR(包括L858R和外顯子19缺失突變delE746_A750)對(duì)三磷酸腺苷(ATP)親和力下降，而對(duì)小分子抑制劑的親和力增加，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)第一代EGFR抑制劑例如吉非替尼或厄洛替尼的敏感性增加，達(dá)到靶向治療的目的(Science[2004]第304期，1497-500；NewEnglandJournalofmedicine[2004]第350期，2129-39)。然而，經(jīng)第一代小分子EGFR抑制劑治療10-12月后，幾乎所有的NSCLC患者均產(chǎn)生對(duì)此類(lèi)小分子抑制劑的抗藥性。其耐藥機(jī)制包括EGFR繼發(fā)突變、旁通路激活等。其中半數(shù)患者的耐藥是由于EGFR看門(mén)基因殘基T790M的繼發(fā)突變，從而降低了藥物與靶點(diǎn)的親和力而產(chǎn)生抗藥性，造成腫瘤的復(fù)發(fā)或病情進(jìn)展。鑒于這種突變?cè)诜伟〦GFR靶向治療中產(chǎn)生耐藥的重要性和普遍性，多家藥物研發(fā)公司(輝瑞，BI，AZ等)試圖開(kāi)發(fā)第二代小分子EGFR抑制劑，通過(guò)抑制EGFRT790M突變株來(lái)達(dá)到治療此類(lèi)耐藥的肺癌患者，但均因選擇性差而以失敗告終。即使afatinib已被FDA批準(zhǔn)用于肺癌的治療，但僅用于伴有EGFR激活突變患者的一線治療；而對(duì)伴有EGFRT790M突變患者，由于afatinib對(duì)野生型EGFR具有更強(qiáng)的抑制作用，造成嚴(yán)重的皮膚和胃腸道毒性而限制了給藥劑量，沒(méi)有顯示出治療效果。因此，有必要開(kāi)發(fā)第三代小分子EGFR抑制劑，能高選擇性抑制EGFRT790M突變體，而對(duì)野生型EGFR沒(méi)有或低度活性。由于這一高選擇性，可以大大降低因野生型EGFR抑制引起的皮膚和胃腸道的損傷，以達(dá)到治療EGFRT790M繼發(fā)突變耐藥的腫瘤。另外，保留對(duì)EGFR激活突變體(包括L858REGFR、外顯子19缺失突變delE746_A750)的抑制活性，也很有意義。由于對(duì)野生型EGFR抑制較弱，第三代EGFR抑制劑具有比第一代EGFR抑制劑更好的安全性，有望作為第一線治療，在治療伴隨EGFR激活突變的NSCLC同時(shí)，也可清除初始治療患者可能存在的少量EGFRT790T突變株，以延緩耐藥的發(fā)生。間變性淋巴瘤激酶(ALK)是一種受體酪氨酸蛋白激酶，最早是在間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)的一個(gè)亞型中被發(fā)現(xiàn)的，因此定名為間變性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase，ALK)(Morris,S.W.etal.,Science,1994,263,1281-1284；Shiota,M.etal,Oncogene,1994,9,1567-1574)。ALK蛋白含有1620個(gè)氨基酸，分子量為177千道爾頓(kDa),254個(gè)氨基酸激酶結(jié)構(gòu)域由1123至1376位氨基酸殘基組成，在此之前是一個(gè)由氨基酸組成的短跨膜區(qū)。在小鼠體內(nèi)的表達(dá)形式提示其在中樞和以及外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起作用；在果蠅中發(fā)現(xiàn)ALK以配體結(jié)合的形式促進(jìn)腸管肌肉組織形成，哺乳動(dòng)物配體尚未確定；人類(lèi)視網(wǎng)膜中檢測(cè)到ALK蛋白質(zhì)。ALK基因敲除的小鼠生命周期和生命活動(dòng)未見(jiàn)明顯異常(Webb,T.R.etal.,ExpertRev.Anti-cancerTher.,2009,9,331-356),預(yù)示著ALK抑制將不會(huì)對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的傷害。2007年兩個(gè)獨(dú)立研究小組在非小細(xì)胞肺癌中分別鑒定出ALK基因重排。其中一組研究人員開(kāi)發(fā)了逆轉(zhuǎn)錄病毒cDNA表達(dá)庫(kù)用于篩選新癌基因。他們轉(zhuǎn)染了提取自一位預(yù)先篩選顯示KRAS和EGFR突變陰性的62歲日本男性吸煙者肺腺癌的cDNA文庫(kù)，并設(shè)計(jì)生成了轉(zhuǎn)基因小鼠，在肺泡細(xì)胞中特異性表達(dá)EML4-ALK，由此生成了許多肺腺癌結(jié)節(jié)。使用ALK抑制劑治療這些轉(zhuǎn)基因小鼠導(dǎo)致腫瘤負(fù)荷相比于未治療的小鼠減小。大部分小鼠很快在1個(gè)月內(nèi)死亡。使用相同ALK抑制劑治療導(dǎo)致肺臟無(wú)EML4-ALK/3T3細(xì)胞浸潤(rùn)且生存期延長(zhǎng)。此研究有力證實(shí)了EML4-ALK是非小細(xì)胞肺癌中唯一的驅(qū)動(dòng)突變，并且在體內(nèi)抑制EML4-ALK活性會(huì)導(dǎo)致肺癌負(fù)荷減少(Soda,M.,Choi,Y.L.,Enomoto,M.,etal.,Nature，2007：448)。EML4-ALK融合出現(xiàn)在大約3-5％的非小細(xì)胞肺癌中，具體因研究的人群和使用的ALK檢測(cè)方法的不同而有所差別,是非小細(xì)胞肺癌中的唯一驅(qū)動(dòng)突變基因。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，抑制ALK基因可以有效阻止ALK呈陽(yáng)性的淋巴瘤細(xì)胞和肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，顯示出ALK抑制劑在這類(lèi)腫瘤治療中具有重要價(jià)值(Piva,R.etal.,Blood,2006,107,689-697；Galkin,A.V.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2007,104,270-275；Koivunen,J.P.etal.,Clin.CancerRes.,2008,14,4275-4238))。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明人在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)一類(lèi)具有式(I)結(jié)構(gòu)N-(3-((4-((2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯?；０奉?lèi)似物具有抑制L858REGFR突變體、T790MEGFR突變體和外顯子19缺失激活突變體的活性，同時(shí)該系列化合物也具有ALK抑制活性。因此該系列化合物可以用來(lái)治療單獨(dú)或部分地由EGFR突變體以及ALK活性介導(dǎo)疾病，例如在預(yù)防與治療癌癥尤其是非小細(xì)胞肺癌藥物中的具有廣泛應(yīng)用。本發(fā)明一方面提供一種具有如下式(I)化合物N-(3-((4-((2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯?；０奉?lèi)似物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受鹽：其中，R1選自C1-8烷基、C3-8環(huán)烷基，任選進(jìn)一步被一個(gè)或多個(gè)選自氟、氯、溴、碘、羥基、C1-8烷基、C1-8烷氧基、鹵取代C1-8烷氧基、C3-8環(huán)烷基或C3-8環(huán)烷氧基的取代基所取代；R2選自氫、氘、氟、氯、溴、碘、氰基、硝基、C1-8烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、C(O)R5、C(O)OR5或P(O)R6R7；R3選自如下結(jié)構(gòu)：R4選自氫、氟、氯、溴、碘、C1-8烷基、C3-8環(huán)烷基、鹵取代C1-8烷基、C1-8烷氧基、C3-8環(huán)烷氧基、鹵取代C1-8烷氧基、苯基或?qū)谆交籖5、R6、R7各自獨(dú)立的選自C1-8烷基、C3-8環(huán)烷基、鹵取代C1-8烷基、C1-8烷氧基、氨基或二C1-8烷基氨基。作為優(yōu)選的方案，所述的N-(3-((4-((2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺類(lèi)似物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受鹽，C1-8烷基選自C1-6烷基，優(yōu)選C1-3烷基；鹵取代C1-8烷基選自鹵取代C1-6烷基，優(yōu)選鹵取代C1-3烷基；C1-8烷氧基選自C1-6烷氧基，優(yōu)選C1-3烷氧基；鹵取代C1-8烷氧基選自鹵取代C1-6烷氧基，優(yōu)選鹵取代C1-3烷氧基；C3-8環(huán)烷基選自C3-6環(huán)烷基。作為進(jìn)一步優(yōu)選的方案，所述的N-(3-((4-((2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯?；０奉?lèi)似物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受鹽，R3選自：R1、R2、R4、R5、R6、R7如式(I)化合物所定義。作為更進(jìn)一步優(yōu)選的方案，所述的N-(3-((4-((2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯?；０奉?lèi)似物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受鹽，R1選自C1-4烷基、C3-6環(huán)烷基，任選進(jìn)一步被一個(gè)或多個(gè)選自氟、氯、溴、碘、羥基、C1-8烷基、C1-8烷氧基、鹵取代C1-8烷氧基、C3-8環(huán)烷基或C3-8環(huán)烷氧基的取代基所取代；R2、R3、R4、R5、R6、R7如式(I)化合物所定義。作為更進(jìn)一步優(yōu)選的方案，所述的N-(3-((4-((2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺類(lèi)似物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受鹽，R1選自甲基、乙基、異丙基、三氟甲基、二氟甲基；R2、R3、R4、R5、R6、R7如式(I)化合物所定義。作為更進(jìn)一步優(yōu)選的方案，所述的N-(3-((4-((2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯?；０奉?lèi)似物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受鹽，R2選自氫、氟、氯、氰基、C1-3烷氧基、三氟甲基或三氟甲氧基。作為更進(jìn)一步優(yōu)選的方案，所述的的N-(3-((4-((2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯?；０奉?lèi)似物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受鹽，R4選自氫、氟、氯、C1-3烷基、C1-3烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基或二氟甲氧基。作為最優(yōu)選的方案，所述的N-(3-((4-((2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯?；０奉?lèi)似物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受鹽，選自如下化合物：本發(fā)明另一方面提供了前述N-(3-((4-((2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯?；０奉?lèi)似物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受鹽的制備方法，包括如下步驟：其中，X1、X2選自氟、氯、溴或碘；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7如式(I)化合物所定義。本發(fā)明再一方面提供一種藥物組合物，其包括治療有效劑量的前述N-(3-((4-((2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯?；０奉?lèi)似物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受鹽及可藥用的載體。本發(fā)明再一方面提供了一種前述N-(3-((4-((2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯?；０奉?lèi)似物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受鹽，或前述藥物組合物在制備用于治療對(duì)EGFR突變體、外顯子19缺失激活突變體活性介及ALK導(dǎo)疾病的治療藥物中的應(yīng)用。作為進(jìn)一步優(yōu)選的方案，前述N-(3-((4-((2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯?；０奉?lèi)似物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受鹽，或前述藥物組合物在制備用于治療單獨(dú)或部分地由EGFR突變體活性以及ALK介導(dǎo)疾病的治療藥物中的應(yīng)用。作為更進(jìn)一步優(yōu)選的方案，所述EFGR突變體選自L858REGFR突變體或T790MEGFR突變體。作為更進(jìn)一步優(yōu)選的方案，前述N-(3-((4-((2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯?；０奉?lèi)似物、其立體異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受鹽，或前述藥物組合物在制備用于治療癌癥藥物中的應(yīng)用。作為更進(jìn)一步優(yōu)選的方案，所述癌癥選自卵巢癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤,黑色素瘤、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、肺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)、甲狀腺癌、膽管癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、急性髓細(xì)胞白血病(AML)、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤或間皮瘤；優(yōu)選自非小細(xì)胞肺癌。具體實(shí)施方式詳細(xì)說(shuō)明：除非有相反陳述，下列用在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中的術(shù)語(yǔ)具有下述含義?！癈1-8烷基”指包括1至8個(gè)碳原子的直鏈烷基和含支鏈烷基，烷基指飽和的脂族烴基團(tuán)，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、2，2-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2，3-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2，2-二甲基己基、3，3-二甲基己基、4，4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基或其各種支鏈異構(gòu)體等。“環(huán)烷基”指飽和或部分不飽和單環(huán)或多環(huán)環(huán)狀烴取代基，“C3-8環(huán)烷基”指包括3至8個(gè)碳原子的環(huán)烷基，例如：?jiǎn)苇h(huán)環(huán)烷基的非限制性實(shí)施例包含環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)己二烯基、環(huán)庚基、環(huán)庚三烯基、環(huán)辛基等。多環(huán)環(huán)烷基包括螺環(huán)、稠環(huán)和橋環(huán)的環(huán)烷基?！奥莪h(huán)烷基”指單環(huán)之間共用一個(gè)碳原子(稱螺原子)的多環(huán)基團(tuán)，這些可以含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵，但沒(méi)有一個(gè)環(huán)具有完全共軛的π電子系統(tǒng)。根據(jù)環(huán)與環(huán)之間共用螺原子的數(shù)目將螺環(huán)烷基分為單螺環(huán)烷基、雙螺環(huán)烷基基或多螺環(huán)烷基，螺環(huán)烷基的非限制性實(shí)施例包含：“稠環(huán)烷基”指系統(tǒng)中的每個(gè)環(huán)與體系中的其他環(huán)共享毗鄰的一對(duì)碳原子的全碳多環(huán)基團(tuán)，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)可以含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵，但沒(méi)有一個(gè)環(huán)具有完全共軛的π電子系統(tǒng)。根據(jù)組成環(huán)的數(shù)目可以分為雙環(huán)、三環(huán)、四環(huán)或多環(huán)稠環(huán)烷基，稠環(huán)烷基的非限制性實(shí)施例包含：“橋環(huán)烷基”指任意兩個(gè)環(huán)共用兩個(gè)不直接連接的碳原子的全碳多環(huán)基團(tuán)，這些可以含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵，但沒(méi)有一個(gè)環(huán)具有完全共軛的π電子系統(tǒng)。根據(jù)組成環(huán)的數(shù)目可以分為雙環(huán)、三環(huán)、四環(huán)或多環(huán)橋環(huán)烷基，橋環(huán)烷基的非限制性實(shí)施例包含：所述環(huán)烷基環(huán)可以稠合于芳基、雜芳基或雜環(huán)烷基環(huán)上，其中與母體結(jié)構(gòu)連接在一起的環(huán)為環(huán)烷基，非限制性實(shí)施例包括茚滿基、四氫萘基、苯并環(huán)庚烷基等?！巴檠趸敝?O-(烷基)，其中烷基的定義如上所述?！癈1-8烷氧基”指含1-8個(gè)碳的烷基氧基，非限制性實(shí)施例包含甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等?！碍h(huán)烷氧基”指和-O-(未取代的環(huán)烷基)，其中環(huán)烷基的定義如上所述。“C3-8環(huán)烷氧基”指含3-8個(gè)碳的環(huán)烷基氧基，非限制性實(shí)施例包含環(huán)丙氧基、環(huán)丁氧基、環(huán)戊氧基、環(huán)己氧基等?！胞u取代的C1-8烷基”指烷基上的氫任選的被氟、氯、溴、碘原子取代的1-8個(gè)碳烷基基團(tuán)，例如二氟甲基、二氯甲基、二溴甲基、三氟甲基、三氯甲基、三溴甲基等?！癈(O)R5”指R5取代的羰基?！癙(O)R6R7”指R6、R7取代的磷酰基，R6、R7任選相同或不同的取代基。“二C1-8烷基氨基”指兩個(gè)C1-8烷基取代的氨基基團(tuán)?！癟HF”指四氫呋喃?！癉CM”指二氯甲烷。“DMF”指N、N-二甲基甲酰胺?！癉IPEA”指二異丙基乙胺?！叭芜x”或“任選地”意味著隨后所描述地事件或環(huán)境可以但不必發(fā)生，該說(shuō)明包括該事件或環(huán)境發(fā)生或不發(fā)生地場(chǎng)合。例如，“任選被烷基取代的雜環(huán)基團(tuán)”意味著烷基可以但不必須存在，該說(shuō)明包括雜環(huán)基團(tuán)被烷基取代的情形和雜環(huán)基團(tuán)不被烷基取代的情形。“取代的”指基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)氫原子彼此獨(dú)立地被相應(yīng)數(shù)目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學(xué)位置，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在不付出過(guò)多努力的情況下確定(通過(guò)實(shí)驗(yàn)或理論)可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的氨基或羥基與具有不飽和(如烯屬)鍵的碳原子結(jié)合時(shí)可能是不穩(wěn)定的。“藥物組合物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學(xué)上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學(xué)組分的混合物，以及其他組分例如生理學(xué)/可藥用的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進(jìn)對(duì)生物體的給藥，利于活性成分的吸收進(jìn)而發(fā)揮生物活性。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說(shuō)明，但決非限制本發(fā)明，本發(fā)明也并非僅局限于實(shí)施例的內(nèi)容。本發(fā)明的化合物結(jié)構(gòu)是通過(guò)核磁共振(NMR)或/和液質(zhì)聯(lián)用色譜(LC-MS)來(lái)確定的。NMR化學(xué)位移(δ)以百萬(wàn)分之一(ppm)的單位給出。NMR的測(cè)定是用BrukerAVANCE-400核磁儀，測(cè)定溶劑為氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)，氘代甲醇(CD3OD)和氘代氯仿(CDCl3)內(nèi)標(biāo)為四甲基硅烷(TMS)。液質(zhì)聯(lián)用色譜LC-MS的測(cè)定用Agilent1200InfinitySeries質(zhì)譜儀。HPLC的測(cè)定使用安捷倫1200DAD高壓液相色譜儀(SunfireC18150×4.6mm色譜柱)和Waters2695-2996高壓液相色譜儀(GiminiC18150×4.6mm色譜柱)。薄層層析硅膠板使用煙臺(tái)黃海HSGF254或青島GF254硅膠板，TLC采用的規(guī)格是0.15mm～0.20mm，薄層層析分離純化產(chǎn)品采用的規(guī)格是0.4mm～0.5mm。柱層析一般使用煙臺(tái)黃海硅膠200～300目硅膠為載體。本發(fā)明實(shí)施例中的起始原料是已知的并且可以在市場(chǎng)上買(mǎi)到，或者可以采用或按照本領(lǐng)域已知的方法來(lái)合成。在無(wú)特殊說(shuō)明的情況下，本發(fā)明的所有反應(yīng)均在連續(xù)的磁力攪拌下，在干燥氮?dú)饣驓鍤夥障逻M(jìn)行，溶劑為干燥溶劑。實(shí)施例化合物的制備實(shí)施例一：N-(5-((4-((5-氯-2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯?；０返闹苽涞谝徊剑?-氯-2-(異丙基硫代)苯胺的制備將5-氯-2-氨基苯硫酚(500mg,3.13mmol),碳酸鉀(973mg,7.04mmol)置于50mL圓底瓶中,加入15mlDMF，在攪拌下加入異丙基溴(0.5mL),將混合物在室溫下攪拌過(guò)夜，加入50毫升水，乙酸乙酯萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，蒸出溶劑，殘留物經(jīng)硅膠柱層析得到淺黃色油狀粘稠液體(0.520g)。第二步：4-氯-2-(異丙基磺酰)苯胺的制備將4-氯-2-(異丙基硫代)苯胺(520mg,3.33mmol)和間氯過(guò)氧苯甲酸(mCPBA)(85％,1.33g)置于100mL圓底瓶中,加入15ml二氯甲烷，將混合物在室溫下攪拌5小時(shí)，加入10毫升飽和亞硫酸鈉溶液攪拌10分鐘，加入20毫升飽和碳酸氫鈉溶液攪拌10分鐘，二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，蒸出溶劑，殘留物再經(jīng)柱層析得產(chǎn)物4-氯-2-(異丙基磺酰)苯胺(320mg)。第三步：2-氯-N-(5-氯-2-(異丙基磺酰)苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺的制備將4-氯-2-(異丙基磺酰)苯胺(710mg,3.04mmol)溶于無(wú)水DMF中，0℃下，加入氫化鈉(243mg,6.08mmol)，在0℃下攪拌半小時(shí)，將此混懸物滴加到溶有2,4-二氯-5-三氟甲基嘧啶(988mg,4.56mmol)的5毫升DMF溶液中，緩慢升至室溫，攪拌過(guò)夜。加水淬滅反應(yīng)，蒸除溶劑，殘留物經(jīng)反相柱層析分離純化(水：乙腈＝40:60)得淺黃色固體(200mg)。LC-MS：tR＝3.18min，414.1([M+H]+)。第四步：N-4-(5-氯-2-(異丙基磺酰)苯基)-N-2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺的制備將2-氯-N-(5-氯-2-(異丙基磺酰)苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺(200mg,0.483mmol)與4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(135mg,0.724mmol)溶于1,4-二氧六環(huán)(15ml)中，加入對(duì)甲苯磺酸(166mg,0.966mmol)，加熱至140℃反應(yīng)三小時(shí)，冷卻至室溫，蒸除溶劑，剩余物經(jīng)反相柱層析分離純化得N-4-(5-氯-2-(異丙基磺酰)苯基)-N-2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺(150mg)。LC-MS：tR＝3.24min，564.1([M+H]+)。第五步：N-4-(5-氯-2-(異丙基磺酰)苯基)-N2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺的制備將N-4-(5-氯-2-(異丙基磺酰)苯基)-N-2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺(150mg)溶于DMF(5ml)中，加入0.2mL三甲基乙二胺，加熱至125℃反應(yīng)2小時(shí)，蒸除溶劑，得粗產(chǎn)品(120mg)。第六步：N-4-(4-((5-氯-2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)-N1-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺的制備將上一步反應(yīng)得到的粗產(chǎn)品(120mg)溶于乙醇中，加入氯化銨(100mg)，鐵粉(80mg)，加熱回流反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，過(guò)濾，收集濾液，蒸除濾液溶劑，加大量水稀釋剩余物，異丙醇-二氯甲烷混合溶劑(1:3)萃取水相三次，合并有機(jī)相，蒸除有機(jī)相溶劑，得粗產(chǎn)品(60mg)。LC-MS：tR＝2.48min，616.3([M+H]+)。第七步：N-(5-((4-((5-氯-2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯?；０返闹苽鋵⑸弦徊椒磻?yīng)得到的粗產(chǎn)品(60mg,0.097mmol)溶于5毫升無(wú)水四氫呋喃中，0℃下，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入0.1mL二異丙基乙基胺，1M丙烯酰氯四氫呋喃溶液(0.15mL)緩慢滴加入上述溶液中，0℃下反應(yīng)半小時(shí)，加入2毫升飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅反應(yīng)，蒸除四氫呋喃，剩余物經(jīng)反相柱層析分離純化得最終產(chǎn)品(25.6mg)。LC-MS：tR＝2.50min，670.3([M+H]+)；1HNMR(CD3OD，400MHz)δ:8.47(s,1H),8.27(br,1H),8.09(s,1H),7.85(d,1H),7.35(d,1H),6.98(s,1H),6.56(m,1H),6.33(m,1H),5.83(d,1H),3.96(s,3H),3.46(m,2H),3.37(m,1H),3.31(m,2H),2.91(s,6H),2.70(s,3H),1.29(d,6H)；F-NMR:-62.49。實(shí)施例二：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制備第一步：異丙基(2-硝基-4-(三氟甲基)苯基)硫烷的制備取100mL單口瓶，加入1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1g)和15mLDMF，碳酸鉀(3.3g)和異丙硫醇(0.72g)分別加入上述溶液中，50℃攪拌3小時(shí)，冷卻至0℃，加入2mlNaOH(1M)水溶液，乙酸乙酯萃取，干燥，濃縮，得到白色固體(2.5g)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.44(s,1H),7.76(d,J＝8.5Hz,1H),7.76(d,J＝8.5Hz,1H),7.58(d,J＝8.5Hz,1H),7.58(d,J＝8.5Hz,1H),3.62(dt,J＝13.3,6.7Hz,1H),3.62(dt,J＝13.3,6.7Hz,1H),1.44(d,J＝6.7Hz,6H)。第二步：1-(異丙基磺酰)-2-硝基-4-(三氟甲基)苯的制備取50mL單口瓶，依次加入異丙基(2-硝基-4-(三氟甲基)苯基)硫烷(2,5g)，間氯過(guò)氧苯甲酸(4g)，50ml二氯甲烷，該混合物在室溫下攪拌5小時(shí)，加入飽和碳酸氫鈉水溶液，二氯甲烷萃取，濃縮得到白色固體(2g)。第三步：1-(異丙基磺酰)-2-氨基-4-(三氟甲基)苯的制備取100mL單口瓶，依次加入1-(異丙基磺酰)-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(900mg)，鐵粉(1.7g)，氯化銨(3.27g)，50ml乙醇和2ml水。在70℃攪拌1小時(shí)，過(guò)濾，濾液濃縮，乙酸乙酯萃取，得到黃色固體(840mg)。第四步：2-氯-N-(2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺的制備將1-(異丙基磺酰)-2-氨基-4-(三氟甲基)苯(800mg,2.993mmol)溶于無(wú)水DMF(10mL)中，在冰浴下分批加入NaH(359mg,8.979mmol)，攪拌20分鐘后，將所得混懸液加入2,4-二氯-5-三氟甲基嘧啶(714mg,3.292mmol)的DMF(5mL)中，反應(yīng)在冰浴下攪拌2小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)完全。反應(yīng)液用飽和NH4Cl(3mL)淬滅，濃縮干后，用二氯甲烷(20mL),水(20mL)分層，有機(jī)相干燥過(guò)濾濃縮，剩余物通過(guò)快速柱層析得到2-氯-N-(2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺(130mg,9.7％)。第五步：N-2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺的制備將2-氯-N-(2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺(130mg,0.29mmol),4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(54mg,0.29mmol),對(duì)甲苯磺酸(55mg,0.29mmol)溶于2-戊醇(10mL)。反應(yīng)加熱至120℃，攪拌3小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)完全，反應(yīng)液濃縮，剩余物加入水(10mL),甲醇(5mL)，混合物攪拌10分鐘后，過(guò)濾，濾餅用甲基叔丁基醚洗后得到粗品(170mg)。第六步：N-2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺的制備將上一步反應(yīng)得到的粗產(chǎn)品(170mg,0.285mmol),三乙胺(86mg,0.854mmol),N,N,N-三甲基乙二胺(87mg,0.854mmol)溶于DMF(5mL)中，反應(yīng)加熱至120℃攪拌1小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)，反應(yīng)濃縮干，剩余物通過(guò)快速柱層析得到N-2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺(110mg,57％)。第七步：N-1-(2-(二甲氨基)乙基)-N-4-(4-((2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺的制備把N-2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺(110mg,0.162mmol)溶于甲醇(20mL)，加入Pd/C(20mg)。反應(yīng)在氫氣下攪拌10min，LCMS顯示反應(yīng)完全，反應(yīng)液過(guò)濾，濾液旋干，剩余物通過(guò)反相柱純化得到N-1-(2-(二甲氨基)乙基)-N-4-(4-((2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺(80mg,76.2％)。第八步：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯?；０返闹苽鋵-1-(2-(二甲氨基)乙基)-N-4-(4-((2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺(80mg,0.123mmol)，三乙胺(37mg,0.369mmol)溶于四氫呋喃(30mL),反應(yīng)液冷卻至-30℃。氮?dú)獗Ｗo(hù)下，緩慢加入丙烯酰氯(0.37mL,1.0MinTHF)。反應(yīng)在-30℃下攪拌30分鐘，反應(yīng)結(jié)束,加入甲醇(5mL)繼續(xù)攪拌10分鐘，反應(yīng)液濃縮干，剩余物先經(jīng)過(guò)制備板分離后再經(jīng)反相柱純化，得到最終產(chǎn)品(35mg,40.4％)。m/z:704.5；1HNMR(400MHz,MeOD)δ:8.51(s,2H),8.20(s,1H),8.08(d,J＝8.2Hz,1H),7.65(d,J＝7.9Hz,1H),6.96(s,1H),6.57(dd,J＝16.9,10.2Hz,1H),6.28(d,J＝17.1Hz,1H),5.80(d,J＝11.2Hz,1H),3.94(s,3H),3.49(dd,J＝11.6,4.9Hz,1H),3.43(t,J＝7.7Hz,2H),3.29(t,J＝5.7Hz,2H),2.88(s,6H),2.67(s,3H),1.34(d,J＝6.8Hz,6H)。實(shí)施例三：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯?；０返闹苽涞谝徊剑?-(異丙基磺酰)-4-甲基-2-硝基苯的制備將2-氟-5甲基硝基苯(3.0g,19.355mmol)溶于DMF(50mL)中，加入異丙硫醇(2.95g,38.71mmol)和碳酸鉀(8.01g,58.065mmol)。反應(yīng)60度攪拌2小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)完全。反應(yīng)液溶于二氯甲烷，水洗，飽和氯化鈉洗，有機(jī)相干燥過(guò)濾，濃縮，殘留物溶于DCM(100mL)中，分批加入間氯過(guò)氧苯甲酸(8.35g,48.387mmol)。攪拌16小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)完全，反應(yīng)液飽和亞硫酸鈉(20mL)淬滅，有機(jī)相用飽和碳酸氫鈉水溶液(3X15mL)洗，有機(jī)相干燥過(guò)濾，濃縮，剩余物通過(guò)快速硅膠柱純化得到1-(異丙基磺酰)-4-甲基-2-硝基苯(4.2g,91.3％)。第二步：2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯胺的制備將1-(異丙基磺酰)-4-甲基-2-硝基苯(4.2g,17.263mmol)，氯化銨(9.236g，172.6mmol)溶于乙醇(90mL),水(30mL),加入還原鐵粉(9.667g,172.6mmol),加熱回流3小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)完全，反應(yīng)液過(guò)濾，濾液濃縮，剩余物水相用DCM(3X10mL)萃取，有機(jī)相干燥過(guò)濾，濃縮，通過(guò)快速硅膠柱純化得到2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯胺(3g,81.5％)。第三步：2-氯-N-(2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺的制備將2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯胺(875mg,4.102mmol)溶于無(wú)水DMF(15mL)中，在冰浴下分批加入NaH(492mg,12.307mmol)，攪拌20分鐘后，將所得混懸液加入2,4-二氯-5-三氟甲基嘧啶(979mg,4.512mmol)的DMF(10mL)中，反應(yīng)在冰浴下攪拌2小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)完全。反應(yīng)液用飽和NH4Cl(3mL)淬滅，濃縮干后，用二氯甲烷(20mL),水(20mL)分層，有機(jī)相干燥過(guò)濾濃縮，剩余物通過(guò)快速柱層析得到2-氯-N-(2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺(211mg,13.1％)。第四步：N-2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺的制備將2-氯-N-(2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺(211mg,0.536mmol),4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(99.7mg,0.536mmol),對(duì)甲苯磺酸(102mg,0.536mmol)溶于2-戊醇(10mL)。反應(yīng)加熱至120℃，攪拌3小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)完全，反應(yīng)液濃縮，剩余物加入水(10mL),甲醇(5mL)，混合物攪拌10分鐘后，過(guò)濾，濾餅用甲基叔丁基醚洗后得到粗品(291mg)。第五步：N-2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺的制備將上一步反應(yīng)得到的粗品(291mg,0.535mmol),三乙胺(163mg,1.606mmol),N,N,N-三甲基乙二胺(164mg,1.606mmol)溶于DMF(5mL)中，反應(yīng)加熱至120℃攪拌1小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)，反應(yīng)濃縮干，剩余物通過(guò)快速柱層析得到N-2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺(78mg,23.3％)。第六步：N-1-(2-(二甲氨基)乙基)-N-4-(4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺的制備把N-2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺(78mg,0.125mmol)溶于甲醇(20mL)，加入Pd/C(20mg)。反應(yīng)在氫氣下攪拌10min，LCMS顯示反應(yīng)完全，反應(yīng)液過(guò)濾，濾液旋干，剩余物通過(guò)反相柱純化得到N-1-(2-(二甲氨基)乙基)-N-4-(4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺(65mg,87.8％)。第七步：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯?；０返闹苽鋵-1-(2-(二甲氨基)乙基)-N-4-(4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺(65mg,0.109mmol)，三乙胺(33mg,0.327mmol)溶于四氫呋喃(30mL),反應(yīng)液冷卻至-30℃。氮?dú)獗Ｗo(hù)下，緩慢加入丙烯酰氯(0.33mL,1MinTHF)。反應(yīng)在-30℃下攪拌30分鐘，反應(yīng)結(jié)束,加入甲醇(5mL)繼續(xù)攪拌10分鐘，反應(yīng)液濃縮干，剩余物先經(jīng)過(guò)制備板分離后在經(jīng)反相過(guò)柱純化，得到最終產(chǎn)品(5mg,7.04％)。m/z:650.5；1HNMR(400MHz,MeOD)δ:8.44(s,1H),7.92(d,J＝16.2Hz,2H),7.78(d,J＝8.1Hz,1H),7.21(d,J＝7.9Hz,1H),6.95(s,1H),6.46(ddd,J＝18.8,16.9,5.9Hz,2H),5.89(dd,J＝9.9,1.9Hz,1H),3.96(s,3H),3.45(t,J＝5.7Hz,2H),3.34–3.32(m,4H),3.28(dd,J＝11.1,5.2Hz,2H),2.87(s,6H),2.69(s,3H),2.35(s,3H),1.28(d,J＝6.8Hz,6H)。實(shí)施例四：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制備第一步：1-(異丙基磺酰)-4-甲氧基-2-硝基苯的制備將異丙基(4-甲氧基-2-硝基苯基)硫烷(2.0g,8.8mmol)溶于DCM(20mL)中，分批加入間氯過(guò)氧苯甲酸(3.8g,22.0mmol)。攪拌16小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)完全，反應(yīng)液飽和亞硫酸鈉(20mL)淬滅，有機(jī)相用飽和碳酸氫鈉水溶液(3X15mL)洗，有機(jī)相干燥過(guò)濾，濃縮，剩余物通過(guò)快速硅膠柱純化得到黃色固體(1.8g,78％)。第二步：1-(異丙基磺酰)-4-甲氧基-2-苯胺的制備將1-(異丙基磺酰)-4-甲氧基-2-硝基苯(1.8g,6.94mmol)，氯化銨(3.8g，69.4mmol)溶于甲醇(10mL),THF(10mL),水(10),加入還原鐵粉(3.7g,69.4mmol),加熱回流3小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)完全，反應(yīng)液過(guò)濾，濾液濃縮去除甲醇以及THF，剩余物水相用DCM(3X10mL)萃取，有機(jī)相干燥過(guò)濾，濃縮，通過(guò)快速硅膠柱純化得到淺黃色固體(1.5g,85％)。第三步：2-氯-N-(2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺的制備將1-(異丙基磺酰)-4-甲氧基-2-苯胺(400mg,1.74mmol)溶于無(wú)水DMF(10mL)中，在冰浴下分批加入NaH(140mg,3.48mmol)，攪拌20分鐘后，將所得混懸液加入2,4-二氯-5-甲基嘧啶(570mg,2.62mmol)的DMF(10mL)中，反應(yīng)在冰浴下攪拌2小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)完全。反應(yīng)液用飽和NH4Cl(3mL)淬滅，濃縮干后，用二氯甲烷(20mL),水(20mL)，有機(jī)相干燥過(guò)濾濃縮，剩余物通過(guò)快速柱層析得到2-氯-N-(2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺(400mg,55％)。第四步：N-2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺的制備將2-氯-N-(2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺(300mg,0.73mmol),4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(162mg,0.88mmol),對(duì)甲苯磺酸(210mg,1.1mmol)溶于1,4-二氧六環(huán)(20mL)。反應(yīng)加熱至110℃，攪拌16小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)完全，反應(yīng)液濃縮，剩余物加入水(10mL),甲醇(5mL)，混合物攪拌10分鐘后，過(guò)濾，濾餅用甲基叔丁基醚洗后得到粗產(chǎn)物(400mg)。第五步：N-2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺的制備將N-2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺(400mg,0.71mmol),三乙胺(0.5mL),N,N,N-三甲基乙二胺(150mg,1.42mmol)溶于DMF(10mL)中，反應(yīng)加熱至110℃攪拌2小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)，反應(yīng)濃縮干，剩余物用二氯甲烷(20mL)，水(20mL)分層，將不溶物過(guò)濾，有機(jī)相干燥，過(guò)濾，濃縮，剩余物通過(guò)快速柱層析得到黃色固體(200mg,50％)。第六步：N-1-(2-(二甲氨基)乙基)-N-4-(4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺的制備把N-2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺(200mg,0.31mmol)溶于甲醇(20mL)，加入Pd/C(20mg)。反應(yīng)在氫氣下攪拌10min，LCMS顯示反應(yīng)完全，反應(yīng)液過(guò)濾，濾液旋干，剩余物通過(guò)反相柱純化得到N-1-(2-(二甲氨基)乙基)-N-4-(4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺(150mg,75％)。第七步：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制備將N-1-(2-(二甲氨基)乙基)-N-4-(4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺(150mg,0.24mmol)，三乙胺(0.3mL)溶于四氫呋喃(20mL),反應(yīng)液冷卻至-10至-5℃。氮?dú)獗Ｗo(hù)下，緩慢加入丙烯酰氯(0.36mL,1MinTHF)。反應(yīng)在-10至-5℃下攪拌30分鐘，反應(yīng)結(jié)束,加入甲醇(3mL)繼續(xù)攪拌10分鐘，反應(yīng)液濃縮干，剩余物先經(jīng)過(guò)制備板分離后再經(jīng)反相柱純化，得到最終產(chǎn)品(15mg,10％)。m/z:666.3；1HNMR(400MHz,MeOD)δ:8.46(s,1H),8.03(s,1H),7.80(d,J＝8.9Hz,1H),7.74(s,1H),6.96(s,1H),6.90(dd,J＝8.9,2.1Hz,1H),6.63–6.29(m,2H),5.87(dd,J＝9.9,1.8Hz,1H),3.96(s,3H),3.73(s,3H),3.47(t,J＝5.6Hz,2H),3.28(t,J＝6.4Hz,3H),2.88(s,6H),2.70(s,3H),1.28(d,J＝6.8Hz,6H)。實(shí)施例五：N-(5-((5-氯-4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯?；０返闹苽涞谝徊剑?,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)嘧啶-4-胺的制備將1-(異丙基磺酰)-4-甲氧基-2-苯胺(350mg,1.52mmol)溶于無(wú)水DMF(10mL)中，在冰浴下分批加入NaH(120mg,3.0mmol)，攪拌20分鐘后，將所得混懸液加入2,4-二氯-5-甲基嘧啶(420mg,2.28mmol)的DMF(10mL)中，反應(yīng)在冰浴下攪拌2小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)完全。反應(yīng)液用飽和NH4Cl(3mL)淬滅，濃縮干后，用二氯甲烷(20mL),水(20mL)，有機(jī)相干燥過(guò)濾濃縮，剩余物通過(guò)快速柱層析得到產(chǎn)品(300mg,52％)。第二步：5-氯-N-2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)嘧啶-2,4-二胺的制備將2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)嘧啶-4-胺(300mg,0.79mmol),4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(180mg,0.96mmol),對(duì)甲苯磺酸(225mg,1.2mmol)溶于1,4-二氧六環(huán)(20mL)。反應(yīng)加熱至120℃，攪拌16小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)完全，反應(yīng)液濃縮，剩余物加入水(10mL),甲醇(5mL)，混合物攪拌10分鐘后，過(guò)濾，濾餅用甲基叔丁基醚洗后得到粗品(400mg)。第三步：5-氯-N-2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)嘧啶-2,4-二胺的制備將5-氯-N-2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)嘧啶-2,4-二胺(400mg,0.70mmol),三乙胺(1mL),N,N,N-三甲基乙二胺(140mg,1.4mmol)溶于DMF(10mL)中，反應(yīng)加熱至110℃攪拌2小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)，反應(yīng)濃縮干，剩余物用二氯甲烷(20mL)，水(20mL)分層，將不溶物過(guò)濾，有機(jī)相干燥，過(guò)濾，濃縮，剩余物通過(guò)快速柱層析得到產(chǎn)品(150mg,34％)。第四步：N-4-(5-氯-4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)氨基)嘧啶-2-基)-N-1-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺的制備把5-氯-N-2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)嘧啶-2,4-二胺(100mg,0.16mmol)溶于甲醇(5mL)，加入Pd/C(20mg)。反應(yīng)在氫氣下攪拌10min，LCMS顯示反應(yīng)完全，反應(yīng)液過(guò)濾，濾液旋干，剩余物通過(guò)反相柱純化得到產(chǎn)品(80mg,80％)。第五步：N-(5-((5-氯-4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯?；０返闹苽鋵-4-(5-氯-4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲氧苯基)氨基)嘧啶-2-基)-N-1-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺(80mg,0.12mmol)，三乙胺(0.5mL)溶于四氫呋喃(20mL),反應(yīng)液冷卻至-10至-5℃。氮?dú)獗Ｗo(hù)下，緩慢加入丙烯酰氯(0.3mL,1MinTHF)。反應(yīng)在-10至-5℃下攪拌30分鐘，反應(yīng)結(jié)束,加入甲醇(3mL)繼續(xù)攪拌10分鐘，反應(yīng)液濃縮干，剩余物先經(jīng)過(guò)制備板分離后在經(jīng)反相過(guò)柱純化，得到最終產(chǎn)品(15mg,15％)。m/z:632.2；1HNMR(400MHz,MeOD)δ:8.11(s,1H),7.95(s,1H),7.85(s,1H),7.70(d,J＝8.9Hz,1H),6.85(s,1H),6.79(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),6.41(dd,J＝16.9,10.1Hz,1H),6.27(dd,J＝16.9,1.8Hz,1H),5.73(dd,J＝10.1,1.8Hz,1H),3.84(s,3H),3.67(s,3H),3.35(t,J＝5.8Hz,2H),3.22–3.13(m,3H),2.77(s,6H),2.59(s,3H),1.16(d,J＝6.8Hz,6H)。實(shí)施例六：N-(5-((5-氯-4-((2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯?；０返闹苽涞谝徊剑?,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)嘧啶-4-胺的制備取50mL單口瓶，依次加入1-(異丙基磺酰)-2-氨基-4-(三氟甲基)苯(270mg)，2,4,5-三氯嘧啶(220mg)，氫化鈉(36mg)，DMF(15mL)。在0℃零度下反應(yīng)一個(gè)小時(shí)，加入100毫升水到反應(yīng)液中，二氯甲烷萃取，硅膠柱層析(20％EA/PE)，得到白色固體(380mg)。第二步：5-氯-N-2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)嘧啶-2,4-二胺的制備取100mL單口瓶，加入2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)嘧啶-4-胺(380mg)，4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(170mg)和對(duì)甲基苯磺酸(158mg)，溶于2-戊醇(20mL)，在120℃反應(yīng)3小時(shí)。冷卻后加入NaHCO3水溶液，攪拌30分鐘，過(guò)濾，收集固體得到黃色固體(400mg)。第三步：5-氯-N-2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)嘧啶-2,4-二胺的制備取100mL單口瓶，分別加入5-氯-N-2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(400mg)，N,N,N,-3-甲基乙基-二胺(108mg)，DIPEA(183mg)和5mlDMF，在100℃反應(yīng)1小時(shí)，濃縮,二氯甲烷萃取，得到粗產(chǎn)品(400mg)。第四步：N-4-(5-氯-4-((2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)-N-1-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N-1-甲基苯-1,2,4-三胺的制備取100mL單口瓶，分別加入5-氯-N-2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)嘧啶-2,4-二胺(400mg)，鐵粉(347mg)，氯化銨(670mg)和20mL乙醇和7mL水。在70℃反應(yīng)3小時(shí)，100mL乙醇加入反應(yīng)液，過(guò)濾，濃縮，用二氯甲烷萃取，得到粗產(chǎn)品(380mg)。第五步：N-(5-((5-氯-4-((2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯?；０返闹苽淙?00mL單口瓶，加入N-4-(5-氯-4-((2-(異丙基磺酰)-5-(三氟甲基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)-N-1-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N-1-甲基苯-1,2,4-三胺(380mg)，DIPEA(221mg)和100mLTHF，冷卻至-10℃，然后滴加0.5ml丙烯酰氯(1M四氫呋喃溶液)，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，甲醇淬滅，濃縮，殘留物竟反相柱層析得到最終產(chǎn)品(180mg)。m/z:670.2；1HNMR(400MHz,MeOD)δ:8.60(s,1H),8.27(s,1H),8.19–8.00(m,2H),7.66(d,J＝8.0Hz,1H),6.96(s,1H),6.68–6.49(m,1H),6.25(d,J＝16.8Hz,1H),5.76(d,J＝10.2Hz,1H),3.90(s,3H),3.51–3.27(m,5H),2.87(s,6H),2.67(s,3H),1.31(d,J＝6.7Hz,6H)。實(shí)施例七：N-(5-((5-氯-4-((2-(異丙基磺酰)-5-氯-苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制備第一步：2-氯-N-(5-氯-2-(異丙基磺酰)苯基)-5-氯嘧啶-4-胺的制備將4-氯-2-(異丙基磺酰)苯胺(700mg,3.00mmol)溶于無(wú)水DMF中，0℃下，加入氫化鈉(243mg,6.08mmol)，攪拌半小時(shí)，0℃下，將此混懸物滴加到溶有2,4,5-三氯嘧啶(600mg,3.29mmol)中，緩慢升至室溫，攪拌過(guò)夜。加水淬滅反應(yīng)，蒸除溶劑，剩余物經(jīng)反相柱層析分離純化(水：乙腈＝40:60)得產(chǎn)物(600mg)。LC-MS：tR＝3.18min，380.0([M+H]+)。第二步：5-氯-N-4-(5-氯-2-(異丙基磺酰)苯基)-N-2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)嘧啶-2,4-二胺的制備將2-氯-N-(5-氯-2-(異丙基磺酰)苯基)-5-氯嘧啶-4-胺(600mg,1.58mmol)與4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(350mg,1.89mmol)溶于2-戊醇中，加入對(duì)甲苯磺酸(410mg,2.36mmol)，加熱至140℃反應(yīng)三小時(shí)，冷卻至室溫，蒸除溶劑，剩余物反相柱層析分離純化得產(chǎn)物(400mg)。LC-MS：tR＝3.24min，530.0([M+H]+)。第三步：5-氯-N4-(5-氯-2-(異丙基磺酰)苯基)-N2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)嘧啶-2,4-二胺的制備將5-氯-N-4-(5-氯-2-(異丙基磺酰)苯基)-N-2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)嘧啶-2,4-二胺(400mg)溶于DMF中，加入0.5mL三甲基乙二胺，加熱至125℃反應(yīng)，2小時(shí)后，反應(yīng)完畢。蒸除溶劑，得粗產(chǎn)品，不經(jīng)純化直接用于下步反應(yīng)。LC-MS：tR＝2.54min，612.1([M+H]+)。第四步：N-4-(5-氯-4-((5-氯-2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)嘧啶-2-基)-N-1-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N-1-甲基苯-1,2,4-三胺的制備將上一步反應(yīng)得到的粗品(300mg)溶于乙醇中，加入氯化銨(300mg)，鐵粉(200mg)，加熱回流反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)完畢。冷卻至室溫，過(guò)濾，收集濾液，蒸除溶劑，加大量水稀釋剩余物，異丙醇-二氯甲烷混合溶劑(1:3)萃取水相三次，合并有機(jī)相，蒸除有機(jī)相溶劑，得粗產(chǎn)品(150mg)，不經(jīng)純化直接投入下一步。LC-MS：tR＝2.37min，582.1([M+H]+)。第五步：N-(5-((5-氯-4-((5-氯-2-(異丙基磺酰)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯?；０返闹苽鋵⑸弦徊椒磻?yīng)得到的粗品(150mg,0.26mmol)溶于無(wú)水四氫呋喃中，0℃下，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入0.3mL二異丙基乙基胺，1M丙烯酰氯四氫呋喃溶液(0.4mL)緩慢滴加入上述溶液中，0℃下反應(yīng)半小時(shí)，蒸除四氫呋喃，剩余物反相柱層析分離純化得最終產(chǎn)品(52mg)。LC-MS：tR＝2.38min，636.1([M+H]+)；1HNMR(400MHz,CD3OD)δ：8.45(s,1H),8.26(br,1H),8.09(s,1H),7.86(d,1H),7.37(dd,1H),7.00(s,1H),6.60(m,1H),6.32(d,1H),5.79(d,1H),3.95(s,3H),3.46(m,2H),3.39(m,1H),3.33(m,2H),2.89(s,6H),2.71(s,3H),1.29(d,6H)。實(shí)施例八：N-(5-((5-甲基-4-((2-(異丙基磺酰)-5-氯-苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制備第一步：2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)嘧啶-4-胺的制備將2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯胺(800mg,3.751mmol)溶于無(wú)水DMF(15mL)中，在冰浴下分批加入NaH(450mg,11.252mmol)，攪拌20分鐘后，將所得混懸液加入2,4,5-三氯嘧啶(757mg,4.126mmol)的DMF(5mL)中，反應(yīng)在冰浴下攪拌1小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)完全。反應(yīng)液用飽和NH4Cl(3mL)淬滅，濃縮干后，用二氯甲烷(20mL),水(20mL)分層，有機(jī)相干燥過(guò)濾濃縮，剩余物通過(guò)快速柱層析得到2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)嘧啶-4-胺(470mg,34.8％)。第二步：5-氯-N-2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)嘧啶-2,4-二胺的制備將2,5-二氯-N-(2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)嘧啶-4-胺(470mg,1.309mmol),4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(243mg,1.309mmol),對(duì)甲苯磺酸(243mg,1.309mmol)溶于2-戊醇(10mL)。反應(yīng)加熱至120℃，攪拌3小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)完全，反應(yīng)液濃縮，剩余物加入水(10mL),甲醇(5mL)，混合物攪拌10分鐘后，過(guò)濾，濾餅用甲基叔丁基醚洗后得到粗品(530mg)。第三步：5-氯-N-2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)嘧啶-2,4-二胺的制備將上一步反應(yīng)得到的粗品(530mg,1.039mmol),三乙胺(317mg,3.118mmol),N,N,N-三甲基乙二胺(318mg,3.118mmol)溶于DMF(10mL)中，反應(yīng)加熱至120℃攪拌1小時(shí)，LCMS顯示反應(yīng)，反應(yīng)濃縮干，剩余物通過(guò)快速柱層析得到5-氯-N-2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)嘧啶-2,4-二胺(365mg,59.3％)。第四步：N-4-(5-氯-4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)氨基)嘧啶-2-基)-N-1-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N-1-甲基苯-1,2,4-三胺的制備把5-氯-N-2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N-4-(2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)嘧啶-2,4-二胺(365mg,0.616mmol)溶于甲醇(20mL)，加入Pd/C(40mg)。反應(yīng)在氫氣下攪拌10min，LCMS顯示反應(yīng)完全，反應(yīng)液過(guò)濾，濾液旋干，剩余物通過(guò)反相柱純化得到N-4-(5-氯-4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)氨基)嘧啶-2-基)-N-1-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N-1-甲基苯-1,2,4-三胺(150mg,43.4％)。第五步：N-(5-((5-氯-4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯?；０返闹苽鋵-4-(5-氯-4-((2-(異丙基磺酰)-5-甲基苯基)氨基)嘧啶-2-基)-N-1-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N-1-甲基苯-1,2,4-三胺(150mg,0.267mmol)，三乙胺(81mg,0.801mmol)溶于四氫呋喃(50mL),反應(yīng)液冷卻至-30℃。氮?dú)獗Ｗo(hù)下，緩慢加入丙烯酰氯(0.8mL,1MinTHF)。反應(yīng)在-30℃下攪拌30分鐘，反應(yīng)結(jié)束,加入甲醇(10mL)繼續(xù)攪拌10分鐘，反應(yīng)液濃縮干，剩余物先經(jīng)過(guò)制備板分離后再經(jīng)反相過(guò)柱純化得到最終產(chǎn)品(24mg,14.6％)。m/z:617.1；1HNMR(400MHz,MeOD)δ：8.23(s,1H),8.10(s,1H),7.93(s,1H),7.80(d,J＝8.1Hz,1H),7.25(d,J＝7.9Hz,1H),6.99(s,1H),6.59(dd,J＝16.9,10.2Hz,1H),6.38(dd,J＝16.9,1.6Hz,1H),5.85(dd,J＝10.2,1.6Hz,1H),3.94(s,3H),3.46(t,J＝5.8Hz,2H),3.37(dd,J＝13.6,6.8Hz,1H),3.33–3.29(m,2H),2.88(s,6H),2.70(s,3H),2.37(s,3H),1.28(d,J＝6.8Hz,6H)。生物學(xué)測(cè)試評(píng)價(jià)(一)1.EGFRT790M突變型酶學(xué)實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)的方法測(cè)試化合物對(duì)外顯子20T790M突變型EGFR酶的抑制作用，并得出化合物對(duì)該酶活性的半數(shù)抑制濃度IC50。1)在384孔板中加入1～5ulEGFRT790M酶溶液，酶終濃度為0.1～1nM。2)加入1～5ul梯度稀釋好的化合物溶液。3)室溫孵育10分鐘。4)加入1～5ul底物混合液包含底物多肽終濃度5～50nM和ATP終濃度1～10uM。5)室溫孵育0.5～2小時(shí)。6)加入5ulEDTA終止液終止反應(yīng)5分鐘。7)加入5ul含標(biāo)記抗體的檢測(cè)液，室溫孵育1小時(shí)。8)酶標(biāo)儀測(cè)定各板的665nm熒光信號(hào)值。9)通過(guò)熒光信號(hào)值計(jì)算抑制率。10)根據(jù)不同濃度的抑制率通過(guò)曲線擬合得出化合物的IC50。2.EGFR野生型(WT)酶學(xué)實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)的方法測(cè)試化合物對(duì)野生型EGFR酶的抑制作用，并得出化合物對(duì)該酶活性的半數(shù)抑制濃度IC50。1)在384孔板中加入1～5ulEGFR野生型酶溶液，酶終濃度為0.1～1nM。2)加入1～5ul梯度稀釋好的化合物溶液。3)室溫孵育10分鐘。4)加入1～5ul底物混合液包含底物多肽終濃度5～50nM和ATP終濃度0.1～5uM。5)室溫孵育0.5～2小時(shí)。6)加入5ulEDTA終止液終止反應(yīng)5分鐘。7)加入5ul含標(biāo)記抗體的檢測(cè)液，室溫孵育1小時(shí)。8)酶標(biāo)儀測(cè)定各板的665nm熒光信號(hào)值。9)通過(guò)熒光信號(hào)值計(jì)算抑制率。10)根據(jù)不同濃度的抑制率通過(guò)曲線擬合得出化合物的IC50。本發(fā)明化合物的生化學(xué)活性通過(guò)以上的試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得的IC50值見(jiàn)下表。結(jié)論：本發(fā)明實(shí)施例對(duì)EGFR突變型激酶具有很強(qiáng)的抑制活性，同時(shí)對(duì)野生型激酶具有較弱的抑制活性，顯示出很好的選擇性；而參照化合物crizotinib和LDK378對(duì)EGFR突變型激酶基本沒(méi)有抑制活性。3.NCI-H1975細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用CellTiter-Glo的方法測(cè)試化合物對(duì)NCI-H1975細(xì)胞增殖的抑制作用，并得出化合物抑制細(xì)胞增殖活性的半數(shù)抑制濃度IC50。1)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種90μL的H1975細(xì)胞懸液，密度為1～5*103細(xì)胞/ml，將培養(yǎng)板于培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24小時(shí)(37℃，5％CO2)。2)向培養(yǎng)板細(xì)胞中加入梯度稀釋的不同濃度的待測(cè)化合物溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育72小時(shí)(37℃，5％CO2)。3)每孔加入50～100μLCellTiter-Glo試劑，并振蕩10分鐘，室溫靜置10分鐘。4)酶標(biāo)儀測(cè)定各板的化學(xué)發(fā)光信號(hào)值。5)通過(guò)化學(xué)發(fā)光信號(hào)值計(jì)算抑制率。6)根據(jù)不同濃度的抑制率通過(guò)曲線擬合得出化合物的IC50。4.A431細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用CellTiter-Glo的方法測(cè)試化合物對(duì)A431細(xì)胞增殖的抑制作用，并得出化合物抑制細(xì)胞增殖活性的半數(shù)抑制濃度IC50。1)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種90μL的A431細(xì)胞懸液，密度為1～5*103細(xì)胞/ml，將培養(yǎng)板于培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24小時(shí)(37℃，5％CO2)。2)向培養(yǎng)板細(xì)胞中加入梯度稀釋的不同濃度的待測(cè)化合物溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育72小時(shí)(37℃，5％CO2)。3)每孔加入50～100μLCellTiter-Glo試劑，并振蕩10分鐘，室溫靜置10分鐘。4)酶標(biāo)儀測(cè)定各板的化學(xué)發(fā)光信號(hào)值。5)通過(guò)化學(xué)發(fā)光信號(hào)值計(jì)算抑制率。6)根據(jù)不同濃度的抑制率通過(guò)曲線擬合得出化合物的IC50。本發(fā)明化合物的生化學(xué)活性通過(guò)以上的試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得的IC50值見(jiàn)下表。結(jié)論：本發(fā)明實(shí)施例對(duì)EGFR突變型細(xì)胞H1975的增殖具有很強(qiáng)的抑制活性，而對(duì)野生型A431細(xì)胞的增殖具有較低的抑制，實(shí)施例對(duì)野生型/突變型細(xì)胞具有很好的選擇性；而參照化合物crizotinib和LDK378對(duì)EGFR突變型細(xì)胞H1975的增殖基本沒(méi)有抑制活性。生物學(xué)測(cè)試評(píng)價(jià)(二)實(shí)驗(yàn)例1、ALK基因融合細(xì)胞增殖抑制測(cè)試下面的體外試驗(yàn)可用來(lái)測(cè)定本發(fā)明化合物對(duì)于ALK基因融合高表達(dá)的人淋巴瘤細(xì)胞Karpas299的增殖抑制活性。以下所述的體外細(xì)胞試驗(yàn)可測(cè)定受試化合物的對(duì)人淋巴瘤細(xì)胞Karpas299的增殖抑制活性，其活性可用IC50值來(lái)表示。此類(lèi)試驗(yàn)的一般方案如下：首先選擇人淋巴瘤細(xì)胞Karpas299，以適宜的細(xì)胞濃度(e.g.6000個(gè)細(xì)胞/well100uLmedium)接種在96孔培養(yǎng)板上，隨后向各孔加入用培養(yǎng)基稀釋的一系列梯度濃度(一般6到10個(gè)濃度)的受試化合物溶液，連續(xù)培養(yǎng)72個(gè)小時(shí)。72小時(shí)后，可用CellTiter-LuminescentCellViabilityAssaykit(購(gòu)于Promega)。方法測(cè)定化合物抑制細(xì)胞增殖的活性。IC50值可通過(guò)測(cè)定一系列不同濃度下，受試化合物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制數(shù)值進(jìn)行計(jì)算。本發(fā)明化合物的生化學(xué)活性通過(guò)以上的試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得的IC50值見(jiàn)下表?；衔颕C50(nM)Crizotinib38.5LDK37832實(shí)施例一24實(shí)施例二290實(shí)施例三99實(shí)施例四530實(shí)施例五360實(shí)施例六230實(shí)施例七20實(shí)施例八74結(jié)論：本發(fā)明實(shí)施例化合物與參照化合物Crizotinib和LDK378一樣對(duì)Karpas299細(xì)胞均有明顯地增殖抑制活性；尤其是實(shí)施例一和實(shí)施例七化合物的抑制活性具有很大的提高。實(shí)驗(yàn)例2、ALK激酶抑制測(cè)試下面的體外試驗(yàn)可用來(lái)測(cè)定本發(fā)明化合物對(duì)于ALK激酶及產(chǎn)生變異的ALKL1196M激酶抑制活性，其活性可用IC50值來(lái)表示?；衔锏陌霐?shù)抑制濃度IC50(將一定濃度的酶活性抑制至50％時(shí)所需的化合物濃度)是通過(guò)將一定量的激酶與特定的底物及不同濃度的待測(cè)化合物混合反應(yīng)后測(cè)定計(jì)算出的。本實(shí)驗(yàn)所用的ALK激酶為人源重組蛋白，該酶在含有50mMHEPES(pH7.5)，10mMMgCl2，2MDTT(1000x)的緩沖溶液及30μMATP的反應(yīng)體系中與多肽底物以及不同濃度的受試化合物共同進(jìn)行反應(yīng)(25℃，45min)，隨后FAM標(biāo)記抗體對(duì)底物進(jìn)行標(biāo)記，最后以時(shí)間分辨熒光方式對(duì)ALK激酶活性進(jìn)行定量測(cè)定。本發(fā)明化合物的生化學(xué)活性通過(guò)以上的試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得的IC50值見(jiàn)下表。結(jié)論：本發(fā)明實(shí)施例化合物與參照化合物Crizotinib和LDK378一樣對(duì)ALK及ALKL1196M激酶活性均有明顯地抑制作用。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3