本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種中國(guó)人群先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥基因篩查試劑盒、篩查方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(Congenitaladrenalhyperplasia，CAH)屬于一組因類固醇激素生物合成過(guò)程中某種酶的先天性缺陷而引起的常見(jiàn)常染色體隱性遺傳病，有著廣泛的臨床表現(xiàn)，在新生兒的發(fā)生率為1/5000，不同類型CAH的臨床表型及生化表現(xiàn)基于缺陷酶的種類及殘余酶活性的不同各有其特點(diǎn)，90％-95％的21-羥化酶缺乏癥患者在CYP21A2基因上存在有害突變。CYP21A2基因編碼區(qū)的常見(jiàn)突變譜和突變熱點(diǎn)主要包括基因的點(diǎn)突變、小缺失、小插入和完全重組等，21-羥化酶缺乏癥的程度反映在臨床癥狀上可分為失鹽型、單純型和遲發(fā)型三類型，失鹽型和單純性統(tǒng)稱為經(jīng)典型，各種類型的臨床癥狀見(jiàn)表1，篩查的同時(shí)，分析基因型與表現(xiàn)型的關(guān)系，有著重要的意義。21-羥化酶基因是先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥的致病基因，該基因位于人類第6號(hào)染色體短臂6p21.3的人類白細(xì)胞抗原(HumanLeukocyteAntigen，HLA)Ⅲ類基因區(qū)，由無(wú)活性的假基因CYP21A1和有活性的真基因CYP21A2組成，真假基因皆為3.3kb，真假基因之間均有10個(gè)外顯子，9個(gè)內(nèi)含子，外顯子和內(nèi)含子同源性分別達(dá)到98％和96％(如圖2，B)，真假基因串聯(lián)排列在C4A和C4B基因的3’端，兩者相距30Kb，C4/CYP21A1與其端粒側(cè)RPI基因和著絲粒側(cè)TNXB基因以及他們的截短假基因RP2和TNXA基因串聯(lián)構(gòu)成RCCX模塊(RP-C4-CYP21-TNX)(如圖2，A)。目前CYP21A2基因改變的發(fā)生機(jī)制尚未完全弄清，研究表明大約95％的CYP21A2基因突變是由于活性基因和其臨近連鎖的假基因相互作用引起的，高度同源性使得在有絲分裂或減數(shù)分裂期間可能發(fā)生不等互換或重組，而導(dǎo)致基因缺失、插入或點(diǎn)突變，其中大約20％的突變等位基因攜帶30Kb的DNA缺失片段是由減數(shù)分裂時(shí)不等互換引起，然而在CYP21A2中75％攜帶一種或多種突變，這些在CYP21A1假基因中是正常存在的，也由于CYP21A2處于HLA基因復(fù)合體中，而HLA基因簇是人類最活躍的區(qū)域，重組發(fā)生率高，且基因型多樣化，因此基因轉(zhuǎn)換在21-羥化酶的發(fā)病中比基因缺失更常見(jiàn)。另外5％的患者等位基因含有特別的突變，這僅發(fā)生在個(gè)別的家庭，它們代表了個(gè)別人群中的稀有等位基因。此外，有些突變沒(méi)有影響到21-羥化酶活性，可以認(rèn)為是由于21-羥化酶基因型的多態(tài)性所致。目前分子水平檢測(cè)的主要困難是21-羥化酶真基因CYP21A2和假基因CYP21A1P具有高度的同源性，難于區(qū)分。對(duì)CYP21A2基因突變主要檢測(cè)方法包括Southern雜交、CYP21A2基因測(cè)序、多重連接依賴的探針擴(kuò)增(MLPA)、等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)(Allele-specificPCR，AS-PCR)、變性高效液相色譜(Denaturinghigh-performanceliquidchromatography，DHPLC)等，由于上述技術(shù)存在繁瑣、高成本、低通量，或需要高質(zhì)量的DNA等問(wèn)題，臨床應(yīng)用難度較大，因此有必要?jiǎng)?chuàng)立一種高通量、高效能、低成本的CYP21A2基因突變篩查方法，以實(shí)現(xiàn)臨床快速檢測(cè)?；蛐头治雠c分型對(duì)21-羥化酶缺乏癥患者基因型診斷和胎兒產(chǎn)前患病危險(xiǎn)率評(píng)估和先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥類型鑒別均有重要意義。許多先進(jìn)國(guó)家在開(kāi)展新生兒篩查的同時(shí)，還進(jìn)行了基因診斷和產(chǎn)前診斷方面的研究。采用基因診斷法即對(duì)21-羥化酶唯一致病基因CYP21A2的檢測(cè)被推薦作為第二層次的篩查方法。因此，通過(guò)早期篩查CYP21A2基因，對(duì)于提前預(yù)知和早期干預(yù)治療從而預(yù)防21-羥化酶缺乏癥患者的發(fā)生具有極其重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，如表1所示。表1.21-羥化酶缺乏癥的臨床表現(xiàn)形式的特點(diǎn)SNaPshot技術(shù)是一種基于單堿基延伸原理的SNP分型新方法，以巢式PCR擴(kuò)增目的區(qū)域后，經(jīng)寡核苷酸引物延伸標(biāo)記擴(kuò)增，突變位點(diǎn)匹配上一個(gè)熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸后終止延伸，然后通過(guò)毛細(xì)管電泳進(jìn)行片段分析，相當(dāng)于單個(gè)位點(diǎn)的微測(cè)序，可以檢測(cè)單核苷酸的突變。延伸位點(diǎn)堿基的類型決定電泳峰的顏色，延伸引物的片段長(zhǎng)度決定峰的位置，延伸引物的濃度影響電泳檢測(cè)的峰高。SNPs作為第三代遺傳標(biāo)記應(yīng)用于疾病基因的定位、克隆和鑒定，具有快速、簡(jiǎn)便、高效、高通量的特點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的主要目的在于提供一種簡(jiǎn)單、高通量、高效能、低成本的適合中國(guó)人群的先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥基因篩查試劑盒，其包括：1)用于檢測(cè)CYP21A2基因位點(diǎn)突變92C→TIVS2-13A/C→G332-339del8bp518T→A704indel9bp710T→A713T→A719A→T844G→T923-924insT955C→T968A→G1069C→T1294G→A1360C→T1447C→T1450C→T共17個(gè)突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物混合液；2)針對(duì)上述17個(gè)突變位點(diǎn)的延伸引物混合液；3)dNTP；4)10×PCR緩沖液；5)25mMMg2+離子；6)FastStartTaq酶；7)由SAP酶、ExonI酶與配套緩沖液組成的純化試劑；8)SNaPshotMultiplex混合液；9)單個(gè)位點(diǎn)純合、雜合突變的陽(yáng)性和陰性對(duì)照DNA；10)去離子水。所述檢測(cè)CYP21A2基因的92C→T位點(diǎn)、IVS2-13A/C→G位點(diǎn)、332-339缺失8個(gè)堿基GAGACTACT的G→C位點(diǎn)、518T→A位點(diǎn)的初級(jí)PCR擴(kuò)增引物序列一致，具體序列如SEQIDNo.1與SEQIDNo.2所示。所述檢測(cè)CYP21A2基因的704缺失9個(gè)堿基TCACATCGT同時(shí)插入8個(gè)堿基CCACAACG的T→C位點(diǎn)、710T→A位點(diǎn)，713T→A位點(diǎn)、719A→T位點(diǎn)、844G→T位點(diǎn)、923-924插入T的G→T位點(diǎn)、955C→T位點(diǎn)、968A→G位點(diǎn)、1069C→T位點(diǎn)、1294G→A位點(diǎn)、1360C→T位點(diǎn)、1447C→T位點(diǎn)、1450C→T位點(diǎn)的初級(jí)PCR擴(kuò)增引物序列一致，具體序列如SEQIDNo.3與SEQIDNo.4所示。所述檢測(cè)CYP21A2基因的92C→T位點(diǎn)的次級(jí)PCR擴(kuò)增引物序列如SEQIDNo.5與SEQIDNo.6所示。所述檢測(cè)CYP21A2基因的IVS2-13A/C→G位點(diǎn)、332-339缺失8個(gè)堿基GAGACTACT的G→C位點(diǎn)、518T→A位點(diǎn)的次級(jí)PCR擴(kuò)增引物序列一致，具體序列如SEQIDNo.7與SEQIDNo.8所示。所述檢測(cè)CYP21A2基因的704缺失9個(gè)堿基TCACATCGT同時(shí)插入8個(gè)堿基CCACAACG的T→C位點(diǎn)、710T→A位點(diǎn)，713T→A位點(diǎn)、719A→T位點(diǎn)、844G→T位點(diǎn)、923-924插入T的G→T位點(diǎn)的次級(jí)PCR擴(kuò)增引物序列一致，具體序列如SEQIDNo.9與SEQIDNo.10所示。所述檢測(cè)CYP21A2基因的955C→T位點(diǎn)、968A→G位點(diǎn)、1069C→T位點(diǎn)的次級(jí)PCR擴(kuò)增引物序列一致，具體序列如SEQIDNo.11與SEQIDNo.12所示。所述檢測(cè)CYP21A2基因的1294G→A位點(diǎn)、1360C→T位點(diǎn)、1447C→T位點(diǎn)、1450C→T位點(diǎn)的次級(jí)PCR擴(kuò)增引物序列一致，具體序列如SEQIDNo.13與SEQIDNo.14所示。進(jìn)一步的，以CYP21A2基因的92C→T位點(diǎn)，IVS2-13A/C→G位點(diǎn)，332-339del8bp，518T→A位點(diǎn)，704indel9bp，710T→A位點(diǎn)，713T→A位點(diǎn)，719A→T位點(diǎn)，844G→T位點(diǎn)，923-924insT位點(diǎn)，955C→T位點(diǎn)，968A→G位點(diǎn)，1069C→T位點(diǎn)，1294G→A位點(diǎn)，1360C→T位點(diǎn)，1447C→T位點(diǎn)，1450C→T位點(diǎn)等17個(gè)突變位點(diǎn)為檢測(cè)對(duì)象而設(shè)計(jì)的延伸引物分別如SEQIDNo.15～SEQIDNo.31所示，延伸引物的終濃度分別為0.1μM、0.16μM、0.4μM、1.6μM、0.8μM、1.3μM、0.8μM、0.4μM、0.1μM、0.2μM、0.65μM、1.3μM、1.1μM、2.6μM、2.1μM、2.6μM、1.3μM。本發(fā)明的又一目的在于提供一種先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥基因突變篩查方法，其包括：(1)以所述PCR擴(kuò)增引物對(duì)先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥基因進(jìn)行多重巢式PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；(2)以所述延伸引物針對(duì)步驟(1)所獲純化產(chǎn)物進(jìn)行延伸標(biāo)記反應(yīng)和二次純化；(3)對(duì)步驟(2)所獲二次純化產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，并對(duì)毛細(xì)管電泳結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析，獲得篩查結(jié)果。本發(fā)明的另一目的在于提供前述任一項(xiàng)中國(guó)人群先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥基因篩查試劑盒在先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥突變篩查中的應(yīng)用。本發(fā)明的又一目的在于提供一種檢測(cè)系統(tǒng)，其包含本發(fā)明所述試劑盒。本發(fā)明的有益效果是:本案發(fā)明人經(jīng)大量研究和實(shí)踐，通過(guò)Google數(shù)據(jù)庫(kù)、PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)及HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)中國(guó)人群先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行了篩選和組合，并構(gòu)建了本發(fā)明的試劑盒，利用該試劑盒，可針對(duì)多達(dá)17個(gè)特異性先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥基因突變位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行多重巢式PCR擴(kuò)增和標(biāo)記延伸，繼而再通過(guò)簡(jiǎn)單的毛細(xì)管電泳分析等，一次獲得多達(dá)17個(gè)位點(diǎn)的基因型，彌補(bǔ)目前現(xiàn)有突變篩查方法的不足，其操作簡(jiǎn)便，成本低，且檢測(cè)通量和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性等較之CN103421908B所提供的試劑盒均有大幅提升，并優(yōu)化了部分PCR引物和延伸引物，增加了準(zhǔn)確性，降低了假陰性率，例如，新增10個(gè)位點(diǎn)，修訂了已有的3個(gè)延伸引物，檢測(cè)通量從7個(gè)位點(diǎn)提高到17個(gè)位點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度可達(dá)到近100％，具有較高的規(guī)?；R床應(yīng)用價(jià)值。上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如后。本發(fā)明的具體實(shí)施方式由以下實(shí)施例及其附圖詳細(xì)給出。附圖說(shuō)明此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：圖1是本發(fā)明一典型實(shí)施方案中利用該中國(guó)人群先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥基因篩查試劑盒進(jìn)行基因篩查的工藝流程圖；圖2是CYP21A2基因位置、鄰近結(jié)構(gòu)及本發(fā)明突變熱點(diǎn)與表型的關(guān)系圖；圖3是本發(fā)明一典型實(shí)施方案中的毛細(xì)管電泳結(jié)果及驗(yàn)證圖。具體實(shí)施方式下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例，來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。一種先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥基因篩查試劑盒、篩查方法及其應(yīng)用，它能針對(duì)目前中國(guó)人群先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥基因突變的特點(diǎn)，選擇覆蓋范圍廣泛的17個(gè)突變熱點(diǎn)作為篩查目標(biāo)，彌補(bǔ)目前現(xiàn)有突變篩查方法的不足，提供一種簡(jiǎn)單、高通量、高效能、低成本的適合中國(guó)人群的先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥基因突變篩查方法。具體而言，本發(fā)明一實(shí)施方案提供的一種先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥基因突變篩查試劑盒，其包括：(1)PCR擴(kuò)增引物混合液、延伸引物混合液、dNTP、10×PCR緩沖液、25mMMg2+離子、去離子水、FastTaq酶、SNaPshotMix混合液；(2)按一定比例混合的PCR擴(kuò)增的正向引物和反向引物；各PCR擴(kuò)增引物的濃度見(jiàn)表2；(3)按一定比例混合的的延伸引物；各延伸引物的終濃度參見(jiàn)下表2，其為推薦的使用濃度配比，具體在使用時(shí)，如果某個(gè)電泳峰的峰高過(guò)低，可適當(dāng)增加引物加入量，如果峰過(guò)高，可以適當(dāng)減少引物用量，以達(dá)到最佳檢測(cè)效果，各延伸引物的濃度見(jiàn)表3。(4)純化用SAP酶、ExonI酶及其配套的緩沖液；(5)單個(gè)位點(diǎn)純合、雜合突變的陽(yáng)性和陰性對(duì)照DNA；(6)使用說(shuō)明書(shū)。表2CYP21A2基因17個(gè)突變點(diǎn)PCR擴(kuò)增引物情況基于該試劑盒的檢測(cè)方法為：通過(guò)多重巢式PCR擴(kuò)增，使被檢測(cè)樣本的5個(gè)目的片段得到擴(kuò)增富集；然后進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的酶反應(yīng)純化，去除多余的引物及dNTP“雜質(zhì)”；再利用針對(duì)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的17條延伸引物，對(duì)17個(gè)富集的片段進(jìn)行單堿基的延伸反應(yīng)，僅對(duì)突變位點(diǎn)的單個(gè)堿基進(jìn)行熒光標(biāo)記擴(kuò)增，突變位點(diǎn)匹配上一個(gè)熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸后終止延伸；然后再進(jìn)行一次擴(kuò)增產(chǎn)物的酶反應(yīng)純化；最后經(jīng)毛細(xì)管電泳進(jìn)行擴(kuò)增片段分析，相當(dāng)于單個(gè)位點(diǎn)的微測(cè)序，這樣可以檢測(cè)單核苷酸的突變，延伸位點(diǎn)堿基的類型決定電泳峰的顏色，延伸引物的片段長(zhǎng)度決定峰的位置，延伸引物的濃度影響電泳檢測(cè)的峰高。所述試劑盒可以使用PrimerPremier5引物設(shè)計(jì)程序(加拿大PREMIER生物軟件公司)和GeneRunnerV3.05軟件(Hasting軟件公司)協(xié)助設(shè)計(jì)引物，通過(guò)多重巢式PCR擴(kuò)增，使被檢測(cè)樣本的各個(gè)目的位點(diǎn)得到擴(kuò)增富集。PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)時(shí)選擇目的區(qū)域上下游100-400bp的距離引物設(shè)計(jì)的起始部位，引物與序列匹配的特異性要好，引物間的退火溫度要盡量一致，且保持在55℃左右。使在一個(gè)多重PCR反應(yīng)中的各個(gè)擴(kuò)增引物的擴(kuò)增效率相當(dāng)。表3CYP21A2基因17個(gè)突變點(diǎn)PCR延伸引物情況所述試劑盒包含檢測(cè)以CYP21A2基因的92C→T位點(diǎn)，IVS2-13A/C→G位點(diǎn)，332-339del8bp，518T→A位點(diǎn)，704indel9bp，710T→A位點(diǎn)，713T→A位點(diǎn)，719A→T位點(diǎn)，844G→T位點(diǎn)，923-924insT位點(diǎn)，955C→T位點(diǎn)，968A→G位點(diǎn)，1069C→T位點(diǎn)，1294G→A位點(diǎn)，1360C→T位點(diǎn)，1447C→T位點(diǎn)，1450C→T位點(diǎn)等17個(gè)突變位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和延伸引物。所述PCR擴(kuò)增引物和延伸引物濃度的優(yōu)化配置，使其能夠在延伸反應(yīng)時(shí)兼顧各個(gè)位點(diǎn)的產(chǎn)量，利于后續(xù)檢測(cè)中各個(gè)位點(diǎn)突變情況的判斷識(shí)別，對(duì)于各突變位點(diǎn)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度和具體的引物序列，可以參考表3。而在擴(kuò)增結(jié)束后可采用8％聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增片段檢測(cè)，并發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)的擴(kuò)增條帶。所述PCR擴(kuò)增引物及延伸引物用于針對(duì)人類基因組中目的區(qū)域DNA的擴(kuò)增以及目的位點(diǎn)的微測(cè)序，進(jìn)而達(dá)到基因分型的目的，以實(shí)現(xiàn)特定核苷酸變異的檢測(cè)。本實(shí)施例中17個(gè)突變位點(diǎn)的延伸引物在設(shè)計(jì)時(shí)的指導(dǎo)思想是：根據(jù)不同序列情況，在突變點(diǎn)的上游或下游選取正向或反向與突變位點(diǎn)5’端或3’端序列互補(bǔ)結(jié)合的17-25bp的序列；避免序列中有難以解鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)；確保延伸的單個(gè)堿基不在序列上，并保證缺失型突變下一個(gè)堿基與缺失的堿基為不同堿基；各個(gè)延伸引物片段全長(zhǎng)應(yīng)該有一定的差異，通過(guò)在片段的5’端加上若干個(gè)T，使得延伸引物長(zhǎng)度均勻分布在18-60bp之間(參見(jiàn)表5)，以便于通過(guò)毛細(xì)管電泳分離檢測(cè)(其序列參見(jiàn)表3)。這樣經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，帶有不同熒光的不同長(zhǎng)度的片段經(jīng)毛細(xì)管電泳后就能夠分析出相應(yīng)片段所攜帶的堿基類型，進(jìn)而可以判斷是否存在該堿基的突變，并區(qū)分屬于野生型、純合突變還是雜合突變，使上述17個(gè)位點(diǎn)一次性得到精確的基因分型。這樣，經(jīng)過(guò)對(duì)突變位點(diǎn)的單個(gè)堿基進(jìn)行熒光標(biāo)記單堿基延伸擴(kuò)增后，再進(jìn)行一次擴(kuò)增產(chǎn)物的酶法純化，帶有不同熒光的不同長(zhǎng)度的片段經(jīng)毛細(xì)管電泳后就能夠分析出相應(yīng)片段所攜帶的堿基類型，延伸位點(diǎn)堿基的類型決定電泳峰的顏色，延伸引物的片段長(zhǎng)度決定峰的位置，延伸引物的濃度影響電泳檢測(cè)的峰高。峰的顏色為綠色代表A堿基，藍(lán)色為G堿基，紅色為T(mén)堿基，黑色為C堿基，如表4所示。表4熒光標(biāo)記色根據(jù)峰的顏色可以清楚方便的判斷為野生型(正常)還是突變型，如表5所示。前述CYP21A2基因的1447C→T、955C→T、92C→T、713A→T、719A→T、IVS2-13A/C→G、704indel9bp、1360C→T、1069C→T、844G→T、923-924insT、332-339del8bp、968A→G、710A→T、1450C→T、518T→A、1294G→A位點(diǎn)的延伸引物片段在經(jīng)過(guò)毛細(xì)管電泳后的理論長(zhǎng)度可如表5所示，在實(shí)際電泳過(guò)程存在位置飄移現(xiàn)象，尤其是對(duì)于發(fā)生了突變的位點(diǎn)而言，其峰漂移更多，即與毛細(xì)管電泳分子量marker-LIZ所測(cè)片段大小有差距，但不會(huì)影響整體結(jié)果判讀。表5CYP21A2基因突變熱點(diǎn)野生型與突變型顏色標(biāo)記*所示設(shè)計(jì)為反向測(cè)序反應(yīng)，因此在毛細(xì)管電泳結(jié)果中野生型與突變型均要按反向測(cè)序去判斷。CYP21A2基因的92位點(diǎn)，正向測(cè)序突變類型為C→T，反向測(cè)序即為G→A；518位點(diǎn)正向測(cè)序突變類型為T(mén)→A，反向測(cè)序即為A→T；710位點(diǎn)正向測(cè)序突變類型為T(mén)→A，反向測(cè)序即為A→T；713位點(diǎn)正向測(cè)序突變類型為T(mén)→A，反向測(cè)序即為A→T；719位點(diǎn)正向測(cè)序突變類型為T(mén)→A，反向測(cè)序即為A→T；1450位點(diǎn)正向測(cè)序突變類型為C→T，反向測(cè)序即為G→A。本實(shí)施例中設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物和延伸引物序列是通過(guò)核酸合成儀人工合成，并與PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑，包括：dNTP、5×和10×PCR緩沖液、Mg2+離子、去離子水、FastTaq酶、SNaPshotMix混合液、純化用SAP酶、ExonI酶及其配套的緩沖液；17個(gè)位點(diǎn)雜合突變型的混合DNA陽(yáng)性標(biāo)本，以及說(shuō)明書(shū)組合起來(lái)，提供用于體外檢測(cè)葉酸利用能力基因突變篩查的試劑盒，其主要功能在于，將所需的試劑集成在一個(gè)小盒內(nèi)，使得核酸片段擴(kuò)增、純化可以在試劑盒提供試劑的基礎(chǔ)上順序完成。參圖1所示，本實(shí)施例中的具體操作包括：(1)針對(duì)CYP21A2基因2個(gè)區(qū)段進(jìn)行巢式多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系總體積10μL，10×PCR緩沖液1.0μL、MgCl2(25mM)1.0μL、dNTP(2mM)1.5μL、PrimerMix4.0μL、FastTaqE(5U/μL)0.15μL、模板DNA(20ng/μL)0.8μL、H2O1.55μL；初級(jí)PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min，28個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸7min，4℃保存。初級(jí)PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為次級(jí)PCR的模板進(jìn)行次級(jí)PCR反應(yīng)，次級(jí)PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，66℃退火59s，每循環(huán)降0.5℃，72℃延伸59s，11個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，61℃退火50s，72℃延伸50s，14個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸10min，4℃保存。擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1。(2)PCR產(chǎn)物純化：反應(yīng)體系總體積6μL，ddH2O2.8μL、SAP酶(1.0U/μL)1.8μL、ExonI酶(5.0U/μL)0.4μL、上述PCR產(chǎn)物1.0μL；應(yīng)程序：37℃反應(yīng)80min，80℃終止反應(yīng)15min，4℃保存。(3)標(biāo)記延伸：反應(yīng)體系總體積6.0μL，ddH2O1.8μL，5×SeqBuffer1.2μL，混合延伸引物(E-Primer)1.0μL、SNaPshotMix1.0μL，上述純化產(chǎn)物1μL；PCR反應(yīng)程序：96℃預(yù)變性1min；96℃變性10s，52℃退火5s，60℃延伸30s，28個(gè)循環(huán)，4℃保存。延伸引物序列見(jiàn)表3。(4)二次純化：反應(yīng)總體積6.7μL，反應(yīng)結(jié)束后每反應(yīng)產(chǎn)物中加入SAP酶(1.0U/μL)0.7μL；反應(yīng)程序：37℃反應(yīng)60min，75℃滅活反應(yīng)15min，4℃保存。(5)毛細(xì)管電泳：反應(yīng)體系總體積10.2μL，Hi-Di甲酰胺(ABI公司)9μL，內(nèi)標(biāo)LIZ-120(ABI公司)0.2μL，第二次純化產(chǎn)物1μL；反應(yīng)程序：95℃變性5min，立即置冰上5min。在ABI公司遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，應(yīng)用GeneMapper系列軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集和分析。(6)結(jié)果分析：根據(jù)峰顏色來(lái)區(qū)分野生型、雜合突變和純合突變，得出其多態(tài)圖譜，分析其基因型，參照?qǐng)D3所示，其中A所示為正常對(duì)照樣本SNaPshot基因分型毛細(xì)管電泳峰圖，其中，電泳順序由左向右依次為：1294C→T、1447G→A、955C→T、92G→A、713A→T、719A→T、IVS2-13A/C→G、704indel9bp、1360G→A、1069C→T、844G→T、923-924insT、332-339del8bp、968T→C、710A→T、1450G→A、518A→T、(理論上的片段長(zhǎng)度分別為22bp，21bp，24bp，24bp，23bp，26bp，30bp，25bp，46bp，34bp，36bp，36bp，40bp，39bp，40bp，47bp和42bp。實(shí)際電泳過(guò)程存在飄移現(xiàn)象，即與分子量標(biāo)記所測(cè)片段大小有一定差距，如25bp的野生型704indel9bp片段會(huì)飄移到30bp的IVS2-13A/C→G片段右面，46bp的野生型1360C→T片段會(huì)飄移到34bp的1069C→T片段左面，24bp的突變型955C→T片段會(huì)飄移到30bp的IVS2-13A/C→G片段處，但不會(huì)影響整體結(jié)果判讀)；B所示為患者12CH005-1的毛細(xì)管電泳峰圖(表示突變位置)；C所示為患者12CH005-1的955C→T和位點(diǎn)純合突變測(cè)序結(jié)果；D所示為患者12CH013-1的毛細(xì)管電泳峰圖(表示突變位置)；E1所示為患者12CH013-1的IVS2-13A/C>G和1069C→T位點(diǎn)雜合突變測(cè)序結(jié)果。(7)測(cè)序法可靠性的檢測(cè)通過(guò)突變檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)“基因測(cè)序”的方法對(duì)各突變熱點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示應(yīng)用此技術(shù)檢測(cè)的特異性和敏感性均達(dá)到了100％。本具體實(shí)施方式具有高通量、高效能、低成本、簡(jiǎn)單適用，適合中國(guó)人群先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥基因篩查檢測(cè)。采用多重巢式PCR加上引物延伸微測(cè)序技術(shù)，在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)完成17個(gè)位點(diǎn)的基因分型。以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。在本實(shí)施例中，提供了一種適用于新生兒足跟血片或疑似腎上腺皮質(zhì)增生癥檢測(cè)DNA庫(kù)的試劑盒(96人份)，其可在體外完成中國(guó)人群先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥基因突變熱點(diǎn)篩查。1、檢測(cè)樣本樣本來(lái)源于蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心常規(guī)新生兒遺傳代謝性疾病篩查后剩余的干血片標(biāo)本或疑似患者家屬DNA文庫(kù)，庫(kù)中所有患者樣本收集前均簽署了知情同意書(shū)，并承諾配合后續(xù)的診療和隨訪。2、檢測(cè)方案見(jiàn)具體實(shí)施方式的檢測(cè)方法。3、檢測(cè)結(jié)果根據(jù)野生型電泳峰型顏色和突變峰型顏色不同進(jìn)行判斷，均發(fā)現(xiàn)了5例陽(yáng)性干血片的致病位點(diǎn)和7例疑似患者及其家屬DNA的致病位點(diǎn)，以上均進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示應(yīng)用此技術(shù)檢測(cè)的特異性和敏感性均達(dá)到了100％。表6a疑似高危樣本CYP21A2基因檢測(cè)結(jié)果aSNaPshot結(jié)果純合突變：●；SNaPshot結(jié)果雜合突變：○；測(cè)序結(jié)果純合突變：◆；測(cè)序結(jié)果雜合突變：◇表6b疑似高危樣本CYP21A2基因檢測(cè)結(jié)果bSNaPshot結(jié)果純合突變：●；SNaPshot結(jié)果雜合突變：○；測(cè)序結(jié)果純合突變：◆；測(cè)序結(jié)果雜合突變：◇表6a、表6b中，5例陽(yáng)性干血片標(biāo)本患者和9例疑似患者及其家屬DNA的SNaPshot結(jié)果有3例患者是復(fù)合雜合/純合突變，其中2例是Q318X/R356W復(fù)合純合突變，1例是IVS2-13A/C>G/R356W復(fù)合雜合突變；3例患者是單堿基IVS2A/C>G純合突變，1例是單堿基I172N純合突變，1例單堿基IVS2A/C>G雜合突變，1例是單堿基R356W純合突變，1例是單堿基R356W雜合突變。本發(fā)明的篩查方法及試劑盒使用方便，操作簡(jiǎn)單，成本低，通量高，檢測(cè)結(jié)果直接可靠，適合于中國(guó)人群先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥基因的大規(guī)模篩查。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3