本發(fā)明涉及微生物菌劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種巨大芽孢桿菌B16及其菌劑和菌劑制備方法。
背景技術(shù)：
：農(nóng)業(yè)生產(chǎn)長(zhǎng)期依賴化學(xué)肥料，不僅浪費(fèi)大量不可再生資源，還導(dǎo)致土質(zhì)變差、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降和環(huán)境污染等環(huán)境問(wèn)題，極大影響了人類(lèi)的健康生存。巨大芽孢桿菌是一種解磷促鉀固氮細(xì)菌，能夠很好的降解土壤中不能被植物利用的磷、鉀，提高土壤肥力，同時(shí)固定空氣中的氮?dú)?，促進(jìn)作物增產(chǎn)。但現(xiàn)有的巨大芽孢桿菌不具有固氮酶活性和分泌生長(zhǎng)素的能力，導(dǎo)致巨大芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種巨大芽孢桿菌B16，其具有固氮酶活性和分泌生長(zhǎng)素吲哚乙酸的功能。本發(fā)明的另一目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種巨大芽孢桿菌B16菌劑，具有較高的固氮酶活性且能分泌生長(zhǎng)素，農(nóng)業(yè)應(yīng)用范圍廣，經(jīng)濟(jì)效益高。本發(fā)明的另一目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種巨大芽孢桿菌B16菌劑制備方法，工藝簡(jiǎn)單成熟，可規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。一種巨大芽孢桿菌B16，所述巨大芽孢桿菌B16的分類(lèi)命名：巨大芽孢桿菌B16BacillusmegateriumB16，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ChinaCenterforTypeCollection)，地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏日期：2015年12月15日，保藏編號(hào)：CCTCCNO：M2015750。所述巨大芽孢桿菌B16具有序列表NO.1的DNA序列。所述巨大芽孢桿菌B16的固氮酶活性為698.367-880.165nmol/(mL·h)，其在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生吲哚乙酸，吲哚乙酸的分泌量為400-600mg/L。固氮酶活性測(cè)定1、試驗(yàn)方法采用乙炔還原法對(duì)各菌株的固氮酶活性進(jìn)行測(cè)定。將保存的各菌株用VM-Ethanol固體培養(yǎng)基活化，用接種環(huán)挑取1環(huán)菌體于1.5mL的無(wú)菌離心管中，用無(wú)菌水稀釋，按相同接種量接入裝有5mL半固體培養(yǎng)基的10mL試管中，用反口橡膠塞密封。37℃培養(yǎng)24h后，注入1/10體積的10%乙炔氣體，繼續(xù)培養(yǎng)24h，從試管中抽取0.5mL氣體注入氣相色譜儀(北京天普分析儀器廠SP-2100)中，測(cè)定乙炔、乙烯的含量。按下列公式計(jì)算固氮酶活性大?。篊=(hx×c×V)/(24.9×hs×t)(2.1)其中，hx為樣品峰面積值；hs為標(biāo)準(zhǔn)C2H4峰面積值；c為標(biāo)準(zhǔn)C2H4濃度(nmol/mL)；V為培養(yǎng)容器體積(mL)；t為樣品培養(yǎng)時(shí)間(h)；C為產(chǎn)生的C2H4濃度[nmol/(mL·h)]。2、試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合公式(2.1)和固氮酶活性測(cè)定圖4得知，固氮酶活性為698.367-880.165nmol/(mL·h)。由此可以說(shuō)明，巨大芽孢桿菌B16在代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生特定的固氮酶，可以自生固定大氣中的氮?dú)?。生長(zhǎng)素定性含量測(cè)定（1）挑取菌株分別接種（OD600=1.0，0.5mL菌懸液）到盛有50mLKing液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，每組3個(gè)重復(fù)。（2）接種完畢后，將三角瓶置于搖床上，28℃，125rpm，培養(yǎng)3d，待測(cè)。（3）將上述在King液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3d的菌懸液50μL置于透明離心管中，同時(shí)加50μL比色液。（4）設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照中加入50μL濃度為10mg/L的植物生長(zhǎng)激素（IAA），同時(shí)加50μL比色液。陰性對(duì)照中加50μLKing液體培養(yǎng)基，同時(shí)加50μL比色液。（5）將陽(yáng)性對(duì)照液、陰形對(duì)照液和測(cè)定液置于白陶瓷板并置于室溫下15min，觀察其顏色變化，顏色變紅者為陽(yáng)性，表示能夠分泌IAA，且顏色越深表示分泌IAA的能力越強(qiáng)；若不變色則為陰性，表示該菌株不能分泌IAA，由此作為判斷依據(jù)進(jìn)行判斷分析。培養(yǎng)基為King培養(yǎng)基(1L)；試劑配方為蛋白胨20g，K2HPO41.725g，MgSO4·7H2O1.5g，丙三醇15mL，色氨酸0.1g，蒸餾水1000mL。生長(zhǎng)素定量測(cè)定參照Riberio等的方法略加改動(dòng)。菌株B16接種到含有1g/L色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，30℃，180r/min，振蕩培養(yǎng)48h。將培養(yǎng)液10000r/min離心5min，取100mL上清液加到96孔板中，與100mLSalkowski’s試劑（1mL0.5mol/LFeCl3和49mL35%高氯酸）混勻，室溫靜置30min，在波長(zhǎng)530nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。用不同濃度的IAA標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。表1菌株B16IAA測(cè)定結(jié)果菌株B16D2D5D68IAA濃度（mg/L）485.68364.20294.16531.44從表1和圖5可以看出，巨大芽孢桿菌B16的生長(zhǎng)素濃度為485.68mg/L，因此，可以判斷巨大芽孢桿菌B16在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生IAA，具有促進(jìn)作物生長(zhǎng)的功能。一種巨大芽孢桿菌B16的菌劑制備方法，包括以下步驟：（1）分離、篩選選取含有巨大芽孢桿菌B16的固氮菌菌落的土樣，經(jīng)分離篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)得到固氮菌菌落；（2）純化、保存在純化保存培養(yǎng)基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進(jìn)行劃線純化，培養(yǎng)分離得到巨大芽孢桿菌B16單菌落，保存該單菌落備用；（3）培養(yǎng)基培養(yǎng)利用種子/發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)單菌落，得到微生物液體發(fā)酵液；（4）B16發(fā)酵液制備取B16試管斜面1支，用無(wú)菌水沖洗后，將單菌落接種于裝有300-350ml滅菌的種子培養(yǎng)基中，設(shè)置搖床培養(yǎng)溫度為30-35℃、轉(zhuǎn)速為180-200rpm，培養(yǎng)36-42小時(shí)，即得到種子液。將種子液在無(wú)菌條件下接種于裝有32-35L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)42-48小時(shí)，得到液體發(fā)酵液。檢查液體發(fā)酵液含B16活菌數(shù)為65-72億/ml，備用。采用50L全自動(dòng)發(fā)酵罐液體培養(yǎng)B16。發(fā)酵罐培養(yǎng)條件設(shè)置如下：溫度pH裝液量接種量轉(zhuǎn)速通氣量培養(yǎng)時(shí)間30℃7.1-7.435L300ml180rpm1.2vvm48h（5.1）巨大芽孢桿菌B16液體菌劑制劑化取適量液體發(fā)酵液，分裝于無(wú)菌蓋瓶中，每個(gè)蓋瓶中稱取添加乙酸鈉6-10g，在室溫環(huán)境下，放置，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《微生物肥料》（GB20287-2006）規(guī)定的方法測(cè)定其活菌數(shù)為2.0-6.0億/g，得到巨大芽孢桿菌B16液體菌劑。（5.1.1）試驗(yàn)設(shè)置處理一：取液體發(fā)酵液500ml，分裝于2個(gè)500ml無(wú)菌藍(lán)蓋瓶中；處理二：取液體發(fā)酵液500ml，分裝于2個(gè)500ml無(wú)菌藍(lán)蓋瓶中，每個(gè)藍(lán)蓋瓶中稱取添加乙酸鈉7.5g；處理三：取液體發(fā)酵液500ml，分裝于2個(gè)500ml無(wú)菌藍(lán)蓋瓶中，每個(gè)藍(lán)蓋瓶中稱取添加蔗糖7.5g。上述三個(gè)處理結(jié)果均放置在室溫環(huán)境下，在放置第1天、7天、15天、30天、60天、120天、180天，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《微生物肥料》（GB20287-2006）規(guī)定的方法測(cè)定活菌數(shù)。（5.1.2）試驗(yàn)結(jié)果由此可以看出，處理二中的巨大芽孢桿菌B16液體菌劑活菌計(jì)數(shù)結(jié)果最佳。一種巨大芽孢桿菌B16的菌劑制備方法，包括以下步驟：（1）分離、篩選選取含有巨大芽孢桿菌B16的固氮菌菌落的土樣，經(jīng)分離篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)得到固氮菌菌落；（2）純化、保存在純化保存培養(yǎng)基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進(jìn)行劃線純化，培養(yǎng)分離得到巨大芽孢桿菌B16單菌落，保存該單菌落備用；（3）培養(yǎng)基培養(yǎng)利用種子/發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)單菌落，得到微生物菌液；（4）B16發(fā)酵液制備取B16試管斜面1支，用無(wú)菌水沖洗后，將微生物菌液接種于裝有300-350ml滅菌的種子培養(yǎng)基中，設(shè)置搖床培養(yǎng)溫度為30-32℃、轉(zhuǎn)速為180-200rpm，培養(yǎng)36-42小時(shí)，即得到發(fā)酵種子液。將種子液在無(wú)菌條件下接種于裝有30-35L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)42-48小時(shí)。檢查發(fā)酵液含B16活菌數(shù)為65-72億/ml，備用。（5.2）B16固體菌劑原粉制備采用離心機(jī)，離心，獲得B16純菌體，用碳酸鈣進(jìn)行吸附B16純菌體，置于烘箱干燥，粉碎機(jī)打粉即為B16固體菌劑原粉，測(cè)定活菌數(shù)為180-190億/g，備用；具體地，采用BACKMAN離心機(jī)，8000rpm離心15-20min，獲得B16純菌體。用碳酸鈣進(jìn)行吸附B16純菌體，置于45-60℃烘箱干燥6-8小時(shí)，粉碎機(jī)打粉即為B16固體菌劑原粉。具體地，測(cè)定活菌數(shù)為186.9億/g，備用；（6.1）巨大芽孢桿菌B16粉狀菌劑制劑化將菌體原粉、安琪酵母有機(jī)質(zhì)、硫酸銨、硫酸鉀與磷酸一銨按比例混合，在室溫環(huán)境下放置，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《復(fù)合微生物肥料》（NY/T798-2004）規(guī)定的方法測(cè)定活菌數(shù)為0.2-2.0億/g，得到巨大芽孢桿菌B16粉狀菌劑。優(yōu)選地，菌體原粉、安琪酵母有機(jī)質(zhì)、硫酸銨、硫酸鉀與磷酸一銨的混合質(zhì)量比為1-2：46-90：1-2：1-2：1-2。（6.1.1）試驗(yàn)設(shè)置處理一：稱取菌體原粉10g，與490g安琪酵母有機(jī)質(zhì)混合；處理二：稱取菌體原粉10g，與475g安琪酵母有機(jī)質(zhì)、5g硫酸銨、5g硫酸鉀、5g磷酸一銨混合；處理三：稱取菌體原粉10g，與460g安琪酵母有機(jī)質(zhì)、10g硫酸銨、10g硫酸鉀、10g磷酸一銨混合；處理四：稱取菌體原粉10g，與445g安琪酵母有機(jī)質(zhì)、15g硫酸銨、15g硫酸鉀、15g磷酸一銨混合。上述四個(gè)處理結(jié)果均放置在室溫環(huán)境下，在放置第1天、7天、15天、30天、60天、120天、180天，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《復(fù)合微生物肥料》（NY/T798-2004）規(guī)定的方法測(cè)定活菌數(shù)0.3-3.9億/g。（6.1.2）試驗(yàn)結(jié)果：處理三中的巨大芽孢桿菌B16液體菌劑活菌計(jì)數(shù)結(jié)果最佳。一種巨大芽孢桿菌B16的菌劑制備方法，包括以下步驟：（1）分離、篩選選取含有巨大芽孢桿菌B16的固氮菌菌落的土樣，經(jīng)分離篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)得到固氮菌菌落；（2）純化、保存在純化保存培養(yǎng)基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進(jìn)行劃線純化，培養(yǎng)分離得到巨大芽孢桿菌B16單菌落，保存該單菌落備用；巨大芽孢桿菌B16單菌落如圖1所示。（3）培養(yǎng)基培養(yǎng)利用種子/發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)單菌落，得到微生物菌液；（4）B16發(fā)酵液制備取B16試管斜面1支，用無(wú)菌水沖洗后，接種于裝有300-350ml滅菌的種子培養(yǎng)基中，設(shè)置搖床培養(yǎng)溫度為30-32℃、轉(zhuǎn)速為180-210rpm，培養(yǎng)36-42小時(shí)，即得到發(fā)酵種子液。將種子液在無(wú)菌條件下接種于裝有30-35L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)42-48小時(shí)。檢查發(fā)酵液含B16活菌數(shù)為65-72億/ml，備用。（5.2）B16固體菌劑原粉制備采用BACKMAN離心機(jī)，8000rpm離心15-20min，獲得B16純菌體。用碳酸鈣進(jìn)行吸附B16純菌體，置于45-60℃烘箱干燥6-8小時(shí)，粉碎機(jī)打粉即為B16固體菌劑原粉。測(cè)定活菌數(shù)為180-190億/g，備用；（6.2）巨大芽孢桿菌B16顆粒菌劑制劑化將菌體原粉、安琪酵母有機(jī)質(zhì)、硫酸銨、硫酸鉀與磷酸一銨、膨潤(rùn)土按比例混合，在室溫環(huán)境下放置，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《復(fù)合微生物肥料》（NY/T798-2004）規(guī)定的方法測(cè)定活菌數(shù)0.2-2.0億/g。優(yōu)選地，菌體原粉、安琪酵母有機(jī)質(zhì)、硫酸銨、硫酸鉀、磷酸一銨、膨潤(rùn)土的混合質(zhì)量比為1-2：41-80：1-2：1-2：1-2：5-10。（6.2.1）試驗(yàn)設(shè)置處理一：稱取菌體原粉10g，與440g安琪酵母有機(jī)質(zhì)、50g膨潤(rùn)土混合造粒；處理二：稱取菌體原粉10g，與410g安琪酵母有機(jī)質(zhì)、10g硫酸銨、10g硫酸鉀、10g磷酸一銨、50g膨潤(rùn)土混合造粒；上述2個(gè)處理結(jié)果均放置在室溫環(huán)境下，在放置第1天、7天、15天、30天、60天、120天、180天，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《復(fù)合微生物肥料》（NY/T798-2004）規(guī)定的方法測(cè)定活菌數(shù)。（6.2.2）試驗(yàn)結(jié)果：處理二中的巨大芽孢桿菌B16液體菌劑活菌計(jì)數(shù)結(jié)果最佳。所述步驟（1）分離、篩選的具體方法為：選取土樣，加入含吐溫80的無(wú)菌水，震蕩，靜置，取上清液離心，棄上清液，保留沉淀物，加入含吐溫80的無(wú)菌水懸浮，離心，去沉淀，將上清液離心，棄上清液，保留沉淀物，將沉淀物用磷酸緩沖液懸浮，得到樣品液；取上述樣品液與磷酸緩沖液懸浮混合，得到稀釋菌懸液；將稀釋的菌懸液水浴加熱，自然冷卻后吸取涂布于無(wú)氮培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得固氮菌菌落。更具體地，分離、篩選的方法為：從廣東省東莞市南城區(qū)人民公園花壇500g土樣，加入3L含0.01%吐溫80的無(wú)菌水，震蕩10min，靜置半個(gè)小時(shí)，取上清液于20℃下8000rpm離心20min。棄上清液，保留沉淀物，加入30-50mL含0.01%吐溫80的無(wú)菌水懸浮，液體于20℃下5000rpm離心5秒鐘，去沉淀，將上清液倒入一個(gè)干無(wú)菌離心管中于20℃下6000rpm離心10min，棄上清液，保留沉淀物，將沉淀物用10mL的pH7.0磷酸緩沖液懸浮，得到樣品液；取1mL上述樣品液與9mL磷酸緩沖液懸浮混合，即為10倍稀釋菌懸液。將稀釋的菌懸液置于75℃水浴加熱15min，自然冷卻后吸取100μL涂布于無(wú)氮培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)36-48小時(shí)獲得含巨大芽孢桿菌B16的固氮菌菌落。所述步驟（1）中，分離篩選培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料制成：CaCO31.0-1.4g，MgSO4·7H2O0.6-1.2g，K2HPO41.0-2.0g，NaCl0.1-0.4g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.001-0.005g，NaMO4·2H2O0.05-0.1g，蔗糖5-10g，瓊脂18-20g，蒸餾水1000ml，pH7.1-7.4。本發(fā)明的分離篩選培養(yǎng)基為改良無(wú)氮培養(yǎng)基。所述純化保存的具體方法為：在純化保存培養(yǎng)基上將分離、篩選獲得的菌落進(jìn)行劃線純化，30℃恒溫培養(yǎng)36-48小時(shí)分離得到枯草芽孢桿菌B16單菌落。將平板上出現(xiàn)的單菌落保存在試管中，30℃恒溫培養(yǎng)36-48小時(shí)，置于4℃冰箱中保存。巨大芽孢桿菌B16保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)碼為：CCTCCM2015750。（2）純化保存培養(yǎng)基的配方為：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂18.0g，蒸餾水1000ml，純化保存培養(yǎng)基的pH為7.0-7.4。所述步驟（3）培養(yǎng)基培養(yǎng)中，培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料制成：CaCO31.0-1.4g，MgSO4·7H2O0.6-1.2g，K2HPO41.0-2.0g，NaCl0.1-0.4g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.001-0.005g，NaMO4·2H2O0.05-0.1g，蔗糖5-10g，瓊脂18-20g，蒸餾水1000ml，培養(yǎng)基的pH為7.1-7.4。所述步驟（2）和步驟（3）之間還包括有以下步驟：（S1）革蘭氏染色：將純化后的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，篩選得到陽(yáng)性菌；（S2）芽孢染色：將陽(yáng)性菌進(jìn)行芽孢染色，篩選得到含有芽孢的革蘭氏陽(yáng)性菌單菌落。芽孢染色及其革蘭氏染色革蘭氏染色和芽孢染色是兩種細(xì)菌鑒定的常規(guī)方法，染色可以縮小鑒定范圍。未經(jīng)染色的細(xì)菌與周?chē)h(huán)境折光率差別甚小，在顯微鏡下極難觀察。革蘭氏染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對(duì)比，可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些菌種屬于革蘭氏陽(yáng)性（G+）或者革蘭氏陰性菌（G-），用以分類(lèi)鑒定。革蘭氏陰性菌普遍存在安全隱患，在農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用過(guò)程中直接高溫滅菌后舍棄結(jié)構(gòu)特征。芽孢染色將菌體內(nèi)的芽孢進(jìn)行染色，可以直觀觀察芽孢的大小、位置、形狀等特點(diǎn)，進(jìn)一步縮小其鑒定范圍。芽孢桿菌具有保質(zhì)期長(zhǎng)，易于存放的特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)微生物產(chǎn)品具有廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)。、革蘭氏染色（1）涂片：在無(wú)菌操作臺(tái)中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除玻片上的雜質(zhì)。在載玻片中央滴一滴無(wú)菌水，挑取單個(gè)菌落于水滴中，用灼燒過(guò)的接種環(huán)涂抹均勻。將樣品載玻片在火燈上方來(lái)回過(guò)3次，以固定細(xì)胞。（2）初染：滴加2-5滴草酸銨結(jié)晶紫染液，染1min，傾去染液，流水沖洗至無(wú)紫色。（3）媒染：先用新配的碘液（碘1.0g、碘化鉀2.0g、蒸餾水300.0mL）沖去殘水，再用碘液覆蓋涂面1min，后水洗。（4）脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約15－20秒后，立即用流水沖洗。（5）復(fù)染：滴加1滴番紅染色液，染3－5min，水洗后用吸水紙吸干。（6）鏡檢：將載玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。、芽孢染色在無(wú)菌操作臺(tái)中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除玻片上的雜質(zhì)。在載玻片中央滴一滴無(wú)菌水，挑取單個(gè)菌落水滴中，用灼燒過(guò)的接種環(huán)涂抹均勻。將樣品載玻片在火燈上方來(lái)回過(guò)3次，以固定細(xì)胞。在涂布菌體的區(qū)域滴加1-2滴石碳酸堿性復(fù)紅染液，染色3min。用蒸餾水沖洗掉染液，風(fēng)干后，將載玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察。如圖2和圖3所示，通過(guò)革蘭氏染色和芽孢染色結(jié)果可以看出，巨大芽孢桿菌B16為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀，含有芽孢。一種巨大芽孢桿菌B16的菌劑，由上述一種巨大芽孢桿菌B16的菌劑制備方法制備而成。本發(fā)明的有益效果：（1）本發(fā)明以巨大芽孢桿菌B16為出發(fā)菌株，對(duì)其固氮酶活性以及分泌生長(zhǎng)素能力進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)菌株B16具有高效的固氮酶活性和分泌IAA能力?？梢酝ㄟ^(guò)自生固氮減少水稻、玉米等禾本科作物的生長(zhǎng)過(guò)程中所需要的氮素添加量，還能夠分泌生長(zhǎng)素（吲哚乙酸）促進(jìn)植物生長(zhǎng)。所述巨大芽孢桿菌B16的固氮酶活性為698.367-880.165nmol/(mL·h)，其在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生吲哚乙酸的分泌量為400-600mg/L。在微生物肥料應(yīng)用領(lǐng)域具有十分可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。（2）本發(fā)明利用該巨大芽孢桿菌B16將其制備成三種B16菌劑，即液體菌劑、粉狀菌劑和顆粒菌劑，為其投入到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中提供了便利。（3）本發(fā)明利用該巨大芽孢桿菌B16將其制備成三種B16菌劑，具備同類(lèi)行業(yè)產(chǎn)品不具備的多樣性，同時(shí)保證了該微生物肥料對(duì)不同作物的生長(zhǎng)環(huán)境的強(qiáng)效適應(yīng)性。附圖說(shuō)明利用附圖對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但附圖中的實(shí)施例不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)以下附圖獲得其它的附圖。圖1為分離得到的巨大芽孢桿菌B16單菌落在顯微鏡下放大10×100倍的菌落圖。圖2為巨大芽孢桿菌B16革蘭氏染色結(jié)果圖。圖3為巨大芽孢桿菌B16芽孢染色結(jié)果圖。圖4為巨大芽孢桿菌B16固氮酶活性測(cè)定結(jié)果圖。圖5為巨大芽孢桿菌B16IAA比色效果圖。具體實(shí)施方式結(jié)合以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。實(shí)施例1本實(shí)施例的一種巨大芽孢桿菌B16，所述巨大芽孢桿菌B16保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCM2015750。所述巨大芽孢桿菌B16具有序列表NO.1的DNA序列。所述巨大芽孢桿菌B16的固氮酶活性為698.367nmol/(mL·h)，其在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生吲哚乙酸的分泌量為400mg/L。一種巨大芽孢桿菌B16的菌劑制備方法，包括以下步驟：（1）分離、篩選選取含有巨大芽孢桿菌B16的固氮菌菌落的土樣，經(jīng)分離篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)得到固氮菌菌落；（2）純化、保存在純化保存培養(yǎng)基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進(jìn)行純化，培養(yǎng)分離得到巨大芽孢桿菌B16單菌落，保存該單菌落備用；（3）培養(yǎng)基培養(yǎng)利用培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)單菌落，為培養(yǎng)菌體發(fā)酵液做準(zhǔn)備；（4）B16發(fā)酵液制備將單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，設(shè)置搖床培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，即得到種子液，將種子液在無(wú)菌條件下接種于含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，得到液體發(fā)酵液；（5.1）巨大芽孢桿菌B16液體菌劑制劑化取適量液體發(fā)酵液，分裝于無(wú)菌蓋瓶中，每個(gè)蓋瓶中稱取添加乙酸鈉8g，在室溫環(huán)境下，放置，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《微生物肥料》（GB20287-2006）規(guī)定的方法測(cè)定其活菌數(shù)為2.0億/g，得到巨大芽孢桿菌B16液體菌劑。所述步驟（1）分離、篩選的具體方法為：選取土樣，加入含吐溫80的無(wú)菌水，震蕩，靜置，取上清液離心，棄上清液，保留沉淀物，加入含吐溫80的無(wú)菌水懸浮，離心，去沉淀，將上清液離心，棄上清液，保留沉淀物，將沉淀物用磷酸緩沖液懸浮，得到樣品液；取上述樣品液與磷酸緩沖液懸浮混合，得到稀釋菌懸液；將稀釋的菌懸液水浴加熱，自然冷卻后吸取涂布于無(wú)氮培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得固氮菌菌落。所述步驟（1）中，分離篩選培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料制成：CaCO31.0g，MgSO4·7H2O0.6g，K2HPO41.0g，NaCl0.1g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.001g，NaMO4·2H2O0.05g，蔗糖5g，瓊脂18g，蒸餾水1000ml，pH7.1。實(shí)施例2本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于：本實(shí)施例的所述步驟（2）和步驟（3）之間還包括有以下步驟：（S1）革蘭氏染色：將純化后的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，篩選得到陽(yáng)性菌；（S2）芽孢染色：將陽(yáng)性菌進(jìn)行芽孢染色，篩選得到含有芽孢的革蘭氏陽(yáng)性菌單菌落。一種巨大芽孢桿菌B16的菌劑，由本實(shí)施例所述的一種巨大芽孢桿菌B16的菌劑制備方法制備而成。本實(shí)施例的其余內(nèi)容與實(shí)施例1相同，這里不再贅述。實(shí)施例3本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于：本實(shí)施例的所述巨大芽孢桿菌B16的固氮酶活性為720.138nmol/(mL·h)，其在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生吲哚乙酸的分泌量為420.53mg/L。本實(shí)施例的巨大芽孢桿菌B16液體菌劑，其活菌數(shù)為4億/g。本實(shí)施例的其余內(nèi)容與實(shí)施例1相同，這里不再贅述。實(shí)施例4本實(shí)施例與實(shí)施例1或2的不同之處在于，本實(shí)施例的一種巨大芽孢桿菌B16的菌劑制備方法，包括以下步驟：（1）分離、篩選選取含有巨大芽孢桿菌B16的固氮菌菌落的土樣，經(jīng)分離篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)得到固氮菌菌落；（2）純化、保存在純化保存培養(yǎng)基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進(jìn)行純化，培養(yǎng)分離得到巨大芽孢桿菌B16單菌落，保存該單菌落備用；（3）培養(yǎng)基培養(yǎng)利用培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)單菌落，得到微生物菌液；（4）B16發(fā)酵液制備將微生物菌液接種于種子培養(yǎng)基中，設(shè)置搖床培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，即得到發(fā)酵種子液，將發(fā)酵種子液在無(wú)菌條件下接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)；（5.2）B16固體菌劑原粉制備發(fā)酵罐中培養(yǎng)后的產(chǎn)物采用離心機(jī)，離心，獲得B16純菌體，用碳酸鈣進(jìn)行吸附B16純菌體，置于烘箱干燥，粉碎機(jī)打粉即為B16固體菌劑原粉，測(cè)定活菌數(shù)為183.86億/g，備用；（6.1）巨大芽孢桿菌B16粉狀菌劑制劑化將菌體原粉、安琪酵母有機(jī)質(zhì)、硫酸銨、硫酸鉀與磷酸一銨的混合質(zhì)量比為1：50：1：1：2，在室溫環(huán)境下放置，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《復(fù)合微生物肥料》（NY/T798-2004）規(guī)定的方法測(cè)定活菌數(shù)為0.3億/g，得到巨大芽孢桿菌B16粉狀菌劑。所述步驟（1）中，分離篩選培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料制成：CaCO31.2g，MgSO4·7H2O1.0g，K2HPO41.5g，NaCl0.2g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.003g，NaMO4·2H2O0.08g，蔗糖8g，瓊脂19g，蒸餾水1000ml，pH7.2。本實(shí)施例的其余內(nèi)容與實(shí)施例1或2相同，這里不再贅述。實(shí)施例5本實(shí)施例與實(shí)施例4的不同之處在于：本實(shí)施例的所述巨大芽孢桿菌B16的固氮酶活性為750.248nmol/(mL·h)，其在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生吲哚乙酸的分泌量為501.255mg/L。本實(shí)施例的巨大芽孢桿菌B16粉狀菌劑，其活菌數(shù)為1億/g。本實(shí)施例的其余內(nèi)容與實(shí)施例4相同，這里不再贅述。實(shí)施例6本實(shí)施例與實(shí)施例1或2的不同之處在于，本實(shí)施例的一種巨大芽孢桿菌B16的菌劑制備方法，包括以下步驟：（1）分離、篩選選取含有巨大芽孢桿菌B16的固氮菌菌落的土樣，經(jīng)分離篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)得到固氮菌菌落；（2）純化、保存在純化保存培養(yǎng)基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進(jìn)行純化，培養(yǎng)分離得到巨大芽孢桿菌B16單菌落，保存該單菌落備用；（3）培養(yǎng)基培養(yǎng)利用培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)單菌落，得到微生物菌液；（4）B16發(fā)酵液制備將微生物菌液接種于滅菌的種子培養(yǎng)基中，設(shè)置搖床培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，即得到發(fā)酵種子液，將種子液在無(wú)菌條件下接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)；（5.2）B16固體菌劑原粉制備發(fā)酵罐中培養(yǎng)的產(chǎn)物采用離心機(jī)，離心，獲得B16純菌體，用碳酸鈣進(jìn)行吸附B16純菌體，置于烘箱干燥，粉碎機(jī)打粉即為B16固體菌劑原粉，測(cè)定活菌數(shù)為186.93億/g，備用；（6.2）巨大芽孢桿菌B16顆粒菌劑制劑化將菌體原粉、安琪酵母有機(jī)質(zhì)、硫酸銨、硫酸鉀與磷酸一銨、膨潤(rùn)土的混合質(zhì)量比為2：70：2：2：2：8，在室溫環(huán)境下放置，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《復(fù)合微生物肥料》（NY/T798-2004）規(guī)定的方法測(cè)定活菌數(shù)為1.53億/g，得到巨大芽孢桿菌B16顆粒菌劑。所述步驟（1）中，分離篩選培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料制成：CaCO31.4g，MgSO4·7H2O1.2g，K2HPO42.0g，NaCl0.4g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.005g，NaMO4·2H2O0.1g，蔗糖10g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，pH7.4。本實(shí)施例的其余內(nèi)容與實(shí)施例1或2相同，這里不再贅述。實(shí)施例7本實(shí)施例與實(shí)施例6的不同之處在于：本實(shí)施例的所述巨大芽孢桿菌B16的固氮酶活性為880.165nmol/(mL·h)，其在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生吲哚乙酸的分泌量為600mg/L。本實(shí)施例的巨大芽孢桿菌B16顆粒菌劑，其活菌數(shù)為0.86億/g。本實(shí)施例的其余內(nèi)容與實(shí)施例6相同，這里不再贅述。本發(fā)明的巨大芽孢桿菌B16的16SrDNA基因序列菌種鑒定細(xì)菌的個(gè)體微小，形態(tài)簡(jiǎn)單，傳統(tǒng)方法鑒定細(xì)菌常根據(jù)它們?cè)谏砩系牟煌磻?yīng)作為分類(lèi)鑒定的主要依據(jù)。20世紀(jì)70年代后期以來(lái)，國(guó)際上通用的“正式的”或“官方的”細(xì)菌分類(lèi)方法是以《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》為依據(jù)。在生理生化鑒定中，通常會(huì)出現(xiàn)一個(gè)或者幾個(gè)生理指標(biāo)不符合該菌種所具有的獨(dú)特性質(zhì)，難以明確對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定。目前，細(xì)菌鑒定的方法通常將菌株的生理生化指標(biāo)與分子生物學(xué)特性相結(jié)合，得出較為可靠地結(jié)論。其中DNA序列分析的16SrRNA基因進(jìn)化發(fā)育系統(tǒng)已經(jīng)成為目前國(guó)際上細(xì)菌多相分類(lèi)鑒定常用的技術(shù)手段(Kimetal，2004；Prapetal，1997)。核糖體16SrDNA基因序列全長(zhǎng)約1550bp，是由交替的保守區(qū)和可變區(qū)組成。利用保守區(qū)域設(shè)計(jì)的通用引物，可以擴(kuò)增出所有細(xì)菌的16SrDNA片段。16SrDNA序列分析技術(shù)的基本原理是從微生物樣本中提取16SrDNA片段，通過(guò)克隆、測(cè)序或酶切、探針雜交獲得16SrDNA的序列信息，再與16SrDNA數(shù)據(jù)庫(kù)的序列數(shù)據(jù)或者其他數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，確定其在進(jìn)化樹(shù)中的位置，從而鑒定樣本中可能存在的微生物種類(lèi)。利用16SrDNA片段保守區(qū)域設(shè)計(jì)的通用引物，不會(huì)對(duì)非細(xì)菌的DNA互補(bǔ)，而細(xì)菌的16SrDNA可變區(qū)的差異可以用來(lái)區(qū)分不同的菌。因此通過(guò)對(duì)某菌株16SrDNA序列測(cè)定來(lái)獲得最終鑒定證明的做法是被普遍認(rèn)可的。1、方法：（1）PCR反應(yīng)體系(25μL)：10×PCRBuffer2.5μLdNTP(2.5mM)m2.0μL引物27F（10μM）0.5μL引物1492R（10μM）0.5μLDNA模板100ngTaq酶(5U/μL)0.5μLddH2O19μL（2）PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸80s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。使用ABI3730xlDNA分析儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行DNA測(cè)序。2、測(cè)序結(jié)果catgcagtcgagcgaactgattagaagcttgcttctatgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaagactgggataacttcgggaaaccgaagctaataccggataggatcttctccttcatgggagatgattgaaagatggtttcggctatcacttacagatgggcccgcggtgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtacaagagtaactgcttgtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagagaaaagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttttggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaactctagagatagagcgttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagggctgcaagaccgcgaggtcaagccaatcccataaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggagtaaccgtaaggagcta3、同源性分析鑒定本細(xì)菌為Bacillusmegaterium，巨大芽孢桿菌。本發(fā)明由廣東省引進(jìn)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目資助研發(fā)，制得的巨大芽孢桿菌B16及其菌劑具有廣闊的市場(chǎng)前景，經(jīng)濟(jì)效益高。最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)地說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。<0001>SEQUENCELISTING<110>東莞市保得生物工程有限公司<120>一種巨大芽孢桿菌B16及其菌劑和菌劑制備方法<130>0<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1416<212>DNA<213>巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)B16的16srDNA基因序列<400>1catgcagtcgagcgaactgattagaagcttgcttctatgacgttagcggcggacgggtga60gtaacacgtgggcaacctgcctgtaagactgggataacttcgggaaaccgaagctaatac120cggataggatcttctccttcatgggagatgattgaaagatggtttcggctatcacttaca180gatgggcccgcggtgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgca240tagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacg300ggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtg360agtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtacaagagta420actgcttgtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagcc480gcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggc540ggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgg600ggaacttgagtgcagaagagaaaagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagaga660tgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttttggtctgtaactgacgctgaggcgcga720aagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgc780taagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctg840gggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtgg900agcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgac960aactctagagatagagcgttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtc1020gtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatctta1080gttgccagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtg1140gggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggat1200ggtacaaagggctgcaagaccgcgaggtcaagccaatcccataaaaccattctcagttcg1260gattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcat1320gccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgt1380aacacccgaagtcggtggagtaaccgtaaggagcta1416當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3