技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域大體上涉及結(jié)合包括RSPO1、RSPO2和RSPO3在內(nèi)的R-反應(yīng)蛋白(RSPO)(特別是人R-反應(yīng)蛋白)的抗體和其他試劑，以及使用所述抗體或其他試劑來(lái)治療諸如癌等疾病的方法。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)的R-反應(yīng)蛋白(RSPO)家族在脊椎動(dòng)物中是保守的，并且包括四個(gè)成員，RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4。這些蛋白被以各種名稱相稱，包括頂板特異性反應(yīng)蛋白、hPWTSR(hRSPO3)、THS2D(RSPO3)、Cristin1-4和Futrin1-4。RSPO是小的分泌蛋白，其共享約40％至60％的序列同源性和結(jié)構(gòu)域組織。所有的RSPO蛋白在N-末端含有兩個(gè)弗林蛋白酶(furin)樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，其連著血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域以及堿性帶電C末端尾部(Kim等，2006,CellCycle,5:23-26)。研究已經(jīng)顯示，RSPO蛋白在脊椎動(dòng)物發(fā)育(Kamata等,2004,Biochim.BiophysActa,1676:51-62)期間和在非洲爪蟾肌發(fā)生(Kazanskaya等,2004,Dev.Cell,7:525-534)中起作用。RSPO1還據(jù)顯示充當(dāng)胃腸上皮細(xì)胞用的強(qiáng)效絲裂原(Kim等,2005,Science,309:1256-1259)。已知RSPO蛋白激活與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)相似的β連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)，但是仍正在研究RSPO蛋白和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)之間的關(guān)系。已經(jīng)報(bào)道RSPO蛋白對(duì)Wnt配體擁有正向調(diào)節(jié)活性(Nam等,2006,JBC281:13247-57)。該研究報(bào)道了RSPO蛋白能夠充當(dāng)Frizzled8和LRP6受體配體，并誘導(dǎo)β連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)(Nam等,2006,JBC281:13247-57)。近期研究已經(jīng)鑒定了RSPO蛋白和諸如LGR5等LGR(富含亮氨酸重復(fù)的G蛋白偶聯(lián)受體)蛋白之間的相互作用(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第2009/0074782和2009/0191205號(hào))，這些數(shù)據(jù)提出了β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的激活的替代途徑。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑已被鑒定為癌治療的潛在靶標(biāo)。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑是胚胎模式形成、胚胎后組織維持和干細(xì)胞生物學(xué)的數(shù)種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素之一。更具體而言，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)在細(xì)胞極性的產(chǎn)生和細(xì)胞命運(yùn)特化(包括干細(xì)胞群的自我更新)中起重要作用。不受調(diào)節(jié)的Wnt途徑的激活與許多人類(lèi)癌癥有關(guān)，據(jù)信在所述癌癥中這樣的激活能夠改變細(xì)胞的發(fā)育命運(yùn)。Wnt途徑的激活可以將腫瘤細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)和/或?qū)е虏皇芸氐脑鲋?。因此癌變可以通過(guò)壓制控制正常發(fā)育和組織修復(fù)的體內(nèi)平衡機(jī)制進(jìn)行(在Reya&Clevers,2005,Nature,434:843-50；Beachy等,2004,Nature,432:324-31中綜述)。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑首次在果蠅發(fā)育突變無(wú)翼體(wg)中闡明，并且來(lái)自鼠類(lèi)原癌基因int-1(現(xiàn)在的Wnt1)(Nusse&Varmus,1982,Cell,31:99-109；VanOoyen&Nusse,1984,Cell,39:233-40；Cabrera等,1987,Cell,50:659-63；Rijsewijk等,1987,Cell,50:649-57)。Wnt基因編碼分泌的脂修飾的糖蛋白，所述糖蛋白在哺乳動(dòng)物中已被鑒定出其中的19個(gè)。這些分泌的配體激活由Frizzled(FZD)受體家族成員和低密度脂蛋白(LDL)受體相關(guān)蛋白5或6(LRP5/6)組成的受體復(fù)合物。FZD受體是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白，并且含有具有10個(gè)保守性半胱氨酸的大的細(xì)胞外N末端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域被稱為富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(CRD)或Fri結(jié)構(gòu)域。存在10種人FZD受體，F(xiàn)ZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9和FZD10。不同的FZDCRD對(duì)特定的Wnt蛋白具有不同的結(jié)合親和性(Wu&Nusse,2002,J.Biol.Chem.,277:41762-9)，因此將FZD受體分類(lèi)為激活典型β連環(huán)素途徑的受體和激活非典型途徑的受體(Miller等,1999,Oncogene,18:7860-72)。在經(jīng)附近注射鼠類(lèi)病毒而轉(zhuǎn)化的乳腺瘤中將Wnt1(最初稱為int1)鑒定為致癌基因后，首次揭示了Wnt信號(hào)傳導(dǎo)在癌中的作用(Nusse&Varmus,1982,Cell,31:99-109)。近期還已經(jīng)積累了Wnt信號(hào)傳導(dǎo)在乳腺癌中的作用的額外證據(jù)。例如，乳腺中β-連環(huán)素的轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致增生和腺癌(Imbert等,2001,J.CellBiol.,153:555-68；Michaelson&Leder,2001,Oncogene,20:5093-9)，而Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的喪失干擾正常的乳腺發(fā)育(Tepera等,2003,J.CellSci.,116:1137-49；Hatsell等,2003,J.MammaryGlandBiol.Neoplasia,8:145-58)。在人乳腺癌中，β-連環(huán)素累積在超過(guò)50％的癌中涉及激活的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，雖然尚未鑒定出具體的突變，但是觀察到Frizzled受體表達(dá)的上調(diào)(Brennan&Brown,2004,J.MammaryGlandBiol.Neoplasia,9:119-31；Malovanovic等,2004,Int.J.Oncol.,25:1337-42)。Wnt途徑的激活還與結(jié)直腸癌相關(guān)。所有結(jié)直腸癌中的約5％至10％遺傳有作為家族性腺瘤性息肉病(FAP)的主要形式之一，該疾病是一種常染色體顯性疾病，其中約80％的受影響個(gè)體含有腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)基因中的種系突變。還在包括Axin和β-連環(huán)素在內(nèi)的其他Wnt途徑組分中鑒定出突變。個(gè)體的腺瘤是含有第二失活等位基因的上皮細(xì)胞的克隆外生長(zhǎng)物，大量的FAP腺瘤必然通過(guò)致癌基因和/或腫瘤抑制基因的另外突變導(dǎo)致腺癌的發(fā)展。此外，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活，包括APC中的功能喪失突變和β-連環(huán)素中的穩(wěn)定化突變，能夠誘導(dǎo)小鼠模型中的增生性發(fā)育和腫瘤生長(zhǎng)(Oshima等,1997,CancerRes.,57:1644-9；Harada等,1999,EMBOJ.,18:5931-42)。與乳腺癌和結(jié)腸癌相似，黑素瘤經(jīng)常具有Wnt途徑的組成性激活，這可以通過(guò)β-連環(huán)素的細(xì)胞核累積表明。將Wnt/β-連環(huán)素途徑在一些黑素瘤和細(xì)胞系中的激活歸因于諸如APC、ICAT、LEF1和β-連環(huán)素等途徑組分的修飾(例如參見(jiàn)Larue等，2006,FrontiersBiosci.,11:733-742)。但是，關(guān)于Wnt/β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)在黑素瘤中的確切作用在文獻(xiàn)中存在矛盾的報(bào)道。例如，一個(gè)研究從黑素瘤發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核β-連環(huán)素的水平升高與存活率提高相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)激活的Wnt/β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)與細(xì)胞增殖減少相關(guān)(Chien等,2009,PNAS,106:1193-1198)。癌藥物研究的焦點(diǎn)正在轉(zhuǎn)向以參與人癌的基因、蛋白質(zhì)和途徑為目標(biāo)的靶向治療。對(duì)于靶向信號(hào)傳導(dǎo)途徑的新型試劑和靶向能夠?yàn)榘┗颊咛峁┲委熞嫣幍亩喾N途徑的新型試劑組合存在需要。因此，干擾β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的生物分子(例如抗-RSPO抗體)是癌以及其他β-連環(huán)素相關(guān)疾病的新型治療劑的潛在來(lái)源。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供諸如抗體等結(jié)合RSPO蛋白的結(jié)合劑，以及包含所述結(jié)合劑的組合物，例如藥物組合物。在一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑是諸如抗體、抗體片段等新型多肽以及涉及此類(lèi)抗體的其他多肽。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑是特異性結(jié)合人RSPO1、RSPO2和/或RSPO3的抗體。本發(fā)明還提供通過(guò)對(duì)具有腫瘤的受試對(duì)象施用所述RSPO-結(jié)合劑而抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法。本發(fā)明還提供通過(guò)對(duì)有需要的受試對(duì)象施用所述RSPO-結(jié)合劑而治療癌的方法。在一些實(shí)施方式中，治療癌或抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法包括用所述RSPO-結(jié)合劑靶向癌干細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括減少腫瘤中癌干細(xì)胞的頻率、減少腫瘤中癌干細(xì)胞的數(shù)量、減少腫瘤的致瘤性(tumorigenicity)和/或通過(guò)減少腫瘤中癌干細(xì)胞的數(shù)量或頻率來(lái)減少腫瘤的致瘤性。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供諸如抗體等特異性結(jié)合人RSPO1的結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑在人RSPO1的21～263位氨基酸內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑在人RSPO1的34～135位氨基酸內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑在人RSPO1的91～135位氨基酸內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑(例如抗體)特異性結(jié)合選自由RSPO2、RSPO3和RSPO4組成的組中的至少一種其他人RSPO。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑或抗體調(diào)節(jié)β-連環(huán)素活性，是β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑，抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)和/或抑制β-連環(huán)素的激活。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑抑制RSPO1信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑抑制或干擾RSPO1與一種或多種LGR蛋白(例如LGR4、LGR5和/或LGR6)的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑抑制RSPO1與LGR5的結(jié)合。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供諸如抗體等特異性結(jié)合人RSPO2的結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑在人RSPO2的22～243位氨基酸內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑在人RSPO2的22～205位氨基酸內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑在人RSPO2的34～134位氨基酸內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑在人RSPO2的90～134位氨基酸內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑(例如抗體)特異性結(jié)合選自由RSPO1、RSPO3和RSPO4組成的組中的至少一種其他人RSPO。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑或抗體調(diào)節(jié)β-連環(huán)素活性，是β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑，抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)和/或抑制β-連環(huán)素的激活。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑抑制RSPO2信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑抑制或干擾RSPO2與一種或多種LGR蛋白(例如LGR4、LGR5和/或LGR6)的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑抑制RSPO2與LGR5的結(jié)合。在各個(gè)上述方面和實(shí)施方式中的一些實(shí)施方式以及本文所述的其他方面和實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是人源化抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合人RSPO1。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合人RSPO1和小鼠RSPO1。在一些實(shí)施方式中，所述抗體以小于1nM的KD結(jié)合人RSPO1和以小于1nM的KD結(jié)合小鼠RSPO1。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體，所述抗體含有包含TGYTMH(SEQIDNO:12)的重鏈CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQIDNO:13)的重鏈CDR2和包含KEFSDGYYFFAY(SEQIDNO:14)的重鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述抗體還含有包含KASQDVIFAVA(SEQIDNO:15)的輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQIDNO:16)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTPW(SEQIDNO:17)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體，所述抗體含有包含KASQDVIFAVA(SEQIDNO:15)的輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQIDNO:16)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTPW(SEQIDNO:17)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體，所述抗體含有：(a)包含TGYTMH(SEQIDNO:12)的重鏈CDR1，或者包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的其變體；(b)包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQIDNO:13)的重鏈CDR2，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體；(c)包含KEFSDGYYFFAY(SEQIDNO:14)的重鏈CDR3，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體；(d)包含KASQDVIFAVA(SEQIDNO:15)的輕鏈CDR1，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體；(e)包含WASTRHT(SEQIDNO:16)的輕鏈CDR2，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體；和(f)包含QQHYSTPW(SEQIDNO:17)的輕鏈CDR3，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體。在一些實(shí)施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含：(a)與SEQIDNO:10具有至少80％序列同一性的重鏈可變區(qū)和/或(b)與SEQIDNO:11具有至少80％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含：(a)與SEQIDNO:10具有至少90％序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQIDNO:11具有至少90％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含：(a)與SEQIDNO:55具有至少80％序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQIDNO:59具有至少80％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含：(a)與SEQIDNO:55具有至少90％序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQIDNO:59具有至少90％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是單克隆抗體89M5，由在2011年6月30日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(美國(guó)弗吉尼亞州馬納薩斯市大學(xué)路，10801)的ATCC保藏號(hào)為PTA-11970的鼠類(lèi)雜交瘤細(xì)胞系89M5產(chǎn)生。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體89M5的人源化形式。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是人源化單克隆抗體h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是結(jié)合人RSPO2的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合人RSPO2和小鼠RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述抗體含有包含SSYAMS(SEQIDNO:29)的重鏈CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQIDNO:30)的重鏈CDR2和包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQIDNO:31)的重鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述抗體還含有包含KASQDVSSAVA(SEQIDNO:32)的輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQIDNO:33)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTP(SEQIDNO:34)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體，所述抗體含有包含KASQDVSSAVA(SEQIDNO:32)的輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQIDNO:33)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTP(SEQIDNO:34)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體，所述抗體含有：(a)包含SSYAMS(SEQIDNO:29)的重鏈CDR1，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體；(b)包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQIDNO:30)的重鏈CDR2，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體；(c)包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQIDNO:31)的重鏈CDR3，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體；(d)包含KASQDVSSAVA(SEQIDNO:32)的輕鏈CDR1，或者包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的其變體；(e)包含WASTRHT(SEQIDNO:33)的輕鏈CDR2，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體；和(f)包含QQHYSTP(SEQIDNO:34)的輕鏈CDR3，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體。在一些實(shí)施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含：(a)與SEQIDNO:27具有至少80％序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQIDNO:28具有至少80％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含：(a)與SEQIDNO:27具有至少90％序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQIDNO:28具有至少90％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含：(a)與SEQIDNO:63具有至少80％序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQIDNO:67具有至少80％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含：(a)與SEQIDNO:63具有至少90％序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQIDNO:67具有至少90％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含：(a)與SEQIDNO:63具有至少80％序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQIDNO:76具有至少80％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含：(a)與SEQIDNO:63具有至少90％序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQIDNO:76具有至少90％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是單克隆抗體130M23，由在2011年8月10日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(美國(guó)弗吉尼亞州馬納薩斯市大學(xué)路，10801)的ATCC保藏號(hào)為PTA-12021的鼠類(lèi)雜交瘤細(xì)胞系130M23產(chǎn)生。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體130M23的人源化形式。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是人源化單克隆抗體h130M23-H1L2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是人源化單克隆抗體h130M23-H1L6。在另一方面，本發(fā)明提供與本發(fā)明的抗體競(jìng)爭(zhēng)與人RSPO蛋白的特異性結(jié)合的結(jié)合劑(例如抗體)。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑(例如抗體)與含有包含SEQIDNO:10的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:11的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)與人RSPO1的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑(例如抗體)與含有包含SEQIDNO:55的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:59的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)與人RSPO1的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，與所述RSPO1-結(jié)合劑競(jìng)爭(zhēng)的抗體是89M5或h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑在體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢驗(yàn)中與本發(fā)明的抗體競(jìng)爭(zhēng)與RSPO1的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述抗體與本發(fā)明的抗體(例如89M5)所結(jié)合的RSPO1上的表位相同或基本上相同。在又一方面，所述結(jié)合劑是抗體，所述抗體結(jié)合的RSPO1上的表位與本發(fā)明的抗體(例如89M5)結(jié)合的RSPO1上的表位重疊。在另一方面，本發(fā)明提供與本發(fā)明的抗體競(jìng)爭(zhēng)與人RSPO2的特異性結(jié)合的結(jié)合劑(例如抗體)。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑(例如抗體)與含有包含SEQIDNO:27的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:28的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)與人RSPO2的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑(例如抗體)與含有包含SEQIDNO:63的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:67的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)與人RSPO2的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑(例如抗體)與含有包含SEQIDNO:63的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:76的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)與人RSPO2的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，與所述RSPO2-結(jié)合劑競(jìng)爭(zhēng)的抗體是130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑在體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢驗(yàn)中與本發(fā)明的抗體競(jìng)爭(zhēng)與RSPO2的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述抗體與本發(fā)明的抗體(例如89M5)所結(jié)合的RSPO2上的表位相同或基本上相同。在又一方面，所述結(jié)合劑是抗體，所述抗體結(jié)合的RSPO2上的表位與本發(fā)明的抗體(例如130M23)結(jié)合的RSPO2上的表位重疊。在各個(gè)上述方面以及本文別處描述的其他方面和/或和實(shí)施方式中的一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑或抗體是分離的。在另一方面，本發(fā)明提供包含SEQIDNO:10和/或SEQIDNO:11的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供包含SEQIDNO:55和/或SEQIDNO:59的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供包含SEQIDNO:27和/或SEQIDNO:28的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供包含SEQIDNO:63和/或SEQIDNO:67的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供包含SEQIDNO:63和/或SEQIDNO:76的多肽。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合RSPO1的多肽含有包含SEQIDNO:25和/或SEQIDNO:26的多肽。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合RSPO1的多肽含有包含SEQIDNO:68和/或SEQIDNO:69的多肽。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合RSPO2的多肽含有包含SEQIDNO:41和/或SEQIDNO:42的多肽。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合RSPO2的多肽含有包含SEQIDNO:70和/或SEQIDNO:71的多肽。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合RSPO2的多肽含有包含SEQIDNO:70和/或SEQIDNO:74的多肽。在一些實(shí)施方式中，所述多肽是分離的。在一些實(shí)施方式中，所述多肽基本上是純的。在一些實(shí)施方式中，所述多肽是抗體。在另一方面，本發(fā)明提供分離的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含編碼各個(gè)上述方面以及本文描述的其他方面和/或?qū)嵤┓绞降目贵w和/或多肽。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含選自由SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56和SEQIDNO:58組成的組中的序列。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含選自由SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:72和SEQIDNO:75組成的組中的序列。本發(fā)明還提供包含所述多核苷酸的表達(dá)載體以及包含所述表達(dá)載體和/或多核苷酸的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是雜交瘤細(xì)胞系。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是ATCC保藏號(hào)為PTA-11970的雜交瘤細(xì)胞系。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是ATCC保藏號(hào)為PTA-12021的雜交瘤細(xì)胞系。在其他方面，本發(fā)明提供抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，所述方法包括使所述腫瘤與有效量的RSPO-結(jié)合劑或抗體(包括本文描述的每種RSPO-結(jié)合劑或抗體)接觸。在另一方面，本發(fā)明提供抑制受試對(duì)象中腫瘤生長(zhǎng)的方法，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑或抗體(包括本文描述的每種RSPO-結(jié)合劑或抗體)。在另一方面，本發(fā)明提供抑制細(xì)胞中β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的方法，所述方法包括使所述腫瘤與有效量的RSPO-結(jié)合劑或抗體(包括本文描述的每種RSPO-結(jié)合劑或抗體)接觸。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是結(jié)直腸瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是卵巢瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是胰腺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是肺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤表達(dá)的RSPO蛋白中的至少一種的水平升高。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤表達(dá)的RSPO1水平升高。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤表達(dá)的RSPO2水平升高。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤表達(dá)的RSPO3水平升高。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑例如通過(guò)減少腫瘤中癌干細(xì)胞的數(shù)量和/或頻率而抑制腫瘤生長(zhǎng)。在另一方面，本發(fā)明提供治療受試對(duì)象中的癌的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括對(duì)受試對(duì)象施用治療有效量的上述RSPO-結(jié)合劑或抗體以及本文別處描述的RSPO-結(jié)合劑或抗體中的任一種。在一些實(shí)施方式中，所述癌是胰腺癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是結(jié)直腸癌。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)直腸癌包含在腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)基因中的失活突變。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)直腸癌不包含所述APC基因中的失活突變。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)直腸癌包含野生型APC基因。在一些實(shí)施方式中，所述癌是卵巢癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是乳腺癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是肺癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌表達(dá)的至少一種RSPO蛋白的水平升高。在一些實(shí)施方式中，所述癌是表達(dá)升高水平的RSPO1的卵巢癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是表達(dá)升高水平的RSPO2的結(jié)腸癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是表達(dá)升高水平的RSPO2的胰腺癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是表達(dá)升高水平的RSPO2的乳腺癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是表達(dá)升高水平的RSPO2的肺癌。在另一方面，本發(fā)明提供治療受試對(duì)象中疾病的方法，其中所述疾病與β-連環(huán)素的激活和/或異常的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)，所述方法包括施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑或抗體(包括本文所述的每種RSPO-結(jié)合劑或抗體)。在各個(gè)上述方面以及本文別處描述的其他方面和/或?qū)嵤┓绞街械囊恍?shí)施方式中，所述治療方法包括將RSPO-結(jié)合劑與至少一種另外的治療劑組合施用。在一些實(shí)施方式中，所述治療方法包括將RSPO1-結(jié)合劑與諸如RSPO2-結(jié)合劑、RSPO3-結(jié)合劑和/或RSPO4-結(jié)合劑等第二RSPO-結(jié)合劑組合施用。在一些實(shí)施方式中，所述治療方法包括將RSPO2-結(jié)合劑與諸如RSPO1-結(jié)合劑、RSPO3-結(jié)合劑和/或RSPO4-結(jié)合劑等第二RSPO-結(jié)合劑組合施用。在一些實(shí)施方式中，所述治療方法包括將RSPO1-結(jié)合劑與RSPO2-結(jié)合劑組合施用。在一些實(shí)施方式中，所述治療方法包括施用RSPO1-結(jié)合劑、RSPO2-結(jié)合劑和化學(xué)治療劑的組合。在各個(gè)上述方面以及本文別處描述的其他方面和/或?qū)嵤┓绞街械囊恍?shí)施方式中，所述治療方法還包括確定所述腫瘤或癌中至少一種RSPO蛋白的水平的步驟。在另一方面，本發(fā)明提供鑒定人受試對(duì)象或選擇人受試對(duì)象以用RSPO-結(jié)合劑或抗體(包括但不限于本文描述的每種RSPO-結(jié)合劑或抗體)進(jìn)行治療的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括確定所述受試對(duì)象是否具有腫瘤，所述腫瘤具有的特定RSPO(例如RSPO1或RSPO2)的表達(dá)水平與正常組織中相同的RSPO蛋白的表達(dá)相比升高。在一些實(shí)施方式中，如果所述腫瘤具有升高的RSPO表達(dá)水平，則所述方法包括鑒定治療用受試對(duì)象或選擇治療用受試對(duì)象。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括確定所述受試對(duì)象是否具有包含APC基因中的失活突變的腫瘤。在一些實(shí)施方式中，如果所述腫瘤具有APC基因中的失活突變，則所述方法包括鑒定治療的受試對(duì)象或選擇治療的受試對(duì)象。還提供了包含本文所述的RSPO-結(jié)合劑或抗體以及藥學(xué)上可接受的載劑的藥物組合物，以及產(chǎn)生所述RSPO-結(jié)合劑的細(xì)胞系。還提供了治療受試對(duì)象(例如人)中的癌和/或抑制受試對(duì)象(例如人)中的腫瘤生長(zhǎng)的方法，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用有效量的包含所述RSPO-結(jié)合劑的組合物。如果本發(fā)明的方面或?qū)嵤┓绞礁鶕?jù)馬庫(kù)什分組或其他替代分組進(jìn)行描述，則本發(fā)明不僅涵蓋了作為整體列出的整個(gè)組，還單獨(dú)涵蓋了所述組的每個(gè)成員以及主要組的所有可能的亞組，還涵蓋了缺少一個(gè)或多個(gè)組成員的主要組。本發(fā)明還設(shè)想明確排除了在所要求保護(hù)的發(fā)明中的任意一個(gè)或多個(gè)組成員。附圖說(shuō)明圖1.腫瘤和正常組織中的RSPO表達(dá)。顯示了來(lái)自正常組織人樣品、良性組織人樣品和惡性組織人樣品的微陣列數(shù)據(jù)的總結(jié)。各個(gè)刻度標(biāo)記(tickmark)表示RSPOmRNA的表達(dá)水平。A)RSPO1B)RSPO2C)RSPO3圖2.RSPO蛋白和LGR5的結(jié)合研究。表達(dá)LGR5的HEK-293細(xì)胞的FACS分析。將HEK-293細(xì)胞用編碼FLAG-LGR5-CD4TM-GFP的cDNA表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，然后與可溶性RSPO1-Fc、RSPO2-Fc、RSPO3-Fc或RSPO4-Fc融合蛋白混合。使用抗FLAG抗體作為陽(yáng)性對(duì)照，使用可溶性FZD8-Fc作為陰性對(duì)照。通過(guò)在各個(gè)FACS圖上的黑線框重疊區(qū)(darklinedboxoverlay)內(nèi)信號(hào)的存在表示特異性結(jié)合。圖3.肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基中抑制活性的鑒定。使用6xTCF-熒光素酶報(bào)告基因檢驗(yàn)來(lái)測(cè)定HEK-293細(xì)胞中的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。在可溶性LGR5-Fc的存在下使HEK-293細(xì)胞暴露至含有Wnt3aL細(xì)胞條件培養(yǎng)基的對(duì)照培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)或含有肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基和Wnt3aL細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基。使用可溶性Jag-Fc和抗體LZ1作為陰性對(duì)照。使用可溶性FZD8-Fc和阻斷Wnt3a的抗-FZD抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。以10μg/ml使用可溶性LGR5-Fc、Jag-Fc和FZD8-Fc融合蛋白。以40μg/ml使用抗-FZD抗體和LZ1抗體。圖4.β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的誘導(dǎo)的抑制。使用6xTCF-熒光素酶報(bào)告基因檢驗(yàn)來(lái)測(cè)定HEK-293細(xì)胞中的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。在可溶性LGR5-Fc在20μg/ml～0.02μg/ml的四倍稀釋液存在下，使HEK-293細(xì)胞暴露至含有10ng/mlRSPO2和25％Wnt3aL細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基(“RSPO2”)或含有25％肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基和25％Wnt3aL細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基(“LT”)；具有LGR5-Fc的RSPO2(-□-)和具有LGR5-Fc(-■-)的LT。具有RSPO2(-Δ-)或LT(-▲-)的20μg/ml的可溶性Jag-Fc用作陰性對(duì)照。具有RSPO2(-○-)或LT(-●-)的20μg/ml的阻斷Wnt3a的可溶性FZD8-Fc用作陽(yáng)性對(duì)照。圖5.結(jié)合RSPO1的抗體的鑒定。A)融合蛋白FLAG-RSPO1弗林蛋白酶-CD4TM-GFP的圖示。B)所產(chǎn)生的針對(duì)人RSPO1的抗體的FACS分析。y軸顯示相對(duì)抗體結(jié)合，x軸表示FLAG-RSPO1弗林蛋白酶-CD4TM-GFP融合蛋白的表達(dá)。通過(guò)在各個(gè)FACS圖上的黑線框重疊區(qū)內(nèi)信號(hào)的存在表示陽(yáng)性結(jié)合。使用抗-FLAG抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。使用抗-PE抗體作為陰性對(duì)照。圖6.抑制由RSPO1誘導(dǎo)的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的抗-RSPO1抗體的鑒定。在濃度漸增的抗-RSPO1抗體(89M2、89M4、89M5、89M7、89M19或89M25)或無(wú)關(guān)對(duì)照抗體(254M14或254M26)的存在下，在將HEK-293細(xì)胞暴露至Wnt3a(5ng/ml)和RSPO1(10ng/ml)的組合后，使用TOPflash熒光素酶報(bào)告基因檢驗(yàn)來(lái)測(cè)定所述HEK-293細(xì)胞中的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)?？贵w以10μg/ml～0.625μg/ml范圍內(nèi)的2倍稀釋液使用。對(duì)照包括在不存在抗體時(shí)暴露至對(duì)照培養(yǎng)基(無(wú)Wnt3a和無(wú)RSPO)、單獨(dú)Wnt3a或者Wnt3a和RSPO的組合。圖7.阻斷RSPO1/LGR5結(jié)合的抗-RSPO1抗體的鑒定。表達(dá)LGR5的HEK-293細(xì)胞的FACS分析。將HEK-293細(xì)胞用編碼FLAG-LGR5-CD4TM-GFP的cDNA表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，然后與組合有各種抗-RSPO1抗體的可溶性RSPO1-Fc融合蛋白混合。用綴合有PE的抗人Fc二抗檢測(cè)結(jié)合。y軸顯示相對(duì)RSPO1-Fc結(jié)合，x軸表示FLAG-LGR5-CD4TM-GFP融合蛋白的表達(dá)。通過(guò)在各個(gè)FACS圖上的黑線框重疊區(qū)內(nèi)信號(hào)的存在表示陽(yáng)性結(jié)合。使用抗-PE抗體作為陰性對(duì)照。圖8.用抗-RSPO1抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)。將OV19卵巢瘤細(xì)胞皮下注入NOD/SCID小鼠中。用89M5(-●-)、89M25(-▼-)、紫杉醇(-◆-)、抗體89M5和紫杉醇的組合(-○-)、抗體89M25和紫杉醇的組合(-□-)或者對(duì)照抗體1B7.11(-■-)治療小鼠。數(shù)據(jù)顯示為治療后天數(shù)與腫瘤體積(mm3)。圖9.抗-RSPO1抗體的表位作圖。A)含有RSPO1結(jié)構(gòu)域的缺失系列的所構(gòu)建的融合蛋白的圖。這些構(gòu)建體都包含允許所述蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)的CD4TM結(jié)構(gòu)域。B)抗-RSPO1抗體與用所述融合蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的結(jié)合的FACS分析。y軸顯示相對(duì)抗體結(jié)合，x軸表示所述融合蛋白的表達(dá)。使用抗-FLAG抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。使用抗-PE抗體作為陰性對(duì)照。圖10.結(jié)合RSPO2的抗體的鑒定。所產(chǎn)生的針對(duì)人RSPO2的抗體的FACS分析。y軸顯示相對(duì)抗體結(jié)合，x軸表示FLAG-RSPO2弗林蛋白酶-CD4TM-GFP融合蛋白的表達(dá)。使用抗-FLAG抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。使用抗-PE抗體作為陰性對(duì)照。圖11.抑制RSPO2誘導(dǎo)β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的抗-RSPO2抗體的鑒定。在針對(duì)RSPO2的抗體(mAbs130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28)的存在下，在將HEK-293細(xì)胞暴露至Wnt3a(5ng/ml)和人RSPO2(10ng/ml)的組合或Wnt3a(5ng/ml)和人RSPO3(10ng/ml)的組合后，使用TOPflash熒光素酶報(bào)告基因檢驗(yàn)來(lái)測(cè)定所述HEK-293細(xì)胞中的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。對(duì)照包括在不存在抗體時(shí)暴露至對(duì)照培養(yǎng)基(不添加Wnt3a和沒(méi)有RSPO標(biāo)記的“細(xì)胞”)、單獨(dú)Wnt3a(經(jīng)標(biāo)記的“W3A”)或者Wnt3a和RSPO的組合。圖12.阻斷RSPO2/LGR5結(jié)合的抗-RSPO2抗體的鑒定。表達(dá)LGR5的HEK-293細(xì)胞的FACS分析。將HEK-293細(xì)胞用編碼FLAG-LGR5-CD4TM-GFP的cDNA表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，然后與組合有各種抗-RSPO2抗體的可溶性RSPO2-Fc融合蛋白混合。用綴合有PE的抗人Fc二抗檢測(cè)結(jié)合。y軸顯示相對(duì)RSPO2-Fc結(jié)合，x軸表示FLAG-LGR5-CD4TM-GFP融合蛋白的表達(dá)。通過(guò)在各個(gè)FACS圖上的黑線框重疊區(qū)內(nèi)信號(hào)的存在表示陽(yáng)性結(jié)合。使用抗FLAG抗體作為陽(yáng)性對(duì)照，使用抗-PE抗體作為陰性對(duì)照。圖13.腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基中抑制活性的鑒定。在可溶性LGR5-Fc、FZD8-Fc或?qū)φ杖诤螰c蛋白的存在下，將STF-293細(xì)胞暴露至對(duì)照培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)、含有Wnt3aL細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基、含有腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基或含有腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基和Wnt3aL細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基。以10μg/ml使用可溶性LGR5-Fc、FZD8-Fc和對(duì)照-Fc融合蛋白。從肺瘤LU2(圖13A)、肺瘤LU25(圖13B)和卵巢瘤OV38(圖13C)制備腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基。圖14.β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的誘導(dǎo)的抑制。使STF-293與LU2細(xì)胞和25％的肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基以及25％Wnt3a-L細(xì)胞條件培養(yǎng)基一起溫育。將抗體130M23(-■-)和可溶性LGR5-Fc(-●-)以50μg/ml～0.0006μg/ml范圍內(nèi)的5倍連續(xù)稀釋液添加至所述細(xì)胞。使用經(jīng)過(guò)類(lèi)似稀釋的無(wú)關(guān)單克隆抗體(-□-)和對(duì)照Fc融合蛋白(-Δ-,50μg/ml)作為陰性對(duì)照。圖15.用抗-RSPO抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)。將PN31胰腺瘤細(xì)胞皮下注入NOD/SCID小鼠中。用抗-RSPO1抗體89M5(-□-)、抗-RSPO2抗體130M23(-▲-)、吉西他濱(-■-)、抗體89M5和吉西他濱的組合(-▼-)、抗體130M23和吉西他濱的組合(-◇-)或?qū)φ湛贵w1B7.11(-○-)治療小鼠。數(shù)據(jù)顯示為植入后天數(shù)與腫瘤體積(mm3)。圖16.用抗-RSPO抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)。將PN7胰腺瘤細(xì)胞皮下注入NOD/SCID小鼠中。用抗-RSPO2抗體130M23(-▼-)、抗-FZD抗體18R5(-▲-)、吉西他濱(-●-)、130M23和18R5的組合(-○-)、130M23和吉西他濱的組合(-□-)、18R5和吉西他濱的組合(-Δ-)、130M23、18R5和吉西他濱的組合(-◇-)或?qū)φ湛贵w1B7.11(-■-)治療小鼠。數(shù)據(jù)顯示為治療后天數(shù)與腫瘤體積(mm3)(圖16A)。用Wnt途徑抑制劑FZD8-Fc和吉西他濱的組合(-Δ-)、130M23和吉西他濱的組合(-▼-)、130M23、FZD8-Fc和吉西他濱的組合(-◇-)、吉西他濱(-●-)或?qū)φ湛贵w1B7.11(-■-)治療小鼠。數(shù)據(jù)顯示為治療后天數(shù)的腫瘤體積(mm3)(圖16B)。將所得到的腫瘤處理成單細(xì)胞懸浮液，并連續(xù)移植到小鼠中。將獲自每個(gè)治療組的90個(gè)腫瘤細(xì)胞皮下注入NOD/SCID小鼠中。在不進(jìn)行治療時(shí)使腫瘤生長(zhǎng)。數(shù)據(jù)顯示為第40天的腫瘤體積(mm3)(圖16C)。圖17.人源化RSPO抗體的FACS分析。A)人源化89M5抗體(h89M5-H2L2)和親本89M5抗體的FACS分析。測(cè)試每種抗體的5倍連續(xù)稀釋液。y軸顯示相對(duì)抗體結(jié)合，x軸表示FLAG-RSPO1弗林蛋白酶-CD4TM-GFP融合蛋白的表達(dá)。B)人源化130M23抗體(h130M23-H1L2)和親本130M23抗體的FACS分析。測(cè)試每種抗體的5倍連續(xù)稀釋液。y軸顯示相對(duì)抗體結(jié)合，x軸表示FLAG-RSPO2弗林蛋白酶-CD4TM-GFP融合蛋白的表達(dá)。圖18.用抗-RSPO1和抗-RSPO2抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)。將B39三重陰性(triplenegative)乳腺癌腫瘤細(xì)胞皮下注入NOD/SCID小鼠中。用抗-RSPO1抗體89M5和抗-RSPO2抗體130M23的組合(-○-)、順鉑(-▼-)、89M5、130M23和順鉑的組合(-●-)或?qū)φ湛贵w1B7.11(-■-)治療小鼠。數(shù)據(jù)顯示為治療后天數(shù)的腫瘤體積(mm3)。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供結(jié)合RSPO蛋白(例如人RSPO1、RSPO2和/或RSPO3)的新型試劑，包括但不限于多肽，例如抗體。所述RSPO-結(jié)合劑包括β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑。還提供了相關(guān)多肽和多核苷酸、包含所述RSPO-結(jié)合劑的組合物以及制造所述RSPO-結(jié)合劑的方法。進(jìn)一步提供了使用上述新型RSPO-結(jié)合劑的方法，例如抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法、治療癌的方法、減少癌干細(xì)胞在腫瘤中的頻率的方法、抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的方法和/或鑒定和/或選擇治療用受試對(duì)象的方法。已經(jīng)鑒定出特異性結(jié)合人RSPO1的單克隆抗體：?jiǎn)慰寺】贵w89M2、89M4、89M5、89M7、89M19和89M25(實(shí)施例5、圖5)?？?RSPO1抗體89M2、89M4、89M5和89M25抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)(實(shí)施例6、圖6)?？?RSPO1抗體89M2、89M4、89M5和89M25阻斷可溶性RSPO1與LGR5的結(jié)合(實(shí)施例7、圖7)。隨后，序列數(shù)據(jù)證明抗體89M2、89M4、89M5和89M25含有相同的重鏈和輕鏈可變區(qū)，并且據(jù)推斷這些抗體會(huì)包含相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)。抗-RSPO1抗體89M4、89M5、89M7和89M25對(duì)人和小鼠RSPO1的結(jié)合親和性都小于0.1nM(實(shí)施例8)。產(chǎn)生了89M5的人源化版本h89M5-H2L2(實(shí)施例19)，其對(duì)人RSPO1的結(jié)合親和性小于0.1nM(實(shí)施例20)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗-RSPO1抗體89M5和89M25在卵巢瘤異種移植物模型中作為單獨(dú)的試劑和與化學(xué)治療劑組合在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(實(shí)施例9、圖8)?？?RSPO1抗體89M5顯示在胰腺瘤異種移植物模型中與化學(xué)治療劑組合在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(實(shí)施例17、圖15)。初步的表位作圖研究表明，抗-RSPO1抗體89M5的結(jié)合位點(diǎn)涉及RSPO1的弗林蛋白酶2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸(實(shí)施例10、圖9)。此外，已經(jīng)鑒定出特異性結(jié)合人RSPO2的單克隆抗體：?jiǎn)慰寺】贵w130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28(實(shí)施例11、圖10)。抗-RSPO2抗體130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28據(jù)顯示會(huì)減少或完全阻斷β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)(實(shí)施例12、圖11)。抗-RSPO2抗體130M23和130M24阻斷可溶性RSPO2與LGR5的結(jié)合(實(shí)施例13、圖12)?？?RSPO2抗體130M23對(duì)人RSPO2的結(jié)合親和性為0.14nM，對(duì)小鼠RSPO2的結(jié)合親和性為0.35nM(實(shí)施例15)。產(chǎn)生了130M23的人源化版本h130M23-H1L2和h130M23-H1L6(實(shí)施例19)?？?RSPO2抗體h130M23-H1L2對(duì)人RSPO2的結(jié)合親和性為0.13nM，h130M23-H1L6對(duì)人RSPO2的結(jié)合親和性為0.15nM(實(shí)施例20)?？?RSPO2抗體130M23顯示在胰腺瘤異種移植物模型中作為單獨(dú)試劑和與另外的化學(xué)治療劑組合在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(實(shí)施例17和18、圖15和16)。I.定義為了便于理解本發(fā)明，將許多術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)如下定義。本文所用的術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”和“拮抗的”是指任何部分或完全阻斷、抑制、減少或中和靶標(biāo)和/或信號(hào)傳導(dǎo)途徑(例如，β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo))的分子。本文使用術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”來(lái)包括任何部分或完全阻斷、抑制、減少或中和蛋白質(zhì)的活性(例如，RSPO蛋白)的分子。合適的拮抗劑分子具體包括但不限于拮抗性抗體或抗體片段。本文使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”和“調(diào)整”是指生物活性的改變或變化。調(diào)節(jié)包括但不限于刺激或抑制活性。調(diào)節(jié)可以是活性的增加或降低(例如RSPO信號(hào)傳導(dǎo)的降低、β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的降低)、結(jié)合特性的改變、或者與蛋白活性、途徑或其他所關(guān)注生物點(diǎn)有關(guān)的生物、功能或免疫性質(zhì)上的任何其他改變。本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指免疫球蛋白分子，其通過(guò)免疫球蛋白分子的可變區(qū)內(nèi)的至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)識(shí)別和特異性結(jié)合靶標(biāo)，例如蛋白質(zhì)、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)或者前述的組合。如本文所述，該術(shù)語(yǔ)涵蓋了完整的多克隆抗體、完整的單克隆抗體、抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、單鏈Fv(scFv)抗體、多特異性抗體(例如由至少兩個(gè)完整抗體產(chǎn)生的雙特異性抗體)、單特異性抗體、單價(jià)抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、包含抗體的抗原決定部分的融合蛋白和包含抗原識(shí)別位點(diǎn)的任何其他經(jīng)修飾免疫球蛋白分子，只要該抗體展現(xiàn)所需的生物活性即可?；诜謩e稱為α、δ、ε、γ和μ的抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，抗體可以是免疫球蛋白的五個(gè)主要類(lèi)別中的任一個(gè)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或者其亞類(lèi)(同種型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同類(lèi)別的免疫球蛋白具有不同且公知的亞基結(jié)構(gòu)以及三維構(gòu)型?？贵w可以是裸露的，或綴合至其他分子，包括但不限于毒素和放射性同位素。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”是指完整抗體的一部分，并且是指完整抗體的抗原決定可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、線性抗體、單鏈抗體以及由抗體片段形成的多特異性抗體。本文使用的“抗體片段”包括抗原結(jié)合位點(diǎn)或表位結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)抗體的“可變區(qū)”是指抗體輕鏈的可變區(qū)和/或抗體重鏈的可變區(qū)。重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自由通過(guò)三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(也稱為“超變區(qū)”)連接的四個(gè)框架區(qū)(FR)組成。各鏈中的CDR通過(guò)框架區(qū)而保持得相互靠近，并與來(lái)自其他鏈的CDR一起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成。確定CDR的技術(shù)至少有兩種技術(shù)：(1)基于交叉物種序列可變性的方法(即，Kabat等,1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,NationalInstitutesofHealth,BethesdaMD)和(2)基于抗原-抗體復(fù)合物的晶體研究的方法(Al-Lazikani等,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948)。此外，本領(lǐng)域有時(shí)使用這兩種方法的組合來(lái)確定CDR。本文使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指參與高特異性識(shí)別和結(jié)合單一抗原決定簇或表位的均勻抗體群體。這與多克隆抗體相反，多克隆抗體通常包括針對(duì)不同抗原決定簇的不同抗體的混合物。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”涵蓋了完整和全長(zhǎng)單克隆抗體以及抗體片段(例如,Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)抗體、包含抗體部分的融合蛋白和包含抗原識(shí)別位點(diǎn)(抗原結(jié)合位點(diǎn))的任何其他經(jīng)修飾免疫球蛋白分子。此外，“單克隆抗體”是指通過(guò)任意數(shù)量的技術(shù)制造的此類(lèi)抗體，所述技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)、噬菌體選擇、重組表達(dá)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”是指非人(例如鼠類(lèi))抗體的形式，其是特異性的免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其含有最小非人序列的片段。通常，人源化抗體是其中CDR殘基被具有所需特異性、親和性和/或結(jié)合能力的非人物種(例如小鼠、大鼠、兔或倉(cāng)鼠)的CDR殘基替換的人免疫球蛋白(Jones等,1986,Nature,321:522-525；Riechmann等,1988,Nature,332:323-327；Verhoeyen等,1988,Science,239:1534-1536)。在某些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)殘基被來(lái)自具有所需特異性、親和性和/或結(jié)合能力的非人物種的抗體中的相應(yīng)殘基替換。人源化抗體可以通過(guò)Fv框架區(qū)中和/或所替換的非人殘基中的另外殘基的取代而被進(jìn)一步修飾，從而改善和優(yōu)化抗體特異性、親和性和/或結(jié)合能力。通常，人源化抗體會(huì)包含至少一個(gè)、通常2個(gè)或3個(gè)含有所有或基本上所有對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR的可變結(jié)構(gòu)域，但所有或基本上所有的框架區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的框架區(qū)。人源化抗體還可以包括免疫球蛋白恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域(Fc)的至少一部分。用于生成人源化抗體的方法的實(shí)例描述于例如美國(guó)專(zhuān)利5,225,539。本文使用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”是指由人產(chǎn)生的抗體，或者具有對(duì)應(yīng)于使用任何本領(lǐng)域已知的技術(shù)制造的由人產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列的抗體。人抗體的該定義特別排除了包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自兩種以上物種的抗體。通常，輕鏈和重鏈的可變區(qū)對(duì)應(yīng)于源自一個(gè)具有所需特異性、親和性和/或結(jié)合能力的哺乳動(dòng)物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)，而恒定區(qū)與源自另一物種(通常為人)的抗體中的序列是同源的，以避免引起該物種中的免疫響應(yīng)。文使用的短語(yǔ)“親和性成熟抗體”是指在其一個(gè)或多個(gè)CDR中具有一個(gè)或多個(gè)改變的抗體，所述改變導(dǎo)致與不擁有這些改變的親本抗體相比，該抗體與抗原的親和性得到改善。優(yōu)選的親和性成熟抗體會(huì)對(duì)靶抗原具有納摩爾甚至皮摩爾的親和性。親和性成熟抗體通過(guò)本領(lǐng)域已知的步驟產(chǎn)生。例如，Marks等,1992,Bio/Technology10:779-783中描述了通過(guò)VH和VL結(jié)構(gòu)域重排產(chǎn)生的親和性成熟。Barbas等,1994,PNAS,91:3809-3813；Schier等,1995,Gene,169:147-155；Yelton等,1995,J.Immunol.155:1994-2004；Jackson等,1995,J.Immunol.,154:3310-9；和Hawkins等,1992,J.Mol.Biol.,226:889-896中描述了CDR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變。術(shù)語(yǔ)“表位”和“抗原決定簇”在本文可以相互替換地使用，并且是指抗原的能夠被特定抗體識(shí)別和特異性結(jié)合的部分。當(dāng)抗原是多肽時(shí)，表位可以由相鄰的氨基酸以及通過(guò)蛋白質(zhì)的三維折疊而并排的非相鄰氨基酸形成。由相鄰氨基酸形成的表位(也稱為線性表位)通常在蛋白質(zhì)變性時(shí)保留，而由三維折疊形成的表位(也稱為構(gòu)象表位)通常在蛋白質(zhì)變性時(shí)丟失。表位通常在獨(dú)特的空間構(gòu)象中包括至少3個(gè)、更經(jīng)常至少5個(gè)或8～10個(gè)氨基酸。術(shù)語(yǔ)“選擇性結(jié)合”或“特異性結(jié)合”是指與替代物質(zhì)(包括不相關(guān)蛋白)相比，抗體與表位、蛋白質(zhì)或靶分子反應(yīng)或結(jié)合得更頻繁、更迅速、更持久、更具親和性或以上情況的一些組合。在一些實(shí)施方式中，“特異性結(jié)合”例如是指抗體與蛋白結(jié)合的KD為約0.1mM以下，更通常小于約1μM。在一些實(shí)施方式中，“特異性結(jié)合”有時(shí)是指抗體與靶標(biāo)結(jié)合的KD為至少約0.1μM以下，其他情況下是指為至少約0.01μM以下，另外的情況下為至少約1nM以下。由于不同物種的同源蛋白之間的序列同一性，特異性結(jié)合可以包括在超過(guò)一個(gè)物種(例如人RSPO1和小鼠RSPO1)中識(shí)別蛋白質(zhì)的抗體。類(lèi)似地，由于不同蛋白質(zhì)的多肽序列的特定區(qū)域內(nèi)的同源性，特異性結(jié)合可以包括識(shí)別超過(guò)一種蛋白質(zhì)(例如人RSPO1和人RSPO2)的抗體(或其他多肽或結(jié)合劑)。應(yīng)該理解的是，在一些實(shí)施方式中，抗體或特異性結(jié)合第一靶標(biāo)的結(jié)合部分可以或不可以特異性結(jié)合第二靶標(biāo)。因此，“特異性結(jié)合”不必然要求(但其包括)專(zhuān)一性結(jié)合(即與單一靶標(biāo)結(jié)合)。所以，在一些實(shí)施方式中，抗體可以特異性結(jié)合超過(guò)一種靶標(biāo)。在一些實(shí)施方式中，多種靶標(biāo)可以被抗體上的同一抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。例如，在一些情況下，抗體可以包括兩個(gè)相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合兩種以上蛋白質(zhì)(例如RSPO1和RSPO2)上的相同表位。在一些替代實(shí)施方式中，抗體可以是雙特異性的或多特異性的，并且包含至少兩個(gè)具有不同特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)。非限制性舉例而言，雙特異性抗體可以包括識(shí)別一種蛋白質(zhì)(例如人RSPO1)上的表位的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，還包含第二個(gè)不同的識(shí)別第二蛋白質(zhì)上的不同表位的抗原結(jié)合位點(diǎn)。通常提到結(jié)合是指特異性結(jié)合，但并非必然如此。術(shù)語(yǔ)“多肽”和“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可以相互替換地使用，并且是指任何長(zhǎng)度的氨基酸的聚合物。該聚合物可以是直鏈或支鏈的，其可以包含經(jīng)修飾氨基酸，并且其可以間插非氨基酸。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋了通過(guò)天然或干預(yù)而進(jìn)行修飾的聚合物，例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修飾，例如與標(biāo)記成分綴合。該定義中還涵蓋了例如含有氨基酸的一種或多種類(lèi)似物(包括例如非天然氨基酸)以及其他本領(lǐng)域已知的修飾的多肽。應(yīng)該理解的是，由于本發(fā)明的多肽可以基于抗體，在一些實(shí)施方式中，所述多肽可以作為單鏈或結(jié)合鏈出現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“核酸”在本文可以相互替換地使用，是指任何長(zhǎng)度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核酸、核糖核酸、經(jīng)修飾核苷酸或堿基和/或他們的類(lèi)似物，或者可以通過(guò)DNA或RNA聚合酶引入聚合物中的任何物質(zhì)?！案邍?yán)謹(jǐn)條件”可以通過(guò)以下鑒定：(1)使用低離子強(qiáng)度和高溫以用于洗滌，例如50℃的15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉；(2)雜交期間使用諸如甲酰胺等變性劑，例如42℃的具有0.1％胎牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH6.5的50mM磷酸鈉緩沖液(帶750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉)的50％(v/v)甲酰胺；或(3)使用42℃的50％甲酰胺、5×SSC(0.75MNaCl,75mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5×鄧哈特溶液(Denhardt'ssolution)、超聲處理的鮭魚(yú)精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％右旋糖酐硫酸酯，在42℃的0.2×SSC中洗滌，在55℃的50％甲酰胺中洗滌，然后在55℃的由含有EDTA的0.1×SSC組成的高嚴(yán)謹(jǐn)洗滌液中洗滌。在兩個(gè)以上核酸或多肽的背景下的術(shù)語(yǔ)“同一性”或百分比“同一性”，是指不考慮作為序列同一性的一部分的任何保守性氨基酸取代，當(dāng)就最大相應(yīng)性進(jìn)行比較和比對(duì)(必要時(shí)引入空位)時(shí)，兩個(gè)或更多個(gè)相同或的序列或亞序列、或所述序列或亞序列的特定百分比的核苷酸或氨基酸殘基是相同的。可以使用序列比較軟件或算法或通過(guò)目視檢查測(cè)定百分比同一性?？捎糜讷@得氨基酸或核苷酸序列的比對(duì)的各種算法和軟件是本領(lǐng)域已知的。這些包括但不限于LAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCGWisconsinPackage及其各種變體。如使用序列比較算法或通過(guò)目視檢查所測(cè)定的，當(dāng)就最大相應(yīng)性進(jìn)行比較和比對(duì)時(shí)，本發(fā)明的兩種核酸或多肽基本上具有同一性，這意味著他們具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、且在一些實(shí)施方式中至少95％、96％、97％、98％、99％核苷酸或氨基酸殘基同一性。在一些實(shí)施方式中，在長(zhǎng)度為至少約10個(gè)、至少約20個(gè)、至少約40-60個(gè)、至少約60-80個(gè)殘基或其間的任意整數(shù)值的序列區(qū)域上存在同一性。在一些實(shí)施方式中，在大于60-80個(gè)殘基的更長(zhǎng)區(qū)域(例如至少約80-100個(gè)殘基)上存在同一性，并且在一些實(shí)施方式中，序列在所比較的序列(例如核苷酸序列的編碼序列)的全長(zhǎng)上基本上是相同的?！氨Ｊ匦园被崛〈笔瞧渲幸粋€(gè)氨基酸被具有相似側(cè)鏈的另一氨基酸替換的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已經(jīng)在本領(lǐng)域中定義，包括堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支鏈側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守性取代。優(yōu)選的是，本發(fā)明的多肽序列和抗體中的保守性取代不會(huì)消除含有上述氨基酸序列的多肽或抗體與抗原的結(jié)合，所述抗原即所述多肽或抗體所結(jié)合的一種或多種RSPO蛋白。鑒定不消除抗原結(jié)合的核苷酸和氨基酸保守性取代的方法是本領(lǐng)域公知的。本文使用的術(shù)語(yǔ)“載體”是指構(gòu)建體，其能夠遞送并且通常在宿主細(xì)胞中表達(dá)一種或多種目的基因或序列。載體的實(shí)例包括但不限于病毒載體、裸DNA或RNA表達(dá)載體、質(zhì)粒、粘?；蚴删w載體、與陽(yáng)離子縮合劑連接的DNA或RNA表達(dá)載體和包封在脂質(zhì)體中的DNA或RNA表達(dá)載體?！胺蛛x的”多肽、抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組合物是處于未見(jiàn)于自然界中的形式的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組合物。分離的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組合物包括已經(jīng)被純化至他們不再處于其見(jiàn)于自然界中的形式的程度的那些。在一些實(shí)施方式中，分離的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組合物是基本上純的。本文使用的術(shù)語(yǔ)“基本上純”是指至少為50％純(純即無(wú)污染物)、至少為90％純、至少為95％純、至少為98％純或至少為99％純的材料。本文使用的術(shù)語(yǔ)“癌”和“癌性的”是指或描述其中細(xì)胞群的特征在于不受控的細(xì)胞生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物中的生理?xiàng)l件。癌的實(shí)例包括但不限于上皮癌、母細(xì)胞瘤、肉瘤和血液癌(例如淋巴瘤和白血病)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“腫瘤”和“贅生物”是指由過(guò)度細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖(良性(非癌性)或惡性(癌性)，包括前癌損傷)引起的任何組織團(tuán)塊。本文使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)移”是指癌從起始位點(diǎn)擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移至身體的其他區(qū)域并在新位置發(fā)育有類(lèi)似的癌損傷的過(guò)程?！稗D(zhuǎn)移”或“轉(zhuǎn)移性”細(xì)胞是喪失與鄰近細(xì)胞的粘附接觸、通過(guò)血流或淋巴從疾病的原發(fā)位點(diǎn)移動(dòng)從而入侵鄰近的身體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“癌干細(xì)胞”和“CSC”和“腫瘤干細(xì)胞”和“腫瘤起始細(xì)胞”在本文可以相互替換地使用，并且是指來(lái)自癌或腫瘤的如下細(xì)胞：(1)具有全面的增殖能力；2)能夠進(jìn)行不對(duì)稱細(xì)胞分裂以產(chǎn)生一種或多種分化細(xì)胞后裔，其中分化細(xì)胞具有減少的增殖或發(fā)育潛能；和(3)能夠進(jìn)行對(duì)稱細(xì)胞分裂以自我更新或自我維持。與不能形成腫瘤的大多數(shù)腫瘤細(xì)胞相比，這些性質(zhì)賦予癌干細(xì)胞在連續(xù)移植到免疫妥協(xié)的宿主(例如小鼠)時(shí)形成或建立腫瘤或癌的能力。癌干細(xì)胞以無(wú)序方式進(jìn)行自我更新和分化，從而形成具有異常細(xì)胞類(lèi)型的腫瘤，由于發(fā)生突變，所述異常細(xì)胞類(lèi)型能夠隨時(shí)間發(fā)生改變。術(shù)語(yǔ)“癌細(xì)胞”和“腫瘤細(xì)胞”是指源自癌或腫瘤或前癌損傷的總細(xì)胞群體，其包括非致瘤性細(xì)胞(其包含大量癌細(xì)胞群)和致瘤性干細(xì)胞(癌干細(xì)胞)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“癌細(xì)胞”或“腫瘤細(xì)胞”當(dāng)僅指缺乏更新分化能力的那些細(xì)胞時(shí)會(huì)被術(shù)語(yǔ)“非致瘤性的”修飾，從而將這些腫瘤細(xì)胞與癌干細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“致瘤性的”是指癌干細(xì)胞的功能特征，包括自我更新性質(zhì)(產(chǎn)生另外的致瘤性癌干細(xì)胞)和增殖以產(chǎn)生所有其他腫瘤細(xì)胞的性質(zhì)(產(chǎn)生分化的非致瘤性腫瘤細(xì)胞)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“致瘤性”是指來(lái)自腫瘤的隨機(jī)細(xì)胞樣品在連續(xù)移植至免疫妥協(xié)的宿主(例如，小鼠)時(shí)形成可察覺(jué)的腫瘤的能力。術(shù)語(yǔ)“受試對(duì)象”是指任何動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物)，包括但不限于人、非人靈長(zhǎng)類(lèi)、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物等，其是特定治療的接受者。通常而言，本文術(shù)語(yǔ)“受試對(duì)象”或“患者”在指人類(lèi)受試對(duì)象時(shí)可相互替換地使用。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指由聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或能夠批準(zhǔn)或在美國(guó)藥典或用于包括人類(lèi)在內(nèi)的動(dòng)物的其它公認(rèn)的藥典中列出。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的賦形劑、載劑或佐劑”或“可接受的藥物載劑”是指可以與至少一種本發(fā)明的結(jié)合劑(例如抗體)施用至受試對(duì)象的賦形劑、載劑或佐劑，當(dāng)以足以遞送治療效果的劑量施用時(shí)其不破壞至少一種本發(fā)明的結(jié)合劑的藥物活性，并且是非毒性的。術(shù)語(yǔ)“有效量”或“治療有效量”或“治療效果”是指對(duì)于“治療”受試對(duì)象或哺乳動(dòng)物中的疾病或病癥有效的結(jié)合劑、抗體、多肽、多核苷酸、有機(jī)小分子或其他藥物的量。在癌的情況下，藥物的治療有效量具有治療效果，因此能夠減少癌細(xì)胞的數(shù)量；降低致瘤性、致瘤頻率或致瘤能力；減小癌干細(xì)胞的數(shù)量和頻率；減小腫瘤尺寸；減少癌細(xì)胞群；抑制或停止癌細(xì)胞浸潤(rùn)到周?chē)鞴伲ɡ绨U(kuò)散至軟組織和骨中；抑制和停止腫瘤或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；抑制和停止腫瘤或癌細(xì)胞生長(zhǎng)；某種程度上減緩與癌有關(guān)的一種或多種癥狀；減少發(fā)病率和致死率；改善生活品質(zhì)；或所述效果的組合。如果試劑，例如抗體防止現(xiàn)有癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞，則可以將其稱為細(xì)胞抑制劑和/或細(xì)胞毒素。術(shù)語(yǔ)“治療中”或“治療”或“待治療”或“緩解”或“待緩解”等術(shù)語(yǔ)是指1)治愈、減慢、減輕所診斷病理疾病或病癥的癥狀和/或暫停其發(fā)展的治療性措施，以及2)預(yù)防和/或減慢目的病理疾病或病癥的發(fā)展的預(yù)防性或防止性措施。因此需要治療的對(duì)象包括已經(jīng)罹患疾病的對(duì)象、傾向于罹患疾病的對(duì)象和其中待要預(yù)防疾病的對(duì)象。在一些實(shí)施方式中，如果患者顯示以下情況中的一種或多種，則根據(jù)本發(fā)明的方法成功地“治療”了受試對(duì)象：癌細(xì)胞的數(shù)量減少或完全不存在；腫瘤尺寸的減??；浸潤(rùn)到周?chē)鞴俚陌┘?xì)胞(包括例如癌至軟組織和骨的擴(kuò)散)受抑制或不存在；腫瘤或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移受抑制或不存在；癌生長(zhǎng)受抑制或不存在；與特定癌相關(guān)的一種或多種癥狀的緩解；發(fā)病率和致死率減少；生活品質(zhì)提高；或上述效果的某些組合。如本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求所用，單數(shù)形式的“一種”、“一個(gè)”和“所述”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確地指出例外。應(yīng)該理解的是，在本文無(wú)論何處以語(yǔ)言“包含”描述了實(shí)施方式，也就提供了以術(shù)語(yǔ)“由……組成”和/或“基本上由……組成”描述的另外的類(lèi)似實(shí)施方式。本文諸如“A和/或B”等短語(yǔ)中使用的術(shù)語(yǔ)“和/或”旨在包括A和B、A或B、(單獨(dú)的)A和(單獨(dú)的)B。類(lèi)似地，諸如“A、B和/或C”等短語(yǔ)中使用的術(shù)語(yǔ)“和/或”旨在涵蓋了以下實(shí)施方式中的每一種：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；(單獨(dú)的)A(單獨(dú))；(單獨(dú)的)B(單獨(dú))；和(單獨(dú)的)C。II.RSPO-結(jié)合劑本發(fā)明提供結(jié)合人RSPO蛋白的試劑。本文將這些試劑稱為“RSPO-結(jié)合劑”。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是多肽。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSPO1。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSPO3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO試劑特異性結(jié)合至少一種其他人RSPO。在一些實(shí)施方式中，由RSPO1-結(jié)合劑結(jié)合的所述至少一種其他人RSPO選自由RSPO2、RSPO3和RSPO4組成的組。在一些實(shí)施方式中，由RSPO2-結(jié)合劑結(jié)合的所述至少一種其他人RSPO選自由RSPO1、RSPO3和RSPO4組成的組。在一些實(shí)施方式中，由RSPO3-結(jié)合劑結(jié)合的所述至少一種其他人RSPO選自由RSPO1、RSPO2和RSPO4組成的組。人RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4的全長(zhǎng)氨基酸(aa)序列是本領(lǐng)域已知的，并且在本文作為SEQIDNO:1(RSPO1)、SEQIDNO:2(RSPO2)、SEQIDNO:3(RSPO3)和SEQIDNO:4(RSPO4)提供。在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSPO-結(jié)合劑(例如抗體)的抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠結(jié)合(或結(jié)合)一種、兩種、三種或四種RSPO。在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSPO1-結(jié)合劑(例如抗體)的抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠結(jié)合(或結(jié)合)RSPO1以及一種、兩種或三種其他RSPO。例如，在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑的抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠特異性結(jié)合RSPO1以及至少一種選自由RSPO2、RSPO3和RSPO4組成的組中的其他RSPO。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO1和RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO1和RSPO3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO1和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO1、RSPO2和RSPO3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO1、RSPO2和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO1、RSPO3和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑特異性結(jié)合人RSPO1。在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSPO1-結(jié)合劑(例如抗體)特異性結(jié)合人RSPO1和小鼠RSPO1。在一些實(shí)施方式中，所述試劑(結(jié)合劑)是在人RSPO1的21～263位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述試劑(結(jié)合劑)是在人RSPO1的31～263位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合劑是在人RSPO1的34～135位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合劑是在人RSPO1的91～135位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑在SEQIDNO:5內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑在SEQIDNO:9內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑或抗體結(jié)合RSPO1的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述試劑或抗體結(jié)合在RSPO1的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑或抗體在序列SEQIDNO:6或SEQIDNO:7內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑或抗體在序列SEQIDNO:6和SEQIDNO:7內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑結(jié)合RSPO1的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑或抗體結(jié)合RSPO1的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑或抗體在SEQIDNO:8內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSPO2-結(jié)合劑(例如抗體)的抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠結(jié)合(或結(jié)合)RSPO2以及一種、兩種或三種其他RSPO。例如，在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑的抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠特異性結(jié)合RSPO2以及至少一種選自由RSPO1、RSPO3和RSPO4組成的組中的其他RSPO。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO2和RSPO1。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO2和RSPO3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO2和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO2、RSPO3和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO2、RSPO1和RSPO3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO2、RSPO1和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑特異性結(jié)合人RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑(例如抗體)特異性結(jié)合人RSPO2和小鼠RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述試劑(結(jié)合劑)是在人RSPO2的22～243位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述試劑(結(jié)合劑)是在人RSPO2的22～205位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原-結(jié)合劑是在人RSPO2的31～146位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合劑是在人RSPO2的31～89位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合劑是在人RSPO2的90～134位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合劑是在人RSPO2的90～146位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑在SEQIDNO:43內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑在SEQIDNO:44內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑或抗體結(jié)合RSPO2的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述試劑或抗體結(jié)合在RSPO2的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑或抗體在序列SEQIDNO:45或SEQIDNO:46內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑或抗體在序列SEQIDNO:45和SEQIDNO:46內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑結(jié)合RSPO2的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑或抗體結(jié)合RSPO2的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑或抗體在SEQIDNO:47內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSPO3-結(jié)合劑(例如抗體)的抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠結(jié)合(或結(jié)合)RSPO3以及一種、兩種或三種其他RSPO。例如，在一些實(shí)施方式中，RSPO3-結(jié)合劑的抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠特異性結(jié)合RSPO3以及至少一種選自由RSPO1、RSPO2和RSPO4組成的組中的其他RSPO。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO3和RSPO1。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO3和RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO3和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO3、RSPO1和RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO3、RSPO1和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPO3、RSPO2和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑特異性結(jié)合人RSPO3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑(例如抗體)特異性結(jié)合人RSPO3和小鼠RSPO3。在一些實(shí)施方式中，所述試劑(結(jié)合劑)是在人RSPO3的22～272位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述試劑(結(jié)合劑)是在人RSPO3的22～207位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合劑是在人RSPO3的35～135位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合劑是在人RSPO3的35～86位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原-結(jié)合劑是在人RSPO3的92～135位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑在SEQIDNO:48內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑或抗體結(jié)合RSPO3的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述試劑或抗體結(jié)合在RSPO3的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑或抗體在序列SEQIDNO:49或SEQIDNO:50內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑或抗體在序列SEQIDNO:49和SEQIDNO:50內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑結(jié)合RSPO3的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑或抗體結(jié)合RSPO3的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑或抗體在SEQIDNO:51內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑或抗體以約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下或約0.1nM以下的解離常數(shù)(KD)結(jié)合至少一種RSPO蛋白。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑或抗體以約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下或約0.1nM以下的解離常數(shù)(KD)結(jié)合RSPO1。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑或抗體以約1nM以下的解離常數(shù)(KD)結(jié)合RSPO1。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑或抗體以約0.1nM以下的解離常數(shù)(KD)結(jié)合RSPO1。在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSPO1-結(jié)合劑或抗體結(jié)合至少一種其他RSPO。在一些實(shí)施方式中，本文描述的結(jié)合至少一種其他RSPO的RSPO1-結(jié)合劑或抗體與至少一種其他RSPO結(jié)合的KD為約100nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下或約0.1nM以下。例如，在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑或抗體還以約10nM以下的KD結(jié)合RSPO2、RSPO3和/或RSPO4。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑(例如抗體)以約0.1nM以下的KD結(jié)合人RSPO1。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑以約10nM以下的KD結(jié)合人RSPO和小鼠RSPO。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑以約1nM以下的KD結(jié)合人RSPO1和小鼠RSPO1。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑以約0.1nM以下的KD結(jié)合人RSPO1和小鼠RSPO1。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑或抗體以約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下或約0.1nM以下的解離常數(shù)(KD)結(jié)合RSPO2。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑或抗體以約10nM以下的解離常數(shù)(KD)結(jié)合RSPO2。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑或抗體以約1nM以下的解離常數(shù)(KD)結(jié)合RSPO2。在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSPO2-結(jié)合劑或抗體結(jié)合至少一種其他RSPO。在一些實(shí)施方式中，本文描述的結(jié)合至少一種其他RSPO的RSPO2-結(jié)合劑或抗體與至少一種其他RSPO結(jié)合的KD為約100nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下或約0.1nM以下。例如，在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑或抗體還以約10nM以下的KD結(jié)合RSPO1、RSPO3和/或RSPO4。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑(例如抗體)以約1nM以下的KD結(jié)合人RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑以約10nM以下的KD結(jié)合人RSPO和小鼠RSPO。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑以約1nM以下的KD結(jié)合人RSPO1和小鼠RSPO1。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑以約0.1nM以下的KD結(jié)合人RSPO2和小鼠RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑(例如抗體)與RSPO蛋白的解離常數(shù)是使用固定在Biacore芯片上的包含至少一部分所述RSPO蛋白的RSPO融合蛋白確定的解離常數(shù)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑(例如抗體)以約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下或約0.1nM以下的半最大效應(yīng)濃度(EC50)結(jié)合至少一種人RSPO蛋白。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑(例如抗體)以約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下或約0.1nM以下的半最大效應(yīng)濃度(EC50)結(jié)合人RSPO1。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑(例如抗體)還以約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下或約0.1nM以下的EC50結(jié)合人RSPO2、RSPO3和/或RSPO4。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑(例如抗體)以約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下或約0.1nM以下的半最大效應(yīng)濃度(EC50)結(jié)合人RSPO2。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑(例如抗體)還以約40nM以下、約20nM以下、約10nM以下、約1nM以下或約0.1nM以下的EC50結(jié)合人RSPO1、RSPO3和/或RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是重組抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是嵌合抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是人源化抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是人抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是IgG1抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是IgG2抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是單價(jià)抗體、單特異性抗體、雙價(jià)抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體綴合至細(xì)胞毒素部分。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是分離的。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是基本上純的。本發(fā)明的RSPO-結(jié)合劑(例如抗體)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行特異性結(jié)合檢驗(yàn)?？梢允褂玫拿庖邫z驗(yàn)包括但不限于使用諸如以下技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性檢驗(yàn)系統(tǒng)：Biacore分析、FACS分析、免疫熒光、免疫細(xì)胞化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡、放射性免疫檢驗(yàn)、ELISA、“夾心”免疫檢驗(yàn)、免疫沉淀檢驗(yàn)、沉淀反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散檢驗(yàn)、凝集檢驗(yàn)、補(bǔ)體固定檢驗(yàn)、免疫放射檢驗(yàn)、熒光免疫檢驗(yàn)和蛋白A免疫檢驗(yàn)。此類(lèi)檢驗(yàn)是常規(guī)的，并且是本領(lǐng)域公知的(例如參見(jiàn),Ausubel等編,1994-present,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,NY)。例如，抗體與人RSPO1的特異性結(jié)合可以使用ELISA確定。ELISA檢驗(yàn)包括：制備抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，向所述孔添加綴合至諸如酶促底物(例如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶)等可檢測(cè)化合物的所述RSPO1-結(jié)合抗體或其他RSPO1-結(jié)合劑，溫育一段時(shí)間，和檢測(cè)與所述抗原結(jié)合的抗體的存在。在一些實(shí)施方式中，所述述RSPO1-結(jié)合抗體或試劑不綴合至可檢測(cè)化合物，而是向所述孔添加識(shí)別所述RSPO1-結(jié)合抗體或試劑的第二綴合抗體。在一些實(shí)施方式中，作為用所述抗原包被所述孔的替代方案，將所述RSPO-結(jié)合抗體或試劑包被孔，將所述抗原添加至經(jīng)包被孔，之后可以添加綴合至可檢測(cè)化合物的第二抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知曉對(duì)于參數(shù)可以對(duì)其進(jìn)行修改以增加所檢測(cè)信號(hào)以及本領(lǐng)域已知的ELISA的其他變化。在一個(gè)實(shí)例中，抗體與人RSPO1的特異性結(jié)合可以使用FACS確定。FACS篩選檢驗(yàn)可以包括：產(chǎn)生表達(dá)作為融合蛋白(例如，RSPO1-Fc或RSPO1-CD4TM)的抗原的cDNA構(gòu)建體，將所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，在所述細(xì)胞的表面上表達(dá)所述抗原，將所述RSPO1-結(jié)合抗體或其他RSPO1-結(jié)合劑與所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞混合，和溫育一段時(shí)間。被RSPO1-結(jié)合抗體或其他RSPO1-結(jié)合劑結(jié)合的細(xì)胞可以通過(guò)使用綴合有可檢測(cè)化合物的第二抗體(例如，綴合有PE-的抗-Fc抗體)和流式細(xì)胞儀來(lái)鑒定。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知曉對(duì)于參數(shù)可以對(duì)其進(jìn)行修改以增加所檢測(cè)信號(hào)以及可以增強(qiáng)篩選的FACS的其他變化(例如，就阻斷抗體進(jìn)行篩選)?？贵w或其他結(jié)合劑與抗原(例如RSPO蛋白)的結(jié)合親和性和抗體-抗原相互作用的解離速率(off-rate)可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢驗(yàn)來(lái)確定。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢驗(yàn)的一個(gè)實(shí)例是放射性免疫檢驗(yàn)，其包括使經(jīng)標(biāo)記抗原(例如3H或125I)或其片段或變體與目的抗體在遞增量的未標(biāo)記抗原的存在下進(jìn)行溫育，然后檢測(cè)與所述經(jīng)標(biāo)記抗原結(jié)合的抗體?？贵w對(duì)抗原(例如RSPO蛋白)的親和性和結(jié)合解離速率可以通過(guò)Scatchard作圖分析確定。在一些實(shí)施方式中，使用Biacore動(dòng)力學(xué)分析來(lái)確定結(jié)合抗原(例如RSPO蛋白)的抗體或試劑的結(jié)合和解離速率。Biacore動(dòng)力學(xué)分析包括從表面上具有經(jīng)固定抗原(例如RSPO蛋白)的芯片上分析抗體的結(jié)合和解離。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人RSPO1的RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗體)包含抗體89M5的CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)和/或六個(gè)(見(jiàn)表1)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑包含89M5的CDR中的一個(gè)以上、89M5的CDR中的兩個(gè)以上、89M5的CDR中的三個(gè)以上、89M5的CDR中的四個(gè)以上、89M5的CDR中的五個(gè)以上或89M5的CDR中的所有六個(gè)。表1在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人RSPO1的RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO1-結(jié)合劑含有包含TGYTMH(SEQIDNO:12)的重鏈CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQIDNO:13)的重鏈CDR2和包含KEFSDGYYFFAY(SEQIDNO:14)的重鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑還含有包含KASQDVIFAVA(SEQIDNO:15)的輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQIDNO:16)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTPW(SEQIDNO:17)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑含有包含KASQDVIFAVA(SEQIDNO:15)的輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQIDNO:16)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTPW(SEQIDNO:17)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑含有：(a)包含TGYTMH(SEQIDNO:12)的重鏈CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQIDNO:13)的重鏈CDR2和包含KEFSDGYYFFAY(SEQIDNO:14)的重鏈CDR3；和(b)包含KASQDVIFAVA(SEQIDNO:15)的輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQIDNO:16)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTPW(SEQIDNO:17)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人RSPO1的RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO1-結(jié)合劑含有：(a)包含TGYTMH(SEQIDNO:12)的重鏈CDR1，或者包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的其變體；(b)包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQIDNO:13)的重鏈CDR2，或者包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的其變體；(c)包含KEFSDGYYFFAY(SEQIDNO:14)的重鏈CDR3，或者包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的其變體；(d)包含KASQDVIFAVA(SEQIDNO:15)的輕鏈CDR1，或者包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的其變體；(e)包含WASTRHT(SEQIDNO:16)的輕鏈CDR2，或者包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的其變體；和(f)包含QQHYSTPW(SEQIDNO:17)的輕鏈CDR3，或者包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的其變體。在一些實(shí)施方式中，所述氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合RSPO1的RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO1-結(jié)合劑包含與SEQIDNO:10具有至少約80％序列同一性的重鏈可變區(qū)和/或與SEQIDNO:11具有至少80％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑包含與SEQIDNO:10具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的重鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑包含與SEQIDNO:11具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑包含與SEQIDNO:10具有至少約95％序列同一性的重鏈可變區(qū)和/或與SEQIDNO:11具有至少約95％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑含有包含SEQIDNO:10的重鏈可變區(qū)和/或包含SEQIDNO:11的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑含有基本上由SEQIDNO:10組成的重鏈可變區(qū)和基本上由SEQIDNO:11組成的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合RSPO1的RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO1-結(jié)合劑包含與SEQIDNO:55具有至少約80％序列同一性的重鏈可變區(qū)和/或與SEQIDNO:59具有至少80％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑包含與SEQIDNO:55具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的重鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑包含與SEQIDNO:59具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑包含與SEQIDNO:55具有至少約95％序列同一性的重鏈可變區(qū)和/或與SEQIDNO:59具有至少約95％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑含有包含SEQIDNO:55的重鏈可變區(qū)和/或包含SEQIDNO:59的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑含有基本上由SEQIDNO:55組成的重鏈可變區(qū)和基本上由SEQIDNO:59組成的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合RSPO1的RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO1-結(jié)合劑包含：(a)與SEQIDNO:25具有至少90％序列同一性的重鏈，和/或(b)與SEQIDNO:26具有至少90％序列同一性的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑包含：(a)與SEQIDNO:25具有至少95％序列同一性的重鏈；和/或(b)與SEQIDNO:26具有至少95％序列同一性的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑含有包含SEQIDNO:25的重鏈和/或包含SEQIDNO:26的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑含有基本上由SEQIDNO:25組成的重鏈和基本上由SEQIDNO:26組成的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合RSPO1的RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO1-結(jié)合劑包含：(a)與SEQIDNO:68具有至少90％序列同一性的重鏈，和/或(b)與SEQIDNO:69具有至少90％序列同一性的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑包含：(a)與SEQIDNO:68具有至少95％序列同一性的重鏈；和/或(b)與SEQIDNO:69具有至少95％序列同一性的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑含有包含SEQIDNO:68的重鏈和/或包含SEQIDNO:69的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑含有基本上由SEQIDNO:68組成的重鏈和基本上由SEQIDNO:69組成的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人RSPO2的RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗體)包括抗體130M23的CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)和/或六個(gè)(見(jiàn)表1)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑包含130M23的CDR中的一個(gè)以上、130M23的CDR中的兩個(gè)以上、130M23的CDR中的三個(gè)以上、130M23的CDR中的四個(gè)以上、130M23的CDR中的五個(gè)以上或130M23的CDR中的所有六個(gè)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人RSPO2的RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO2-結(jié)合劑含有包含SSYAMS(SEQIDNO:29)的重鏈CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQIDNO:30)的重鏈CDR2和包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQIDNO:31)的重鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑還含有包含KASQDVSSAVA(SEQIDNO:32)的輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQIDNO:33)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTP(SEQIDNO:34)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑含有包含KASQDVSSAVA(SEQIDNO:32)的輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQIDNO:33)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTP(SEQIDNO:34)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑含有：(a)包含SSYAMS(SEQIDNO:29)的重鏈CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQIDNO:30)的重鏈CDR2和包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQIDNO:31)的重鏈CDR3；和(b)包含KASQDVSSAVA(SEQIDNO:32)的輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQIDNO:33)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTP(SEQIDNO:34)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人RSPO2的RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO2-結(jié)合劑含有：(a)包含SSYAMS(SEQIDNO:29)的重鏈CDR1，或者包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的其變體；(b)包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQIDNO:30)的重鏈CDR2，或者包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的其變體；(c)包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQIDNO:31)的重鏈CDR3，或者包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的其變體；(d)包含KASQDVSSAVA(SEQIDNO:32)的輕鏈CDR1，或者包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的其變體；(e)包含WASTRHT(SEQIDNO:33)的輕鏈CDR2，或者包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的其變體；和(f)包含QQHYSTP(SEQIDNO:34)的輕鏈CDR3，或者包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的其變體。在一些實(shí)施方式中，所述氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合RSPO2的RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO2-結(jié)合劑包含與SEQIDNO:27具有至少約80％序列同一性的重鏈可變區(qū)和/或與SEQIDNO:28具有至少80％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑包含與SEQIDNO:27具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的重鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑包含與SEQIDNO:28具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑包含與SEQIDNO:27具有至少約95％序列同一性的重鏈可變區(qū)和/或與SEQIDNO:28具有至少約95％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑含有包含SEQIDNO:27的重鏈可變區(qū)和/或包含SEQIDNO:28的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑含有基本上由SEQIDNO:27組成的重鏈可變區(qū)和基本上由SEQIDNO:28組成的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合RSPO2的RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO2-結(jié)合劑包含與SEQIDNO:63具有至少約80％序列同一性的重鏈可變區(qū)和/或與SEQIDNO:67或SEQIDNO:76具有至少80％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑包含與SEQIDNO:63具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的重鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑包含與SEQIDNO:67或SEQIDNO:76具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑包含與SEQIDNO:63具有至少約95％序列同一性的重鏈可變區(qū)和/或與SEQIDNO:67或SEQIDNO:76具有至少約95％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑含有包含SEQIDNO:63的重鏈可變區(qū)和/或包含SEQIDNO:67的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑含有包含SEQIDNO:63的重鏈可變區(qū)和/或包含SEQIDNO:76的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑含有基本上由SEQIDNO:63組成的重鏈可變區(qū)和基本上由SEQIDNO:67組成的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑含有基本上由SEQIDNO:63組成的重鏈可變區(qū)和基本上由SEQIDNO:76組成的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合RSPO2的RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO2-結(jié)合劑包含：(a)與SEQIDNO:41具有至少90％序列同一性的重鏈，和/或(b)與SEQIDNO:42具有至少90％序列同一性的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑包含：(a)與SEQIDNO:41具有至少95％序列同一性的重鏈；和/或(b)與SEQIDNO:42具有至少95％序列同一性的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑含有包含SEQIDNO:41的重鏈和/或包含SEQIDNO:42的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑含有基本上由SEQIDNO:41組成的重鏈和基本上由SEQIDNO:42組成的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合RSPO2的RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO2-結(jié)合劑包含：(a)與SEQIDNO:70具有至少90％序列同一性的重鏈，和/或(b)與SEQIDNO:71或SEQIDNO:74具有至少90％序列同一性的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑包含：(a)與SEQIDNO:70具有至少95％序列同一性的重鏈；和/或(b)與SEQIDNO:71或SEQIDNO:74具有至少95％序列同一性的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑含有包含SEQIDNO:70的重鏈和/或包含SEQIDNO:71的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑含有包含SEQIDNO:70的重鏈和/或包含SEQIDNO:74的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑含有基本上由SEQIDNO:70組成的重鏈和基本上由SEQIDNO:71組成的輕鏈。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑含有基本上由SEQIDNO:70組成的重鏈和基本上由SEQIDNO:74組成的輕鏈。本發(fā)明提供多肽，包括但不限于特異性結(jié)合人RSPO蛋白的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述多肽結(jié)合人RSPO1。在一些實(shí)施方式中，所述多肽結(jié)合人RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述多肽結(jié)合人RSPO3。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含抗體89M5的CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)和/或六個(gè)(參見(jiàn)本文表1)。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含抗體130M23的CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)和/或六個(gè)(參見(jiàn)本文表1)。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含的CDR在每個(gè)CDR中具有至多四個(gè)(即，0、1、2、3或4)個(gè)氨基酸取代。在一些實(shí)施方式中，所述重鏈CDR包含在重鏈可變區(qū)內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，所述輕鏈CDR包含在輕鏈可變區(qū)內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人RSPO1的多肽，其中所述多肽包含與SEQIDNO:10或SEQIDNO:55具有至少約80％序列同一性的氨基酸序列和/或與SEQIDNO:11或SEQIDNO:59具有至少約80％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:10或SEQIDNO:55具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:11或SEQIDNO:59具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:10或SEQIDNO:55具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列和/或與SEQIDNO:11或SEQIDNO:59具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽含有包含SEQIDNO:10的氨基酸序列和/或包含SEQIDNO:11的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽含有包含SEQIDNO:55的氨基酸序列和/或包含SEQIDNO:59的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人RSPO2的多肽，其中所述多肽包含與SEQIDNO:27或SEQIDNO:63具有至少約80％序列同一性的氨基酸序列和/或與SEQIDNO:28、SEQIDNO:67或SEQIDNO:76具有至少約80％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:27或SEQIDNO:63具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:28、SEQIDNO:67或SEQIDNO:76具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:27或SEQIDNO:63具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列和/或與SEQIDNO:28、SEQIDNO:67或SEQIDNO:76具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽含有包含SEQIDNO:27的氨基酸序列和/或包含SEQIDNO:28的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽含有包含SEQIDNO:63的氨基酸序列和/或包含SEQIDNO:67的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽含有包含SEQIDNO:63的氨基酸序列和/或包含SEQIDNO:76的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人RSPO1的多肽，其中所述多肽包含與SEQIDNO:25具有至少約80％序列同一性的氨基酸序列和/或與SEQIDNO:26具有至少約80％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:25具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:26具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:25具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列和/或與SEQIDNO:26具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽含有包含SEQIDNO:25的氨基酸序列和/或包含SEQIDNO:26的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽基本上由SEQIDNO:25和/或SEQIDNO:26組成。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人RSPO1的多肽，其中所述多肽包含與SEQIDNO:68具有至少約80％序列同一性的氨基酸序列和/或與SEQIDNO:69具有至少約80％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:68具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:69具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:68具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列和/或與SEQIDNO:69具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽含有包含SEQIDNO:68的氨基酸序列和/或包含SEQIDNO:69的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽基本上由SEQIDNO:68和/或SEQIDNO:69組成。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人RSPO2的多肽，其中所述多肽包含與SEQIDNO:41具有至少約80％序列同一性的氨基酸序列和/或與SEQIDNO:42具有至少約80％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:41具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:42具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:41具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列和/或與SEQIDNO:42具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽含有包含SEQIDNO:41的氨基酸序列和/或包含SEQIDNO:42的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽基本上由SEQIDNO:41和/或SEQIDNO:42組成。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人RSPO2的多肽，其中所述多肽包含與SEQIDNO:70具有至少約80％序列同一性的氨基酸序列和/或與SEQIDNO:71或SEQIDNO:74具有至少約80％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:70具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:71或SEQIDNO:74具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO:70具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列和/或與SEQIDNO:71或SEQIDNO:74具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽含有包含SEQIDNO:70的氨基酸序列和/或包含SEQIDNO:71的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽含有包含SEQIDNO:70的氨基酸序列和/或包含SEQIDNO:74的氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述多肽基本上由SEQIDNO:70和/或SEQIDNO:71組成。在一些實(shí)施方式中，所述多肽基本上由SEQIDNO:70和/或SEQIDNO:74組成。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑含有包含選自由以下序列組成的組中的序列的多肽：SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:68和SEQIDNO:69。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑含有包含選自由以下序列組成的組中的序列的多肽：SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:74和SEQIDNO:76。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑包含89M5抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑包含89M5抗體(帶有或不帶有前導(dǎo)序列)的重鏈和輕鏈。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑是89M5抗體。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑包含處于89M5抗體的人源化形式的89M5抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑包含h89M5-H2L2抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑包含處于89M5抗體的人源化形式的89M5抗體(帶有或不帶有前導(dǎo)序列)的重鏈和輕鏈。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑包含h89M5-H2L2抗體(帶有或不帶有前導(dǎo)序列)的重鏈和輕鏈。在一些實(shí)施方式中，89M5的人源化版本是IgG1抗體。在一些實(shí)施方式中，89M5的人源化版本是IgG2抗體。將產(chǎn)生89M5抗體的雜交瘤細(xì)胞系于2011年6月30日在布達(dá)佩斯條約的條件下保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801UniversityBoulevard,Manassas,VA,美國(guó))并給予ATCC指定保藏號(hào)PTA-11970。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑包含抗體89M5、基本上由抗體89M5組成或由抗體89M5組成。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑包含抗體h89M5-H2L2、基本上由抗體h89M5-H2L2組成或由抗體h89M5-H2L2組成。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑包含130M23抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑包含130M23抗體(帶有或不帶有前導(dǎo)序列)的重鏈和輕鏈。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑是130M23抗體。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑包含處于130M23抗體的人源化形式的130M23抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑包含h130M23-H1L2抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑包含h130M23-H1L6抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑包含處于130M23抗體的人源化形式的130M23抗體(帶有或不帶有前導(dǎo)序列)的重鏈和輕鏈。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑包含h130M23-H1L2抗體(帶有或不帶有前導(dǎo)序列)的重鏈和輕鏈。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑包含h130M23-H1L6抗體(帶有或不帶有前導(dǎo)序列)的重鏈和輕鏈。在一些實(shí)施方式中，130M23的人源化版本是IgG1抗體。在一些實(shí)施方式中，130M23的人源化版本是IgG2抗體。將產(chǎn)生130M23抗體的雜交瘤細(xì)胞系于2011年8月10日在布達(dá)佩斯條約的條件下保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801UniversityBoulevard,Manassas,VA,美國(guó))并給予ATCC指定保藏號(hào)PTA-12021。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑包含抗體130M23、基本上由抗體130M23組成或由抗體130M23組成。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑包含抗體h130M23-H1L2、基本上由抗體h130M23-H1L2組成或由抗體h130M23-H1L2組成。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑包含抗體h130M23-H1L6、基本上由抗體h130M23-H1L6組成或由抗體h130M23-H1L6組成。包括抗體在內(nèi)的許多蛋白質(zhì)含有指導(dǎo)蛋白質(zhì)運(yùn)輸至各種位置的信號(hào)序列。信號(hào)序列(也稱為信號(hào)肽或前導(dǎo)序列)位于初生多肽的N末端。他們將多肽靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并且通過(guò)分泌將蛋白質(zhì)分發(fā)至其目的地，例如到細(xì)胞器的內(nèi)部空間、到內(nèi)部膜、到細(xì)胞外膜或到細(xì)胞內(nèi)部。在蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)后，信號(hào)肽酶將大多數(shù)信號(hào)序列從所述蛋白質(zhì)切割下。從所述多肽切割下信號(hào)序列通常在氨基酸序列中的特定位置發(fā)生，并且依賴于信號(hào)序列內(nèi)的氨基酸殘基。雖然通常存在一個(gè)特異性切割位點(diǎn)，信號(hào)肽酶可以識(shí)別和/或可以使用超過(guò)一個(gè)切割位點(diǎn)，產(chǎn)生所述多肽的非同源N末端。例如，信號(hào)序列內(nèi)的不同切割位點(diǎn)的使用可以產(chǎn)生表達(dá)有不同N末端氨基酸的多肽。因此，在一些實(shí)施方式中，本文描述的多肽可以包含具有不同N末端的多肽的混合物。在一些實(shí)施方式中，N末端的差異在于1、2、3、4或5個(gè)長(zhǎng)度的氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述多肽基本上是同源的，即多肽具有相同的N末端。在一些實(shí)施方式中，與“天然”或“親本”信號(hào)序列相比，所述多肽的信號(hào)序列包含一個(gè)以上(例如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)等)氨基酸取代和/或缺失。在一些實(shí)施方式中，所述多肽的信號(hào)序列包含使一個(gè)切割位點(diǎn)占優(yōu)勢(shì)的氨基酸取代和/或缺失，由此產(chǎn)生具有一種N末端的基本上同源的多肽。在一些實(shí)施方式中，所述多肽的信號(hào)序列被不同的信號(hào)序列替換。在一些實(shí)施方式中，所述多肽的信號(hào)序列影響所述多肽的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方式中，所述多肽的信號(hào)序列增加所述多肽的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方式中，所述多肽的信號(hào)序列降低所述多肽的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗體)與含有包含SEQIDNO:10的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:11的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)與RSPO1的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗體)與含有包含SEQIDNO:55的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:59的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)與RSPO1的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗體)與含有包含SEQIDNO:25的重鏈和包含SEQIDNO:26的輕鏈的抗體競(jìng)爭(zhēng)與RSPO1的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗體)與含有包含SEQIDNO:68的重鏈和包含SEQIDNO:69的輕鏈的抗體競(jìng)爭(zhēng)與RSPO1的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑與抗體89M5或h89M5-H2L2競(jìng)爭(zhēng)與人RSPO1的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，在體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢驗(yàn)中，RSPO1-結(jié)合劑或抗體競(jìng)爭(zhēng)與RSPO1的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1是人RSPO1。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1是小鼠RSPO1。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗體)與本發(fā)明的抗體結(jié)合的RSPO1上的表位相同，或結(jié)合的RSPO1上的表位基本上相同。在另一實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑是這樣的抗體：其結(jié)合的RSPO1上的表位與本發(fā)明的抗體結(jié)合的RSPO1上的表位重疊。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗體)與抗體89M5或h89M5-H2L2結(jié)合RSPO1上的表位相同，或結(jié)合RSPO1上的表位基本上相同。在另一實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑是這樣的抗體：其所結(jié)合的RSPO1上的表位與本發(fā)明的89M5或h89M5-H2L2結(jié)合的RSPO1上的表位重疊。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是與ATCC指定保藏號(hào)為PTA-11970的雜交瘤產(chǎn)生的抗體(例如，在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢驗(yàn)中)競(jìng)爭(zhēng)與RSPO1的特異性結(jié)合的試劑。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗體)與含有包含SEQIDNO:27的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:28的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)與RSPO2的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗體)與含有包含SEQIDNO:63的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:67或SEQIDNO:76的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)與RSPO2的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗體)與含有包含SEQIDNO:41的重鏈和包含SEQIDNO:42的輕鏈的抗體競(jìng)爭(zhēng)與RSPO2的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗體)與含有包含SEQIDNO:70的重鏈和包含SEQIDNO:71或SEQIDNO:74的輕鏈的抗體競(jìng)爭(zhēng)與RSPO2的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑與抗體130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6競(jìng)爭(zhēng)與人RSPO2的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，在體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢驗(yàn)中，RSPO2-結(jié)合劑或抗體競(jìng)爭(zhēng)與RSPO2的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2是人RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2是小鼠RSPO2。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗體)與本發(fā)明的抗體結(jié)合的RSPO2上的表位相同，或結(jié)合的RSPO2上的表位基本上相同。在另一實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑是這樣的抗體：其所結(jié)合的RSPO2上的表位與本發(fā)明的抗體結(jié)合的RSPO2上的表位重疊。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗體)與抗體130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6結(jié)合的RSPO2上的表位相同，或結(jié)合RSPO2上的表位基本上相同。在另一實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑是這樣的抗體：其所結(jié)合的RSPO2上的表位與本發(fā)明的130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6結(jié)合的RSPO2上的表位重疊。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是與ATCC指定保藏號(hào)為PTA-12021的雜交瘤產(chǎn)生的抗體(例如，在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢驗(yàn)中)競(jìng)爭(zhēng)與RSPO2的特異性結(jié)合的試劑。在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)結(jié)合至少一種人RSPO蛋白和調(diào)節(jié)RSPO活性。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO拮抗劑，并降低RSPO活性。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO拮抗劑，并降低β-連環(huán)素活性。在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗體)結(jié)合人RSPO1，并調(diào)節(jié)RSPO1活性。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑是RSPO1拮抗劑，并降低RSPO1活性。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑是RSPO1拮抗劑，并降低β-連環(huán)素活性。在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗體)結(jié)合人RSPO2，并調(diào)節(jié)RSPO2活性。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑是RSPO2拮抗劑，并降低RSPO2活性。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑是RSPO2拮抗劑，并降低β-連環(huán)素活性。在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSPO3-結(jié)合劑(例如，抗體)結(jié)合人RSPO3，并調(diào)節(jié)RSPO3活性。在一些實(shí)施方式中，RSPO3-結(jié)合劑是RSPO3拮抗劑，并降低RSPO3活性。在一些實(shí)施方式中，RSPO3-結(jié)合劑是RSPO3拮抗劑，并降低β-連環(huán)素活性。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)是至少一種人RSPO蛋白的拮抗劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是至少一種RSPO的拮抗劑，并且抑制RSPO活性。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑抑制RSPO活性的至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或約100％。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑抑制一種、兩種、三種或四種RSPO蛋白的活性。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑抑制人RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的活性。在一些實(shí)施方式中，抑制人RSPO1活性的RSPO1-結(jié)合劑是抗體89M5或h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，抑制人RSPO2活性的RSPO2-結(jié)合劑是抗體130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)是至少一種人RSPO蛋白的拮抗劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑抑制RSPO信號(hào)傳導(dǎo)的至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或約100％。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑抑制一種、兩種、三種或四種RSPO蛋白的信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑抑制人RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，抑制RSPO1信號(hào)傳導(dǎo)的RSPO1-結(jié)合劑是抗體89M5或h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，抑制RSPO2信號(hào)傳導(dǎo)的RSPO2-結(jié)合劑是抗體130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)是β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或約100％。在一些實(shí)施方式中，抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的RSPO1-結(jié)合劑是抗體89M5或h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的RSPO2-結(jié)合劑是抗體130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)抑制至少一種RSPO蛋白與受體的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑抑制人RSPO蛋白與一種或多種其受體的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑抑制RSPO蛋白與至少一種LGR蛋白的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑抑制RSPO蛋白與LGR4、LGR5和/或LGR6的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑抑制RSPO1與LGR4的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑抑制RSPO1與LGR5的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑抑制RSPO1與LGR6的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑抑制RSPO2與LGR4的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑抑制RSPO2與LGR5的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑抑制RSPO2與LGR6的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑與至少一種LGR蛋白的結(jié)合被抑制至少約10％、至少約25％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或至少約95％。在一些實(shí)施方式中，抑制至少一種RSPO與至少一種LGR蛋白的結(jié)合的RSPO-結(jié)合劑還抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，抑制人RSPO1與至少一種LGR蛋白的結(jié)合的RSPO1-結(jié)合劑是抗體89M5或h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，抑制人RSPO2與至少一種LGR蛋白的結(jié)合的RSPO2-結(jié)合劑是抗體130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)阻斷至少一種RSPO與受體的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑阻斷人RSPO蛋白與一種或多種其受體的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑阻斷RSPO與至少一種LGR蛋白的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑阻斷至少一種RSPO蛋白與LGR4、LGR5和/或LGR6的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑阻斷RSPO1與LGR4的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑阻斷RSPO1與LGR5的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO1-結(jié)合劑阻斷RSPO1與LGR6的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑阻斷RSPO2與LGR4的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑阻斷RSPO2與LGR5的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO2-結(jié)合劑阻斷RSPO2與LGR6的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑與至少一種LGR蛋白的結(jié)合被阻斷至少約10％、至少約25％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或至少約95％。在一些實(shí)施方式中，阻斷至少一種RSPO蛋白與至少一種LGR蛋白的結(jié)合的RSPO-結(jié)合劑還抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，阻斷人RSPO1與至少一種LGR蛋白的結(jié)合的RSPO1-結(jié)合劑是抗體89M5或h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，阻斷人RSPO2與至少一種LGR蛋白的結(jié)合的RSPO2-結(jié)合劑是抗體130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。應(yīng)該理解的是，抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的RSPO-結(jié)合劑可以在一些實(shí)施方式中抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的一種或多種受體導(dǎo)致的信號(hào)傳導(dǎo)，但并非必須抑制所有受體導(dǎo)致的信號(hào)傳導(dǎo)。在一些替代實(shí)施方式中，可以抑制所有人受體導(dǎo)致的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，抑制了選自由LGR4、LGR5和LGR6組成的組中的一種或多種受體導(dǎo)致的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑對(duì)β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的抑制使β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的水平減少至少約10％、至少約25％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或至少約95％。在一些實(shí)施方式中，抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的RSPO1-結(jié)合劑是抗體89M5或h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的RSPO2-結(jié)合劑是抗體130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)抑制β-連環(huán)素的激活。應(yīng)該理解的是，抑制β-連環(huán)素的激活的RSPO-結(jié)合劑可以在一些實(shí)施方式中抑制一種或多種受體導(dǎo)致的β-連環(huán)素的激活，但并非必須抑制所有受體導(dǎo)致的β-連環(huán)素的激活。在一些替代實(shí)施方式中，可以抑制所有人受體導(dǎo)致的β-連環(huán)素的激活。在一些實(shí)施方式中，抑制了選自由LGR4、LGR5和LGR6組成的組中的一種或多種受體導(dǎo)致的β-連環(huán)素的激活。在一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑對(duì)β-連環(huán)素的激活的抑制使β-連環(huán)素的激活的水平減少至少約10％、至少約25％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或至少約95％。在一些實(shí)施方式中，抑制β-連環(huán)素的激活的RSPO1-結(jié)合劑是抗體89M5或h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，抑制β-連環(huán)素的激活的RSPO2-結(jié)合劑是抗體130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。用于確定RSPO-結(jié)合劑(或候選RSPO-結(jié)合劑)是否抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的體內(nèi)和體外檢驗(yàn)是本領(lǐng)域已知的。例如，可以使用基于細(xì)胞的熒光素酶報(bào)告基因檢驗(yàn)來(lái)在體外測(cè)定β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)水平，所述熒光素酶報(bào)告基因檢驗(yàn)利用含有多個(gè)拷貝的位于果蠅熒光素酶報(bào)告基因的TCF結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Gazit等,1999,Oncogene,18；5959-66；TOPflash,Millipore,BillericaMA)。在具有或不具有RSPO蛋白或RSPO條件培養(yǎng)基的一種或多種Wnt(例如，由轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的Wnt或由Wnt條件培養(yǎng)基提供的Wnt)的存在下，將在RSPO-結(jié)合劑的存在下的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的水平與不存在RSPO-結(jié)合劑下的信號(hào)傳導(dǎo)水平進(jìn)行比較。除了TCF/Lu報(bào)告基因檢驗(yàn)之外，RSPO-結(jié)合劑(或候選劑)對(duì)β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的作用可以通過(guò)測(cè)定所述試劑對(duì)β-連環(huán)素-調(diào)節(jié)基因(例如c-myc(He等,1998,Science,281:1509-12)、周期蛋白D1(Tetsu等,1999,Nature,398:422-6)和/或纖連蛋白(Gradl等，1999,Mol.CellBiol.,19:5576-87))的作用而在體外或在體內(nèi)測(cè)定。在一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑對(duì)β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的作用還可以通過(guò)測(cè)定所述試劑對(duì)Dishevelled-1、Dishevelled-2、Dishevelled-3、LRP5、LRP6和/或β-連環(huán)素的磷酸化狀態(tài)的影響而測(cè)定。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑具有以下效應(yīng)中的一種或多種：抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤生長(zhǎng)、減少腫瘤的致瘤性、通過(guò)減少癌干細(xì)胞在腫瘤中的頻率而減少腫瘤的致瘤性、抑制腫瘤生長(zhǎng)、觸發(fā)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡、誘導(dǎo)腫瘤中的細(xì)胞進(jìn)行分化、使致瘤性細(xì)胞分化成非致瘤性狀態(tài)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的分化標(biāo)記物的表達(dá)、防止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移或降低腫瘤細(xì)胞的存活。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑能夠抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)(例如，在異種移植物小鼠模型中和/或在具有癌的人中)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑能夠減少腫瘤的致瘤性。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑或抗體能夠在諸如小鼠異種移植物模型等動(dòng)物模型中減少包含癌干細(xì)胞的腫瘤的致瘤性。在一些實(shí)施方式中，腫瘤中癌干細(xì)胞的數(shù)量或頻率降低了至少約兩倍、約三倍、約五倍、約十倍、約50倍、約100倍或約1000倍。在一些實(shí)施方式中，癌干細(xì)胞的數(shù)量或頻率的減少通過(guò)使用動(dòng)物模型的有限稀釋檢驗(yàn)來(lái)確定。關(guān)于使用有限稀釋檢驗(yàn)來(lái)確定腫瘤中的癌干細(xì)胞數(shù)量或頻率的減少的另外實(shí)驗(yàn)和指南可見(jiàn)例如在國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO2008/042236、美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2008/0064049和美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2008/0178305。在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSPO-結(jié)合劑在小鼠、食蟹猴或人中所具有的循環(huán)半衰期為至少約5小時(shí)、至少約10小時(shí)、至少約24小時(shí)、至少約3天、至少約1周或至少約2周。在一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑是IgG(例如，IgG1或IgG2)抗體，其在小鼠、食蟹猴或人中所具有的循環(huán)半衰期為至少約5小時(shí)、至少約10小時(shí)、至少約24小時(shí)、至少約3天、至少約1周或至少約2周。增加(或減少)諸如多肽和抗體等試劑的半衰期的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，增加IgG抗體的循環(huán)半衰期的已知方法包括在Fc區(qū)引入突變，所述突變?cè)黾釉趐H6.0的所述抗體與初生Fc受體(FcRn)的pH依賴性結(jié)合(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2005/0276799、2007/0148164和2007/0122403)。增加缺乏所述Fc區(qū)的抗體片段的循環(huán)半衰期的已知方法包括諸如PEG化等技術(shù)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是多克隆抗體?？梢酝ㄟ^(guò)任何已知方法制備多克隆抗體。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)對(duì)動(dòng)物(例如，兔、大鼠、小鼠、山羊、驢)多次皮下或腹膜內(nèi)注射相關(guān)抗原(例如純化的肽片段、全長(zhǎng)重組蛋白或融合蛋白)而使其免疫來(lái)產(chǎn)生多克隆抗體。所述抗原可以可選地綴合至載劑，例如鑰孔蟲(chóng)戚血蘭素(KLH)或血清白蛋白。將所述抗原(使用或不使用載劑蛋白)稀釋在無(wú)菌鹽水中并通常與佐劑(例如，完全或不完全弗氏佐劑)組合以形成穩(wěn)定的乳液。一段足夠時(shí)間后，從經(jīng)免疫動(dòng)物的血液和腹水回收多克隆抗體。多克隆抗體可以根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法(包括但不限于親和色譜、離子交換色譜、凝膠電泳和透析)從血清或腹水純化。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是單克隆抗體。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的雜交瘤方法制備單克隆抗體(參見(jiàn)例如，Kohler和Milstein,1975,Nature,256:495-497)。在一些實(shí)施方式中，使用雜交瘤方法，如上所述對(duì)小鼠、倉(cāng)鼠或其他合適的宿主動(dòng)物進(jìn)行免疫，以引發(fā)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生會(huì)特異性結(jié)合免疫抗原的抗體。在一些實(shí)施方式中，可以在體外對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫。在一些實(shí)施方式中，免疫抗原可以是人蛋白或其一部分。在一些實(shí)施方式中，免疫抗原可以是小鼠蛋白或其一部分。免疫后，將淋巴細(xì)胞分離并使用例如聚乙二醇與合適的骨髓瘤細(xì)胞系融合，從而形成雜交瘤細(xì)胞，所述雜交瘤細(xì)胞然后可以從未融合的淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞中選出。產(chǎn)生特異性針對(duì)所選擇抗原的單克隆抗體的雜交瘤可以通過(guò)各種方法鑒定，所述方法包括但不限于免疫沉淀、免疫印跡和體外結(jié)合檢驗(yàn)(例如，流式細(xì)胞儀、FACS、ELISA和放射性免疫檢驗(yàn))。雜交瘤可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法在體外培養(yǎng)物中繁殖(J.W.Goding,1996,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,第3版,AcademicPress,SanDiego,CA)或作為作為動(dòng)物中的腹水腫瘤在體內(nèi)繁殖。單克隆抗體可以根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法從培養(yǎng)基或腹水純化，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括但不限于親和色譜、離子交換色譜、凝膠電泳和透析。在一些實(shí)施方式中，單克隆抗體可以使用對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言已知的重組DNA技術(shù)制備(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,567)。例如通過(guò)使用特異性擴(kuò)增編碼所述抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸引物，從成熟的B細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞分離編碼單克隆抗體的多核苷酸。然后將編碼重鏈和輕鏈的分離多核苷酸克隆至合適的表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體在轉(zhuǎn)染至諸如不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的大腸桿菌、類(lèi)人猿COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞等宿主細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生單克隆抗體。在其他實(shí)施方式中，重組單克隆抗體或其片段可以從表達(dá)所需要物種的CDR的噬菌體展示文庫(kù)中分離(參見(jiàn)例如,McCafferty等,1990,Nature,348:552-554；Clackson等,1991,Nature,352:624-628；和Marks等,1991,J.Mol.Biol.,222:581-597)。編碼單克隆抗體的多核苷酸可以進(jìn)而使用重組DNA技術(shù)以許多不同方式進(jìn)行修飾，從而產(chǎn)生替代性抗體。在一些實(shí)施方式中，例如小鼠單克隆抗體的輕鏈和重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域可以被例如人抗體的相應(yīng)區(qū)域取代從而產(chǎn)生嵌合抗體，或被非免疫球蛋白多肽取代從而產(chǎn)生融合抗體。在一些實(shí)施方式中，將恒定區(qū)截短或除去從而產(chǎn)生單克隆抗體的所需抗體片段。可以使用可變區(qū)的定點(diǎn)或高密度誘變來(lái)優(yōu)化單克隆抗體的特異性、親和性等。在一些實(shí)施方式中，針對(duì)人RSPO蛋白的單克隆抗體是人源化抗體。通常而言，人源化抗體是其中使用對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言已知的方法使來(lái)自CDR的殘基被具有所需特異性、親和性和/或結(jié)合能力的非人物種(例如小鼠、兔、大鼠、倉(cāng)鼠等)的CDR的殘基替換的人免疫球蛋白。在一些實(shí)施方式中，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)殘基被來(lái)自具有所需特異性、親和性和/或結(jié)合能力的非人物種的抗體中的相應(yīng)殘基替換。在一些實(shí)施方式中，人源化抗體可以通過(guò)Fv框架區(qū)中和/或所替換的非人殘基中的另外殘基的取代而被進(jìn)一步修飾，從而改善和優(yōu)化抗體特異性、親和性和/或能力。通常，人源化抗體會(huì)包含至少一個(gè)、通常2個(gè)或3個(gè)含有所有或基本上所有對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR的可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域，而所有或基本上所有的框架區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的框架區(qū)。在一些實(shí)施方式中，人源化抗體還可以包括免疫球蛋白恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域(Fc)的至少一部分。在一些實(shí)施方式中，治療上使用此類(lèi)人源化抗體，因?yàn)樗麄冊(cè)谑┯弥寥耸茉噷?duì)象時(shí)可以減少抗原性和HAMA(人抗小鼠抗體)響應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠按照已知技術(shù)獲得具有減少的免疫原性的功能性人源化抗體(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,225,539、5,585,089、5,693,761和5,693,762)在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是人抗體。人抗體可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)直接制備。在一些實(shí)施方式中，可以產(chǎn)生體外固定或分離自產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的抗體的免疫個(gè)體的永生化人B淋巴細(xì)胞(參見(jiàn)例如,Cole等,1985,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,第77頁(yè)；Boemer等,1991,J.Immunol.,147:86-95；和美國(guó)專(zhuān)利第5,750,373、5,567,610和5,229,275號(hào))。在一些實(shí)施方式中，所述人抗體可以從噬菌體文庫(kù)中選擇，其中該噬菌體文庫(kù)表達(dá)人抗體(Vaughan等,1996,NatureBiotechnology,14:309-314；Sheets等,1998,PNAS,95:6157-6162；Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.,227:381；Marks等,1991,J.Mol.Biol.,222:581)。作為選擇，可以使用噬菌體展示技術(shù)來(lái)從來(lái)自未經(jīng)免疫的供體的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域庫(kù)中在體外生產(chǎn)人抗體和抗體片段。用于產(chǎn)生和利用抗體噬菌體文庫(kù)的技術(shù)還描述于美國(guó)專(zhuān)利第5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484和7,264,963號(hào)以及Rothe等,2008,J.Mol.Bio.,376:1182-1200中。包括但不限于鏈重排(Marks等,1992,Bio/Technology,10:779-783)和定點(diǎn)誘變?cè)趦?nèi)的親和性成熟策略是本領(lǐng)域已知的，并且可以用于產(chǎn)生高親和性人抗體。在一些實(shí)施方式中，可以在含有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠中制備人抗體。這些小鼠在免疫后能夠在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生的情況下生產(chǎn)全部庫(kù)(repertoire)的人抗體。該方法還見(jiàn)述于美國(guó)專(zhuān)利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016號(hào)。本發(fā)明還涉及特異性識(shí)別至少一種人RSPO蛋白的雙特異性抗體。雙特異性抗體能夠特異性識(shí)別和結(jié)合至少兩種不同的表位。不同的表位可以位于同一分子內(nèi)(例如人RSPO1上的兩個(gè)表位)或在不同分子上(例如RSPO1上的一個(gè)表位和RSPO2上的一個(gè)表位)。在一些實(shí)施方式中，所述雙特異性抗體是單克隆人抗體或人源化抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體能夠特異性識(shí)別和結(jié)合第一抗原靶標(biāo)(例如RSPO1)以及第二抗原靶標(biāo)(例如白細(xì)胞上的效應(yīng)分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7)或Fc受體(例如，CD64、CD32或CD16))，從而將細(xì)胞防御機(jī)制聚焦于表達(dá)所述第一抗原靶標(biāo)的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述抗體可用于將細(xì)胞毒性劑導(dǎo)向表達(dá)特定靶抗原的細(xì)胞。這些抗體擁有抗原結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒性劑或放射性同位素螯合劑(例如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的臂。在一些實(shí)施方式中，所述雙特異性抗體特異性結(jié)合RSPO1以及選自由RSPO2、RSPO3和RSPO4組成的組中的另外RSPO蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述雙特異性抗體特異性結(jié)合RSPO2以及選自由RSPO1、RSPO3和RSPO4組成的組中的另外RSPO蛋白。用于制造雙特異性抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，參見(jiàn)例如Millstein等,1983,Nature,305:537-539；Brennan等,1985,Science,229:81；Suresh等,1986,MethodsinEnzymol.,121:120；Traunecker等,1991,EMBOJ.,10:3655-3659；Shalaby等,1992,J.Exp.Med.,175:217-225；Kostelny等,1992,J.Immunol.,148:1547-1553；Gruber等,1994,J.Immunol.,152:5368；美國(guó)專(zhuān)利第5,731,168號(hào)；和美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第2011/0123532號(hào)。雙特異性抗體可以是完整抗體或抗體片段。還設(shè)計(jì)了具有超過(guò)兩價(jià)的抗體。例如，可以制備三特異性抗體(Tutt等,1991,J.Immunol.,147:60)。因此，在一些實(shí)施方式中針對(duì)RSPO1的抗體是多特異性的。在一些實(shí)施方式中，本文描述的抗體(或其他多肽)可以是單特異性的。例如，在一些實(shí)施方式中，抗體含有的一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)中的每個(gè)都能夠結(jié)合(或結(jié)合)RSPO蛋白上的同源性表位。在一些實(shí)施方式中，本文描述的單特異性抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠結(jié)合(或結(jié)合)例如RSPO1和RSPO2(即，在RSPO1和RSPO2蛋白上都發(fā)現(xiàn)相同的表位)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗體片段?？贵w片段與完整抗體相比可以具有不同的功能或能力，例如抗體片段可以具有增加的腫瘤滲透。已知各種技術(shù)可用于生產(chǎn)抗體片段，包括但不限于完整抗體的蛋白水解消化。在一些實(shí)施方式中，抗體片段包括通過(guò)對(duì)抗體分子進(jìn)行胃蛋白酶消化而產(chǎn)生的F(ab')2片段。在一些實(shí)施方式中，抗體片段包括通過(guò)還原F(ab')2片段的二硫鍵而生成的Fab片段。在其他實(shí)施方式中，抗體片段包括通過(guò)用木瓜蛋白酶和還原劑對(duì)抗體分子處理而生成的Fab片段。在一些實(shí)施方式中，抗體片段以重組方式產(chǎn)生。在一些實(shí)施方式中，抗體片段包括Fv或單鏈Fv(scFv)片段。Fab、Fv和scFv抗體片段可以在大腸桿菌或其他宿主細(xì)胞中表達(dá)并從其分泌，從而允許大量地產(chǎn)生這些片段。在一些實(shí)施方式中，抗體片段分離自本文討論的抗體噬菌體文庫(kù)。例如，可以使用構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)的方法(Huse等,1989,Science,246:1275-1281)來(lái)允許快速有效地鑒定具有針對(duì)RSPO蛋白或其衍生物、片段、類(lèi)似物或同源物的所需特異性的單克隆Fab片段。在一些實(shí)施方式中，抗體片段是線性抗體片段。在一些實(shí)施方式中，抗體片段為單特異性或雙特異性的。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是scFv。可以使用各種技術(shù)來(lái)產(chǎn)生對(duì)一種或多種人RSPO具有特異性的單鏈抗體(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,946,778)。此外，特別是在抗體片段的情況下，理想的是抗體進(jìn)行修飾從而增加其血清半衰期。這可以例如通過(guò)利用在抗體片段的合適區(qū)域進(jìn)行突變將挽救受體結(jié)合表位引入至抗體片段中或者通過(guò)將所述表位引入肽標(biāo)記內(nèi)(所述肽標(biāo)記然后融合至抗體片段的末端或中部)(例如通過(guò)DNA或肽合成)而實(shí)現(xiàn)。異源綴合抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。異源綴合抗體由兩個(gè)共價(jià)連接的抗體組成。提出此類(lèi)抗體以例如將免疫細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,676,980)。還設(shè)想可以使用在合成蛋白化學(xué)中已知的方法(包括涉及交聯(lián)劑的那些方法)在體外制備異源綴合抗體。例如，可以使用二硫鍵交換反應(yīng)或通過(guò)形成硫醚鍵而構(gòu)建免疫毒素。用于該目的的合適試劑的實(shí)例包括亞氨基硫醇鹽和4-巰基丁亞氨酸甲酯。為了本發(fā)明的目的，應(yīng)該意識(shí)到的是，經(jīng)修飾抗體可以包含提供所述抗體與靶標(biāo)(即，人RSPO1或人RSPO2)的連接的任何類(lèi)型的可變區(qū)。在這點(diǎn)上，所述可變區(qū)可以包含或衍生自可以誘導(dǎo)增強(qiáng)體液響應(yīng)和產(chǎn)生針對(duì)所需腫瘤相關(guān)抗原的免疫球蛋白的任何種類(lèi)的哺乳動(dòng)物。因此，經(jīng)修飾抗體的可變區(qū)可以例如來(lái)自人、鼠類(lèi)、非人靈長(zhǎng)類(lèi)(例如食蟹猴、獼猴等)或大鼠來(lái)源。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)修飾抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)都是人的。在其他實(shí)施方式中，可以對(duì)相容性抗體(通常源自非人來(lái)源)的可變區(qū)進(jìn)行工程化設(shè)計(jì)或特意定制，從而改善所述分子的結(jié)合性質(zhì)或減少所述分子的免疫原性。就此而言，用于本發(fā)明的可變區(qū)可以是人源化的，或者通過(guò)包含進(jìn)引入的氨基酸序列而得到改變。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)至少部分地替換一個(gè)或多個(gè)CDR以及必要時(shí)部分地替換框架區(qū)和序列修飾和/或改變而對(duì)重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域進(jìn)行改變。雖然所述CDR可以源自與框架區(qū)所源自的抗體相同類(lèi)別或亞類(lèi)別的抗體，設(shè)想的是CDR源自不同類(lèi)別的抗體，優(yōu)選源自不同物種的抗體。為了將一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合能力轉(zhuǎn)移至另一個(gè)，不必將所有CDR用來(lái)自供體可變區(qū)的所有CDR替換。相反，可以僅需要轉(zhuǎn)移對(duì)于維持抗原結(jié)合位點(diǎn)的活性而言必須的那些殘基?？紤]到美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,585,089、5,693,761和5,693,762中提出的解釋?zhuān)ㄟ^(guò)實(shí)施常規(guī)實(shí)驗(yàn)或通過(guò)試錯(cuò)法測(cè)試而獲得具有減少的免疫原性的功能抗體完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力之內(nèi)。盡管可以對(duì)可變區(qū)進(jìn)行改變，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到本發(fā)明的經(jīng)修飾抗體會(huì)包括其中一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的至少一部分已經(jīng)缺失或改變，以便提供諸如增加的腫瘤定位或增加的血清半衰期(當(dāng)與包含天然或未改變的恒定區(qū)的大致相同的免疫原性的抗體相比時(shí))等所需生化特性的抗體。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)修飾抗體的恒定區(qū)會(huì)包含人恒定區(qū)。與本發(fā)明相容的對(duì)恒定區(qū)進(jìn)行的修飾包括添加、缺失或取代一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。本文公開(kāi)的經(jīng)修飾抗體可以包含對(duì)三個(gè)重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2或CH3)中的一個(gè)或多個(gè)和/或?qū)p鏈恒定區(qū)(CL)進(jìn)行改變或修飾。在一些實(shí)施方式中，使一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域從經(jīng)修飾抗體的恒定區(qū)部分或完全缺失。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)修飾抗體會(huì)包含其中整個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被除去的結(jié)構(gòu)域缺失的構(gòu)建體或變體(ΔCH2構(gòu)建體)。在一些實(shí)施方式中，省去的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域被短氨基酸間隔子(例如10個(gè)氨基酸殘基)替換，該氨基酸間隔子提供部分的通常由缺失恒定區(qū)所賦予的分子柔性。在一些實(shí)施方式中，對(duì)經(jīng)修飾抗體進(jìn)行工程化設(shè)計(jì)以將CH3結(jié)構(gòu)域直接融合至抗體的鉸鏈區(qū)。在其他實(shí)施方式中，在鉸鏈區(qū)和經(jīng)修飾CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域之間插入肽間隔子。例如，可以表達(dá)這樣的構(gòu)建體：其中CH2結(jié)構(gòu)域已經(jīng)缺失，并且殘留的CH3結(jié)構(gòu)域(經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾)利用5～20個(gè)氨基酸的間隔子連接至鉸鏈區(qū)?？梢蕴砑哟祟?lèi)間隔子以確保構(gòu)建體結(jié)構(gòu)域的調(diào)節(jié)元件保持游離和可及，或確保鉸鏈區(qū)保持柔性。但是，應(yīng)該注意的是在某些情況下，氨基酸間隔子可能會(huì)被證實(shí)具有免疫原性，并且引發(fā)不想要的針對(duì)構(gòu)建體的免疫響應(yīng)。因此，在一些實(shí)施方式中，添加至構(gòu)建體的任何間隔子相對(duì)地是不具有免疫原性的，以維持經(jīng)修飾抗體的所需生物品質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)修飾抗體可以僅具有恒定結(jié)構(gòu)域的部分缺失，或僅取代少量或一個(gè)氨基酸。例如，CH2結(jié)構(gòu)域的選定區(qū)域中單個(gè)氨基酸的取代可能足以實(shí)質(zhì)上減少Fc結(jié)合，并由此增加癌細(xì)胞定位和/或腫瘤滲透。類(lèi)似地，可能理想的是僅使一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的一部分缺失，所述部分控制特定效應(yīng)子功能(例如補(bǔ)體C1q結(jié)合)受到調(diào)節(jié)。恒定區(qū)的這種部分缺失可以改善抗體的選定特性(血清半衰期)同時(shí)使與受試對(duì)象恒定區(qū)相關(guān)的其他所需功能保持完整。另外，如上所述，通過(guò)使一個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行可增強(qiáng)所產(chǎn)生構(gòu)建體的特征的突變或取代，可以對(duì)本發(fā)明公開(kāi)的抗體的恒定區(qū)進(jìn)行修飾。就此而言，有可能的是，干擾保守性結(jié)合位點(diǎn)(例如，F(xiàn)c結(jié)合)的活性而同時(shí)基本上保持經(jīng)修飾抗體的構(gòu)象和免疫原性特征。在一些實(shí)施方式中，經(jīng)修飾抗體包含添加至恒定區(qū)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，以便增強(qiáng)所需特性，例如減少或增加效應(yīng)子功能或提供更多的細(xì)胞毒素或碳水化合物連接位點(diǎn)。本領(lǐng)域已知恒定區(qū)介導(dǎo)數(shù)種效應(yīng)子功能。例如，補(bǔ)體的C1組分與IgG或IgM抗體的Fc區(qū)的結(jié)合(結(jié)合至抗原)激活補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體激活在細(xì)胞病原體的調(diào)理素化和裂解中是重要的。補(bǔ)體激活還刺激炎性響應(yīng)，并且還可與自體免疫超敏性有關(guān)。此外，抗體的Fc區(qū)可以結(jié)合表達(dá)Fc受體(FcR)的細(xì)胞。存在許多對(duì)不同類(lèi)別的抗體具有特異性的Fc受體，包括IgG(γ受體)、IgE(ε受體)、IgA(α受體)和IgM(μ受體)?？贵w與細(xì)胞表面上的Fc受體的結(jié)合觸發(fā)許多重要的各種各樣的生物響應(yīng)，包括包被有抗體的顆粒的吞噬和破壞、免疫復(fù)合物的清除、包被有抗體的靶細(xì)胞被殺死細(xì)胞(稱為抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性或ADCC)裂解、釋放炎性介體、胎盤(pán)轉(zhuǎn)移和控制免疫球蛋白產(chǎn)生。在一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合抗體提供改變的效應(yīng)子功能，后者轉(zhuǎn)而影響所施用抗體的生物特性。例如，在一些實(shí)施方式中，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的缺失或失活(通過(guò)點(diǎn)突變或其他手段)可以減少循環(huán)的經(jīng)修飾抗體(例如抗-RSPO1抗體)的Fc受體結(jié)合，由此增加癌細(xì)胞定位和/或腫瘤滲透。在其他實(shí)施方式中，恒定區(qū)修飾增加或減少所述抗體的血清半衰期。在一些實(shí)施方式中，對(duì)恒定區(qū)進(jìn)行修飾以消除二硫鍵或寡糖部分。根據(jù)本發(fā)明的對(duì)恒定區(qū)進(jìn)行的修飾可以容易地使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知識(shí)內(nèi)公知的生物化學(xué)或分子工程化設(shè)計(jì)技術(shù)來(lái)進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，作為抗體的RSPO-結(jié)合劑不具有一種或多種效應(yīng)子功能。例如，在一些實(shí)施方式中，所述抗體不具有ADCC活性，和/或不具有補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性。在一些實(shí)施方式中，所述抗體不結(jié)合Fc受體和/或補(bǔ)體因子。在一些實(shí)施方式中，所述抗體不具有效應(yīng)子功能。本發(fā)明還包括與本文提出的嵌合、人源化和人抗體或其抗體片段基本上同源的變體和等效物。這些可以含有例如保守性取代突變，即一個(gè)或多個(gè)氨基酸被類(lèi)似的氨基酸取代。例如，保守性取代是指氨基酸被相同通用類(lèi)別內(nèi)的另一氨基酸取代，例如一個(gè)酸性氨基酸被另一酸性氨基酸取代，一個(gè)堿性氨基酸被另一堿性氨基酸取代，或一個(gè)中性氨基酸被另一中性氨基酸取代。保守性氨基酸取代的含義是本領(lǐng)域公知的，并且如本文中所述。因此，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)結(jié)合至少一種RSPO蛋白的抗體的方法。在一些實(shí)施方式中，用于生產(chǎn)結(jié)合至少一種RSPO蛋白的抗體的方法包括使用雜交瘤技術(shù)。在一些實(shí)施方式中，提供用于生產(chǎn)結(jié)合人RSPO1的抗體的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括使用人RSPO1的31～263位氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括使用SEQIDNO:1的31～263位氨基酸。在一些實(shí)施方式中，提供用于生產(chǎn)結(jié)合人RSPO2的抗體的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括使用人RSPO2的22～205位氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括使用SEQIDNO:2的22～205位氨基酸。在一些實(shí)施方式中，提供用于生產(chǎn)結(jié)合人RSPO3的抗體的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括使用人RSPO3的22～272位氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括使用SEQIDNO:3的22～272位氨基酸。在一些實(shí)施方式中，生產(chǎn)結(jié)合至少一種人RSPO蛋白的抗體的方法包括篩選人噬菌體文庫(kù)。本發(fā)明還提供鑒定結(jié)合至少一種RSPO蛋白的抗體的方法。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)對(duì)與RSPO蛋白或其部分的結(jié)合進(jìn)行FACS篩選而鑒定所述抗體。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)對(duì)與RSPO蛋白的結(jié)合進(jìn)行使用ELISA的篩選而鑒定所述抗體。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)就對(duì)RSPO蛋白與人LGR蛋白的結(jié)合的阻斷來(lái)進(jìn)行FACS篩選而鑒定所述抗體。在一些實(shí)施方式中，對(duì)β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的抑制或阻斷進(jìn)行篩選而鑒定所述抗體。在一些實(shí)施方式中，生產(chǎn)針對(duì)人RSPO1蛋白的抗體的方法包括用包含人RSPO1的31～263位氨基酸的多肽對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫。在一些實(shí)施方式中，生產(chǎn)針對(duì)人RSPO1蛋白的抗體的方法包括用包含人RSPO1的21～263位氨基酸中的至少一部分的多肽對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括從所述哺乳動(dòng)物分離抗體或產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，生產(chǎn)結(jié)合RSPO1蛋白的單克隆抗體的方法包括：(a)用包含人RSPO1的21～263位氨基酸的至少一部分的多肽對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫；(b)從經(jīng)免疫哺乳動(dòng)物分離產(chǎn)生抗體的細(xì)胞；(c)將所述產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系的細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括(d)選擇表達(dá)結(jié)合RSPO1蛋白的抗體的雜交瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，人RSPO1的21～263位氨基酸的所述至少一部分選自由SEQIDNO:5～SEQIDNO:9組成的組。在一些實(shí)施方式中，人RSPO1的21～263位氨基酸的所述至少一部分是SEQIDNO:9。在一些實(shí)施方式中，人RSPO1的21～263位氨基酸的所述至少一部分是SEQIDNO:6或SEQIDNO:7。在一些實(shí)施方式中，人RSPO1的21～263位氨基酸的所述至少一部分是SEQIDNO:6和SEQIDNO:7。在一些實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物是小鼠。在一些實(shí)施方式中，使用包含人RSPO1的21～263位氨基酸的至少一部分的多肽選擇所述抗體。在一些實(shí)施方式中，包含人RSPO1的21～263位氨基酸的至少一部分的用于選擇的多肽選自由SEQIDNO:5～SEQIDNO:9組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO1和至少一種其他RSPO蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述至少一種其他RSPO蛋白選自由RSPO2、RSPO3和RSPO4組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO1和RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO1和RSPO3。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO1和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO1、RSPO2和RSPO3。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO1、RSPO2和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO1、RSPO3和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合人RSPO1和小鼠RSPO1。在一些實(shí)施方式中，生產(chǎn)針對(duì)人RSPO2蛋白的抗體的方法包括用包含人RSPO2的22～205位氨基酸的多肽對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫。在一些實(shí)施方式中，生產(chǎn)針對(duì)人RSPO2蛋白的抗體的方法包括用包含人RSPO2的22～243位氨基酸中的至少一部分的多肽對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括從所述哺乳動(dòng)物分離抗體或產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，生產(chǎn)結(jié)合RSPO2蛋白的單克隆抗體的方法包括：(a)用包含人RSPO2的22～243位氨基酸的至少一部分的多肽對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫；(b)從經(jīng)免疫哺乳動(dòng)物分離產(chǎn)生抗體的細(xì)胞；(c)將所述產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系的細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括(d)選擇表達(dá)結(jié)合RSPO2蛋白的抗體的雜交瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，人RSPO2的22～243位氨基酸的所述至少一部分選自由SEQIDNO:44～SEQIDNO:47組成的組。在一些實(shí)施方式中，人RSPO2的22～243位氨基酸的所述至少一部分是SEQIDNO:44。在一些實(shí)施方式中，人RSPO2的22～243位氨基酸的所述至少一部分是SEQIDNO:45或SEQIDNO:46。在一些實(shí)施方式中，人RSPO2的22～243位氨基酸的所述至少一部分是SEQIDNO:45和SEQIDNO:46。在一些實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物是小鼠。在一些實(shí)施方式中，使用包含人RSPO2的22～243位氨基酸的至少一部分的多肽選擇所述抗體。在一些實(shí)施方式中，包含人RSPO2的22～243位氨基酸的至少一部分的用于選擇的多肽選自由SEQIDNO:44～SEQIDNO:47組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO2和至少一種其他RSPO蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述至少一種其他RSPO蛋白選自由RSPO1、RSPO3和RSPO4組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO2和RSPO1。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO2和RSPO3。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO2和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO2、RSPO1和RSPO3。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO2、RSPO3和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO2、RSPO1和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合人RSPO2和小鼠RSPO2。在一些實(shí)施方式中，生產(chǎn)針對(duì)人RSPO3蛋白的抗體的方法包括用包含人RSPO3的22～272位氨基酸的多肽對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫。在一些實(shí)施方式中，生產(chǎn)針對(duì)人RSPO3蛋白的抗體的方法包括用包含人RSPO3的22～272位氨基酸中的至少一部分的多肽對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括從所述哺乳動(dòng)物分離抗體或產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，生產(chǎn)結(jié)合RSPO3蛋白的單克隆抗體的方法包括：(a)用包含人RSPO3的22-272位氨基酸的至少一部分的多肽對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫；(b)從經(jīng)免疫哺乳動(dòng)物分離產(chǎn)生抗體的細(xì)胞；(c)將所述產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系的細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括(d)選擇表達(dá)結(jié)合RSPO3蛋白的抗體的雜交瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，人RSPO3的22～272位氨基酸的所述至少一部分選自由SEQIDNO:48～SEQIDNO:51組成的組。在一些實(shí)施方式中，人RSPO3的22～272位氨基酸的所述至少一部分是SEQIDNO:48。在一些實(shí)施方式中，人RSPO3的22～272位氨基酸的所述至少一部分是SEQIDNO:49或SEQIDNO:50。在一些實(shí)施方式中，人RSPO3的22～272位氨基酸的所述至少一部分是SEQIDNO:49和SEQIDNO:50。在一些實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物是小鼠。在一些實(shí)施方式中，使用包含人RSPO3的22～272位氨基酸的至少一部分的多肽選擇所述抗體。在一些實(shí)施方式中，包含人RSPO3的22～272位氨基酸的至少一部分的用于選擇的多肽選自由SEQIDNO:48～SEQIDNO:51組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO3和至少一種其他RSPO蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述至少一種其他RSPO蛋白選自由RSPO2、RSPO4和RSPO1組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO3和RSPO1。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO3和RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO3和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO3、RSPO1和RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO3、RSPO1和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO3、RSPO2和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合人RSPO3和小鼠RSPO3。在一些實(shí)施方式中，由本文描述方法產(chǎn)生的抗體是RSPO拮抗劑。在一些實(shí)施方式中，由本文描述方法產(chǎn)生的抗體抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，生產(chǎn)針對(duì)至少一種人RSPO蛋白的抗體的方法包括使用包含單抗原結(jié)合位點(diǎn)的膜結(jié)合異二聚體分子鑒定抗體。在一些非限制性實(shí)施方式中，使用國(guó)際申請(qǐng)WO2011/100566中公開(kāi)的方法和多肽鑒定所述抗體，本文通過(guò)參考并入其全部?jī)?nèi)容。在一些實(shí)施方式中，生產(chǎn)針對(duì)至少一種人RSPO蛋白的抗體的方法包括就結(jié)合人RSPO蛋白的抗體篩選抗體表達(dá)文庫(kù)。在一些實(shí)施方式中，所述抗體表達(dá)文庫(kù)是噬菌體文庫(kù)。在一些實(shí)施方式中，所述篩選包括淘選。在一些實(shí)施方式中，所述抗體表達(dá)文庫(kù)(例如噬菌體文庫(kù))使用人RSPO1的21～263位氨基酸的至少一部分進(jìn)行篩選。在一些實(shí)施方式中，使用不同的RSPO蛋白再次對(duì)在第一篩選中鑒定出的抗體進(jìn)行篩選，由此鑒定結(jié)合RSPO1和第二RSPO蛋白的抗體。在一些實(shí)施方式中，用于篩選的多肽包含人RSPO1的21～263位氨基酸的至少一部分，所述至少一部分選自由SEQIDNO:5～SEQIDNO:9組成的組。在一些實(shí)施方式中，在所述篩選中鑒定出的抗體結(jié)合RSPO1和至少一種其他RSPO蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述至少一種其他RSPO蛋白選自由RSPO2、RSPO3和RSPO4組成的組。在一些實(shí)施方式中，在所述篩選中鑒定出的抗體結(jié)合RSPO1和RSPO2。在一些實(shí)施方式中，在所述篩選中鑒定出的抗體結(jié)合RSPO1和RSPO3。在一些實(shí)施方式中，在所述篩選中鑒定出的抗體結(jié)合RSPO1和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，在所述篩選中鑒定出的抗體結(jié)合人RSPO1和小鼠RSPO1。在一些實(shí)施方式中，在所述篩選中鑒定出的抗體是RSPO1拮抗劑。在一些實(shí)施方式中，在所述篩選中鑒定出的抗體抑制由RSPO1誘導(dǎo)的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，所述抗體表達(dá)文庫(kù)(例如噬菌體文庫(kù))使用人RSPO2的22～205位氨基酸的至少一部分進(jìn)行篩選。在一些實(shí)施方式中，使用不同的RSPO蛋白再次對(duì)在第一篩選中鑒定出的抗體進(jìn)行篩選，由此鑒定結(jié)合RSPO2和第二RSPO蛋白的抗體。在一些實(shí)施方式中，用于篩選的多肽包含人RSPO2的22～205位氨基酸的至少一部分，所述至少一部分選自由SEQIDNO:44～SEQIDNO:47組成的組。在一些實(shí)施方式中，在所述篩選中鑒定出的抗體結(jié)合RSPO2和至少一種其他RSPO蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述至少一種其他RSPO蛋白選自由RSPO1、RSPO3和RSPO4組成的組。在一些實(shí)施方式中，在所述篩選中鑒定出的抗體結(jié)合RSPO2和RSPO3。在一些實(shí)施方式中，在所述篩選中鑒定出的抗體結(jié)合RSPO2和RSPO4。在一些實(shí)施方式中，在所述篩選中鑒定出的抗體結(jié)合RSPO2和RSPO1。在一些實(shí)施方式中，在所述篩選中鑒定出的抗體結(jié)合人RSPO2和小鼠RSPO2。在一些實(shí)施方式中，在所述篩選中鑒定出的抗體是RSPO2拮抗劑。在一些實(shí)施方式中，在所述篩選中鑒定出的抗體抑制由RSPO2誘導(dǎo)的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，本文描述的抗體是分離的。在一些實(shí)施方式中，本文描述的抗體是基本純的。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是多肽。所述多肽可以是包含結(jié)合至少一種人RSPO蛋白的抗體或其片段的重組多肽、天然多肽或合成多肽。在本領(lǐng)域中會(huì)意識(shí)到的是，可以對(duì)本發(fā)明的一些氨基酸序列進(jìn)行改變而不會(huì)顯著影響所述蛋白的結(jié)構(gòu)或功能。因此，本發(fā)明還包括所述多肽的各種變化，其顯示了針對(duì)人RSPO蛋白的抗體或其片段的實(shí)質(zhì)活性，或者其包括針對(duì)人RSPO蛋白的抗體或其片段的區(qū)域。在一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合多肽的氨基酸序列改變包括缺失、插入、倒置、重復(fù)和/或其他類(lèi)型的取代?？梢詫?duì)所述多肽、其類(lèi)似物和變體進(jìn)行進(jìn)一步修飾以含有另外的化學(xué)部分，該部分通常不是所述多肽的一部分。衍生部分可以改善所述多肽的溶解度、生物半衰期和/或吸收。所述部分還可以減少或消除所述多肽和變體的任何不期望的副作用。對(duì)化學(xué)部分的綜述可見(jiàn)于Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第21版,2005,UniversityoftheSciences,Philadelphia,PA。本文描述的多肽可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適的方法產(chǎn)生。此類(lèi)方法包括從直接蛋白合成至構(gòu)建編碼多肽序列的DNA序列和在合適的宿主中表達(dá)這些序列。在一些實(shí)施方式中，使用重組技術(shù)通過(guò)分離或合成編碼野生型目的蛋白的DNA序列來(lái)構(gòu)建DNA序列?？蛇x的是，可以通過(guò)位點(diǎn)特異性誘變對(duì)所述序列進(jìn)行誘變，以提供其功能類(lèi)似物。參見(jiàn)例如Zoeller等,1984,PNAS,81:5662-5066和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,588,585。在一些實(shí)施方式中，編碼目的多肽的DNA序列可以使用寡核苷酸合成儀通過(guò)化學(xué)合成來(lái)構(gòu)建。寡核苷酸可以基于所需多肽的氨基酸序列，選擇在其中產(chǎn)生目的重組多肽的宿主細(xì)胞中有利的那些密碼子來(lái)設(shè)計(jì)?？梢詰?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)合成對(duì)分離的目的多肽進(jìn)行編碼的多核苷酸序列。例如，可以使用完整氨基酸序列來(lái)構(gòu)建回譯基因。此外，可以合成含有編碼特定分離多肽的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成編碼所需多肽的一部分的數(shù)個(gè)小寡核苷酸，然后將其連接。各寡核苷酸通常含有用于互補(bǔ)組裝的5'或3'突出(overhang)。一旦組裝后(通過(guò)合成、定點(diǎn)誘變或另一方法)，可以將編碼特定目的多肽的多核苷酸序列插入至表達(dá)載體中，并可操作地連接至適于在所述宿主中表達(dá)所述蛋白的表達(dá)控制序列。通過(guò)核苷酸測(cè)序、限制酶定位和/或在合適的宿主中表達(dá)生物活性多肽而確認(rèn)正確的組裝。如本領(lǐng)域所公知的，為了在宿主中獲得高表達(dá)水平的轉(zhuǎn)染基因，所述基因必須可操作地連接至轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)控制序列，所述序列在所選的表達(dá)宿主中具有功能。在一些實(shí)施方式中，使用重組表達(dá)載體來(lái)擴(kuò)增和表達(dá)編碼針對(duì)人RSPO蛋白的抗體或其片段的DNA。例如，重組表達(dá)載體可以是可復(fù)制DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體具有編碼RSPO-結(jié)合劑、抗-RSPO抗體或其片段的多肽鏈的合成或源自cDNA的DNA片段，所述DNA片段可操作地連接至源自哺乳動(dòng)物、微生物、病毒或昆蟲(chóng)基因的合適的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)控元件。轉(zhuǎn)錄單元通常包括以下組件：(1)在基因表達(dá)中具有調(diào)控作用的一種或多種遺傳元件，例如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，(2)轉(zhuǎn)錄至mRNA中并翻譯成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或編碼序列，和(3)合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止序列。調(diào)控元件可以包括操作子序列以控制轉(zhuǎn)錄?？梢粤硗庖胪ǔＳ蓮?fù)制原點(diǎn)賦予的在宿主中復(fù)制的能力和便于識(shí)別轉(zhuǎn)化體的選擇基因。當(dāng)DNA區(qū)彼此功能相關(guān)時(shí)DNA區(qū)是“可操作地連接”。例如，如果信號(hào)肽的DNA(分泌前導(dǎo))表達(dá)為參與多肽的分泌的前體，該信號(hào)肽的DNA(分泌前導(dǎo))與多肽的DNA可操作地連接，如果啟動(dòng)子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄則啟動(dòng)子與編碼序列可操作地連接，或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)的定位使得允許翻譯則核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列可操作地連接。在一些實(shí)施方式中，旨在用于酵母表達(dá)系統(tǒng)中的結(jié)構(gòu)元件包括能夠使宿主細(xì)胞細(xì)胞外分泌經(jīng)翻譯蛋白的前導(dǎo)序列。其他實(shí)施方式中，當(dāng)不用前導(dǎo)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列表達(dá)重組蛋白時(shí)，該重組蛋白可以包括N末端甲硫氨酸殘基。該殘基可選地能夠被從所表達(dá)的重組蛋白切割下，從而提供最終產(chǎn)物。表達(dá)控制序列和表達(dá)載體的選擇依賴于宿主的選擇。可以使用各種表達(dá)宿主/載體的組合。用于真核宿主的有用的表達(dá)載體包括例如包含來(lái)自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和巨細(xì)胞病毒的表達(dá)控制序列的載體。用于細(xì)菌宿主的有用的表達(dá)載體包括已知的細(xì)菌質(zhì)粒，例如來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒，包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物，以及更寬宿主范圍的質(zhì)粒，例如M13以及其他絲狀單鏈DNA噬菌體。用于表達(dá)RSPO-結(jié)合多肽或抗體(或RSPO蛋白以用作抗原)的合適宿主細(xì)胞包括在合適啟動(dòng)子控制下的原核生物、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或高級(jí)真核細(xì)胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物體，例如大腸桿菌或桿菌。高級(jí)真核細(xì)胞包括如下文所述的哺乳動(dòng)物來(lái)源的已建立細(xì)胞系。還可以使用無(wú)細(xì)胞移植系統(tǒng)。Pouwels等(1985,CloningVectors:ALaboratoryManual,Elsevier,NewYork,NY)描述了與細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主一起使用的合適的克隆表達(dá)載體。關(guān)于蛋白生產(chǎn)(包括抗體生產(chǎn))的方法的另外信息可以例如見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2008/0187954、美國(guó)專(zhuān)利第6,413,746和6,660,501號(hào)和國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO04009823。使用各種哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)重組多肽。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)重組多肽是優(yōu)選的，因?yàn)榇祟?lèi)蛋白通常正確折疊、經(jīng)過(guò)合適的修飾和具有完全功能。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例包括COS-7(來(lái)自猴腎)、L-929(來(lái)自鼠類(lèi)成纖維細(xì)胞)、C127(來(lái)自鼠類(lèi)哺乳動(dòng)物腫瘤)、3T3(來(lái)自鼠類(lèi)成纖維細(xì)胞)、CHO(來(lái)自中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)、HeLa(來(lái)自人子宮頸癌)、BHK(來(lái)自倉(cāng)鼠腎成纖維細(xì)胞)和HEK-293(來(lái)自人胚胎腎)細(xì)胞系和其變體。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可以包含非轉(zhuǎn)錄元件(例如復(fù)制原點(diǎn)、與待表達(dá)基因連接的合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子、以及其他5'或3'側(cè)接非轉(zhuǎn)錄序列)和5'或3'非翻譯序列，例如必要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄終止序列。用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中生產(chǎn)異源蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)例如,Luckow和Summers,1988,Bio/Technology,6:47)。因此，本發(fā)明提供包含本文描述的RSPO-結(jié)合劑的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞產(chǎn)生本文描述的RSPO-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞產(chǎn)生抗體。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞產(chǎn)生抗體89M5。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞產(chǎn)生抗體h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞產(chǎn)生抗體130M23。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞產(chǎn)生抗體h130M23-H1L2。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞產(chǎn)生抗體h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是ATCC保藏號(hào)為PTA-11970的雜交瘤細(xì)胞系。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是ATCC保藏號(hào)為PTA-12021的雜交瘤細(xì)胞系。由轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的蛋白可以根據(jù)任何合適的方法進(jìn)行純化。標(biāo)準(zhǔn)方法包括色譜(例如離子交換、親和和尺寸柱色譜)、離心、差別溶解或用于蛋白純化的任何其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)?？梢詫⒅T如六聚組氨酸、麥芽糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域、流感病毒包衣序列和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等親和標(biāo)記連接至所述蛋白，以允許通過(guò)合適的親和柱而容易地純化。還可以利用諸如蛋白水解、質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)、高性能液相色譜(HPLC)和X射線晶體學(xué)等技術(shù)來(lái)物理表征分離的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，可以使用可商購(gòu)獲得的蛋白濃縮過(guò)濾器(例如Amicon或MilliporePellicon超濾單元)對(duì)來(lái)自將重組蛋白分泌至培養(yǎng)基中的表達(dá)系統(tǒng)的上清液進(jìn)行第一濃縮。濃縮步驟后，將濃縮物施涂至合適的純化基質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，可以使用陰離子交換樹(shù)脂，例如具有懸垂的二乙基氨基乙基(DEAE)基團(tuán)的基質(zhì)或底物?；|(zhì)可以是丙烯酰胺、瓊脂糖、右旋糖苷、纖維素或在蛋白純化中其他類(lèi)型的常用基質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，可以使用陽(yáng)離子交換步驟。合適的陽(yáng)離子交換劑包括各種包含磺丙基或羧甲基的不溶性基質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，可以使用羥基磷灰石培養(yǎng)基，包括但不限于陶瓷羥基磷灰石(CHT)。在一些實(shí)施方式中，可以使用利用疏水性RP-HPLC培養(yǎng)基(例如具有懸垂甲基或其他脂肪族基團(tuán)的二氧化硅凝膠)的一步或多步反相HPLC步驟來(lái)進(jìn)一步純化RSPO-結(jié)合劑。還可以采用前述純化步驟的一些或所有的各種組合來(lái)提供均勻的重組蛋白。在一些實(shí)施方式中，在細(xì)菌培養(yǎng)基中產(chǎn)生的重組蛋白可以通過(guò)例如以下步驟進(jìn)行分離：首先從細(xì)胞球團(tuán)中提取，然后進(jìn)行一步或多步濃縮、鹽析、水性離子交換或尺寸排阻色譜步驟?？梢允褂肏PLC來(lái)進(jìn)行最終純化步驟。用于表達(dá)重組蛋白的微生物細(xì)胞可以被任何常規(guī)方法破壞，包括冷凍-解凍循環(huán)、超聲波、機(jī)械破壞或使用細(xì)胞裂解劑。用于純化抗體和其他蛋白的本領(lǐng)域已知的方法還包括例如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2008/0312425、2008/0177048和2009/0187005中描述的那些。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑為不作為抗體的多肽。用于鑒定和生產(chǎn)以高親和性與蛋白靶標(biāo)的非抗體多肽的各種方法是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如,Skerra,2007,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304；Hosse等,2006,ProteinScience,15:14-27；Gill等,2006,Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-658；Nygren,2008,FEBSJ.,275:2668-76；和Skerra,2008,FEBSJ.,275:2677-83。在一些實(shí)施方式中，可以使用噬菌體展示技術(shù)來(lái)生產(chǎn)和/或鑒定RSPO-結(jié)合多肽。在一些實(shí)施方式中，所述多肽包含選自由蛋白A、蛋白G、脂鈣蛋白、纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、錨蛋白共有重復(fù)結(jié)構(gòu)域和硫氧還蛋白組成的組中的類(lèi)別的蛋白支架。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑或抗體可以以許多綴合(即免疫綴合物或放射性綴合物)或非綴合形式中的任一種使用。在一些實(shí)施方式中，所述抗體能夠以非綴合形式用于利用受試對(duì)象的天然防御機(jī)制(包括補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性和抗體依賴性細(xì)胞毒性)，從而消除惡性或瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑(例如抗體或多肽)綴合至細(xì)胞毒性劑。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞毒性劑是化學(xué)治療劑，包括但不限于甲氨蝶呤、阿霉素、多柔比星、美法侖、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、道諾霉素或其他嵌入劑(intercalatingagent)。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞毒性劑是細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶促活性毒素或其片段，包括但不限于白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮素A鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹(shù)毒素、巴豆毒素、肥阜草(Sapaonariaofficinalis)抑制劑、白樹(shù)毒素、絲林霉素、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecene)。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞毒性劑是放射性同位素，以產(chǎn)生放射性綴合物或放射性綴合抗體。可利用各種放射性同位素來(lái)產(chǎn)生放射性綴合抗體，包括但不限于90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re和212Bi。還可以利用抗體與一種或多種小分子毒素的綴合物，所述小分子毒素例如奇霉素、美登醇、單端孢菌毒素(trichothene)和CC1065，以及這些毒素的衍生物?？贵w和細(xì)胞毒性劑的綴合物可以使用各種雙官能蛋白偶聯(lián)劑來(lái)制備，例如N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯的雙官能衍生物(例如鹽酸二甲基己二亞酰胺)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亞胺)、醛(例如戊二醛)、雙疊氮化合物(例如雙(對(duì)疊氮基苯甲酰基)己二胺)、雙重氮鹽衍生物(例如雙(對(duì)重氮基苯酰基)乙二胺)、二異氰酸酯(例如2,6-二異氰酸甲苯酯)和雙活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。III.多核苷酸在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涵蓋了包含編碼特異性結(jié)合至少一種人RSPO的多肽或此類(lèi)多肽的片段的多核苷酸的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”涵蓋了僅包括所述多肽的編碼序列的多核苷酸以及包括另外的編碼序列和/或非編碼序列的多核苷酸。例如，本發(fā)明提供包含編碼針對(duì)人RSPO蛋白的抗體或編碼此類(lèi)抗體的片段的多核苷酸的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以為RNA形式或?yàn)镈NA形式。DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA，并且能夠是雙鏈或單鏈的，并且單鏈可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含選自由以下序列組成的組中的序列：SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:68和SEQIDNO:69。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含選自由以下序列組成的組中的序列：SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:74和SEQIDNO:76。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含選自由以下序列組成的組中的多核苷酸序列：SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56和SEQIDNO:58。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含選自由以下序列組成的組中的多核苷酸序列：SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:72和SEQIDNO:75。在一些實(shí)施方式中，質(zhì)粒包含含有SEQIDNO:52的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，質(zhì)粒包含含有多核苷酸序列SEQIDNO:56的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，質(zhì)粒包含含有多核苷酸序列SEQIDNO:60的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，質(zhì)粒包含含有多核苷酸序列SEQIDNO:64的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，質(zhì)粒包含含有多核苷酸序列SEQIDNO:72的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，質(zhì)粒包含編碼含有SEQIDNO:68和/或SEQIDNO:69的氨基酸序列的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，質(zhì)粒包含編碼含有SEQIDNO:70和/或SEQIDNO:71的氨基酸序列的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，質(zhì)粒包含編碼含有SEQIDNO:70和/或SEQIDNO:74的氨基酸序列的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列與包含選自由SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56和SEQIDNO:58組成的組中序列的多核苷酸具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性，并且在一些實(shí)施方式中，兩者具有至少96％、97％、98％或99％同一性。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含具有下述核苷酸序列的多核苷酸：所述核苷酸序列與包含選自由SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:72和SEQIDNO:75組成的組中序列的多核苷酸具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性，并且在一些實(shí)施方式中，兩者具有至少96％、97％、98％或99％同一性。還提供了包含與SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:72或SEQIDNO:75雜交的多核苷酸的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，所述雜交在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，抗體由包含SEQIDNO:23和SEQIDNO:24的多核苷酸編碼。在一些實(shí)施方式中，抗體由包含SEQIDNO:52和SEQIDNO:56的多核苷酸編碼。在一些實(shí)施方式中，抗體由包含SEQIDNO:39和SEQIDNO:40的多核苷酸編碼。在一些實(shí)施方式中，抗體由包含SEQIDNO:60和SEQIDNO:64的多核苷酸編碼。在一些實(shí)施方式中，抗體由包含SEQIDNO:60和SEQIDNO:72的多核苷酸編碼。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含成熟多肽的編碼序列，所述編碼序列與例如有助于多肽從宿主細(xì)胞表達(dá)和分泌的多核苷酸(例如前導(dǎo)序列或信號(hào)序列，其用作控制多肽從細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)的分泌序列)融合在同一閱讀框中。具有前導(dǎo)序列的多肽是前蛋白，并且能夠被宿主細(xì)胞將前導(dǎo)序列其閣下，從而形成所述多肽的成熟形式。所述多核苷酸還可以編碼作為附加有另外的5'氨基酸殘基的成熟蛋白的原蛋白。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白是原蛋白，并且是所述蛋白的失活形式。一旦原序列被切割，則留下活性成熟蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含與例如允許對(duì)所編碼多肽進(jìn)行純化的標(biāo)記序列融合在同一閱讀框中的成熟多肽的編碼序列。例如，所述標(biāo)記序列可以是由pQE-9載體提供的六聚組氨酸標(biāo)記，以用于在細(xì)菌宿主的情況下對(duì)與所述標(biāo)記融合的成熟多肽進(jìn)行純化，或者在使用哺乳動(dòng)物宿主(例如，COS-7細(xì)胞)時(shí)，所述標(biāo)記序列可以是源自流感血凝素蛋白的血凝素(HA)標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)記序列是FLAG標(biāo)記，其是序列為DYKDDDDK(SEQIDNO:18)的肽，可以與其他親和標(biāo)記組合使用。本發(fā)明還涉及例如編碼片段、類(lèi)似物和/或衍生物的上文所述多核苷酸的變體。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列與編碼包含本文描述的RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)或其片段的多核苷酸具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性，并且在一些實(shí)施方式中，兩者具有至少約96％、97％、98％或99％同一性。如本文所用，短語(yǔ)具有與參照核苷酸序列具有至少例如95％“同一性”的核苷酸序列的多核苷酸是指：所述多核苷酸的核苷酸序列與參照序列相同，不同之處在于，相對(duì)于參照核苷酸序列中的每100個(gè)核苷酸，所述多核苷酸序列包括至多5個(gè)點(diǎn)突變。換言之，為了獲得與參照核苷酸序列具有至少例如95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，可以將參照序列中的至多5％的核苷酸缺失、或用另一核苷酸取代、或可以將數(shù)量為參照序列中全部核苷酸的至多5％的核苷酸插入至參照序列中。參照序列的這些突變可以出現(xiàn)在參照核苷酸序列的5'或3'末端位置或這些末端位置之間的任何地方，其在參照序列的核苷酸中分別地穿插或在參照序列內(nèi)以一個(gè)或多個(gè)相鄰基團(tuán)穿插。多核苷酸變體可以含有編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)中的改變。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸變體含有產(chǎn)生沉默取代、添加或缺失但不改變所編碼多肽的性質(zhì)或活性的改變。在一些實(shí)施方式中，核苷酸變體通過(guò)因遺傳編碼的簡(jiǎn)并性導(dǎo)致的沉默取代而產(chǎn)生。在一些實(shí)施方式中，核苷酸變體包含導(dǎo)致表達(dá)差異(例如表達(dá)增加或降低)的核苷酸序列，但氨基酸序列未改變。多核苷酸變體可以出于各種理由而產(chǎn)生，例如，對(duì)特定宿主優(yōu)化密碼子表達(dá)(即，將人mRNA中的密碼子改變?yōu)橹T如大腸桿菌等細(xì)菌宿主優(yōu)選的密碼子)。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸是分離的。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸是基本上純的。還提供包含本文描述的多核苷酸的載體和細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)載體包含多核苷酸分子。在一些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞包含含有所述多核苷酸分子的表達(dá)載體。在一些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞包含多核苷酸分子。IV.使用方法和藥物組合物本發(fā)明的RSPO-結(jié)合劑(包括多肽和抗體)用于各種應(yīng)用，包括但不限于治療性治療方法，例如治療癌。在一些實(shí)施方式中，所述試劑用于抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)、抑制腫瘤生長(zhǎng)、誘導(dǎo)分化、減少腫瘤體積、減少腫瘤中癌干細(xì)胞的頻率和/或減少腫瘤的致瘤性。所述使用方法可以是體外、離體或體內(nèi)方法。在一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑或多肽或抗體是人RSPO1的拮抗劑。在一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑或多肽或抗體是人RSPO2的拮抗劑。在一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑或多肽或抗體是人RSPO3的拮抗劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑用于治療與β-連環(huán)素的激活、β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)增加和/或β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)異常有關(guān)的疾病。在一些實(shí)施方式中，所述疾病是依賴于β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的疾病。在一些實(shí)施方式中，所述疾病是依賴于β-連環(huán)素激活的疾病。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑用于治療特征在于干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的水平增加的疾病。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括對(duì)受試對(duì)象施用治療有效量的RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗體)。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括對(duì)受試對(duì)象施用治療有效量的RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗體)。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括對(duì)受試對(duì)象施用治療有效量的RSPO3-結(jié)合劑(例如，抗體)。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象是人。本發(fā)明提供使用本文描述的RSPO-結(jié)合劑或抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法。在一些實(shí)施方式中，抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法包括使細(xì)胞與RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)在體外接觸。例如，在添加有抗-RSPO抗體或其他試劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)永生化細(xì)胞系或癌細(xì)胞系以抑制腫瘤生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，腫瘤細(xì)胞分離自患者樣品(例如組織活檢、胸腔積液或血液樣品)，并且在添加有RSPO-結(jié)合劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以抑制腫瘤生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法包括使腫瘤或腫瘤細(xì)胞與RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)在體內(nèi)接觸。在一些實(shí)施方式中，使腫瘤或腫瘤細(xì)胞與RSPO-結(jié)合劑接觸在動(dòng)物模型中進(jìn)行。例如，可以對(duì)具有異種移植物的免疫妥協(xié)的小鼠(例如NOD/SCID小鼠)施用RSPO-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，從患者樣品(例如組織活檢、胸腔積液或血液樣品)分離出癌細(xì)胞或癌干細(xì)胞，并且將其注入免疫妥協(xié)的小鼠中，然后對(duì)所述免疫妥協(xié)的小鼠施用RSPO-結(jié)合劑以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，對(duì)所述動(dòng)物施用RSPO1-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，對(duì)所述動(dòng)物施用RSPO2-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，對(duì)所述動(dòng)物施用RSPO3-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，在將致瘤性細(xì)胞引入動(dòng)物的同時(shí)或稍后施用所述RSPO-結(jié)合劑，以預(yù)防腫瘤生長(zhǎng)(“預(yù)防性模型”)。在一些實(shí)施方式中，在腫瘤已經(jīng)生長(zhǎng)至特定尺寸后施用所述RSPO-結(jié)合劑作為治療劑(“治療性模型”)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗-RSPO1抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO1抗體是抗體89M5。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO1抗體是抗體h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗-RSPO2抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO2抗體是抗體130M23。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO2抗體是抗體h130M23-H1L2。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO2抗體是抗體h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗-RSPO3抗體。在一些實(shí)施方式中，抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法包括對(duì)受試對(duì)象施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑，所述RSPO-結(jié)合劑含有：包含TGYTMH(SEQIDNO:12)的重鏈CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQIDNO:13)的重鏈CDR2和包含KEFSDGYYFFAY(SEQIDNO:14)的重鏈CDR3；和/或包含KASQDVIFAVA(SEQIDNO:15)的輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQIDNO:16)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTPW(SEQIDNO:17)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法包括對(duì)受試對(duì)象施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑，所述RSPO-結(jié)合劑含有：包含SSYAMS(SEQIDNO:29)的重鏈CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQIDNO:30)的重鏈CDR2和包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQIDNO:31)的重鏈CDR3；和/或包含KASQDVSSAVA(SEQIDNO:32)的輕鏈CDR1、包含WASTRHT(SEQIDNO:33)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTP(SEQIDNO:34)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法包括對(duì)受試對(duì)象施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象是人。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有腫瘤或具有的腫瘤已經(jīng)被除去。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有至少一種RSPO蛋白(例如,RSPO1、RSPO2或RSPO3)的表達(dá)水平升高的腫瘤。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO1-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體89M5。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO1抗體是抗體h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO2-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體130M23。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO2抗體是抗體h130M23-H1L2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO3-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是其中激活β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的腫瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是其中β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)異常的腫瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤包含APC腫瘤抑制基因中的失活突變(例如，截短突變)。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤不包含所述APC腫瘤抑制基因中的失活突變。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤包含野生型APC基因。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤不包含β-連環(huán)素基因中的激活突變。在一些實(shí)施方式中，正在被治療的受試對(duì)象的癌與此類(lèi)腫瘤有關(guān)。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤表達(dá)與RSPO1-結(jié)合劑或抗體結(jié)合的RSPO1。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤具有升高表達(dá)水平的RSPO1或過(guò)表達(dá)的RSPO1。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤具有高表達(dá)水平的RSPO1。通常，短語(yǔ)“腫瘤具有升高表達(dá)水平的”蛋白(或類(lèi)似短語(yǔ))是指腫瘤中的蛋白的表達(dá)水平與同一組織類(lèi)型的正常組織中同一蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行比較。但是，在一些實(shí)施方式中，腫瘤中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與組織類(lèi)型的組內(nèi)所述蛋白質(zhì)的平均表達(dá)水平相比“升高”或“高”。在一些實(shí)施方式中，腫瘤中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與同一組織類(lèi)型或不同組織類(lèi)型的其他腫瘤中所述蛋白質(zhì)的表達(dá)水平相比“升高”或“高”。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤表達(dá)與RSPO2-結(jié)合劑或抗體結(jié)合的RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤具有升高表達(dá)水平的RSPO2或過(guò)表達(dá)的RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤具有高表達(dá)水平的RSPO2。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤表達(dá)與RSPO3-結(jié)合劑或抗體結(jié)合的RSPO3。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤具有升高表達(dá)水平的RSPO3或過(guò)表達(dá)的RSPO3。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤具有高表達(dá)水平的RSPO3。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤表達(dá)與RSPO4-結(jié)合劑或抗體結(jié)合的RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤具有升高表達(dá)水平的RSPO4或過(guò)表達(dá)的RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤具有高表達(dá)水平的RSPO4。在一些實(shí)施方式中，與正常組織中表達(dá)的RSPO水平相比，所述腫瘤表達(dá)升高水平的RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4。在一些實(shí)施方式中，所述正常組織是與所述腫瘤相同的組織類(lèi)型的組織。此外，本發(fā)明提供抑制受試對(duì)象中腫瘤生長(zhǎng)的方法，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤包含癌干細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤中癌干細(xì)胞的頻率通過(guò)施用所述RSPO-結(jié)合劑而減少。本發(fā)明還提供減少腫瘤中癌干細(xì)胞的頻率的方法，所述方法包括使所述腫瘤與有效量的RSPO-結(jié)合劑(例如，抗-RSPO抗體)接觸。在一些實(shí)施方式中，提供一種減少受試對(duì)象的腫瘤中癌干細(xì)胞的頻率的方法，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑(例如，抗-RSPO抗體)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗-RSPO1抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO1抗體是89M5。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO1抗體是抗體h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗-RSPO2抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO2抗體是130M23。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO2抗體是抗體h130M23-H1L2。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO2抗體是抗體h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗-RSPO3抗體。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是實(shí)體腫瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是選自由以下腫瘤組成的組中的腫瘤：結(jié)直腸瘤、胰腺瘤、肺瘤、卵巢瘤、肝瘤、乳腺瘤、腎瘤、前列腺瘤、胃腸瘤、黑素瘤、子宮頸瘤、膀胱瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及頭頸瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是結(jié)直腸瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是卵巢瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是肺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是胰腺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是包含APC基因中的失活突變的結(jié)直腸瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是不包含APC基因中的失活突變的結(jié)直腸瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO1的表達(dá)水平升高的卵巢瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO2的表達(dá)水平升高的胰腺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO2的表達(dá)水平升高的結(jié)腸瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO2的表達(dá)水平升高的肺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO2的表達(dá)水平升高的黑素瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO2的表達(dá)水平升高的乳腺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO3的表達(dá)水平升高的肺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO3的表達(dá)水平升高的卵巢瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO3的表達(dá)水平升高的乳腺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO3的表達(dá)水平升高的結(jié)腸瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO4的表達(dá)水平升高的乳腺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO4的表達(dá)水平升高的肺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO4的表達(dá)水平升高的卵巢瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO1的表達(dá)水平高的卵巢瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO2的表達(dá)水平高的胰腺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO2的表達(dá)水平高的結(jié)腸瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO2的表達(dá)水平高的肺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO2的表達(dá)水平高的黑素瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO2的表達(dá)水平高的乳腺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO3的表達(dá)水平高的肺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO3的表達(dá)水平高的卵巢瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO3的表達(dá)水平高的乳腺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO3的表達(dá)水平高的結(jié)腸瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO4的表達(dá)水平高的乳腺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO4的表達(dá)水平高的肺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是RSPO4的表達(dá)水平高的卵巢瘤。本發(fā)明還提供用于治療癌的方法，所述方法包括對(duì)受試對(duì)象施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述癌的特征在于表達(dá)的至少一種RSPO蛋白的水平與正常組織中的同一RSPO蛋白的表達(dá)水平相比升高的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述癌的特征在于過(guò)表達(dá)RSPO1的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述癌的特征在于過(guò)表達(dá)RSPO2的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述癌的特征在于過(guò)表達(dá)RSPO3的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述癌過(guò)表達(dá)選自由RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4組成的組中的至少一種RSPO蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述癌的特征在于表達(dá)β-連環(huán)素的細(xì)胞，其中所述RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)干擾RSPO-誘導(dǎo)的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)和/或激活。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSPO1，并且抑制或減少所述癌的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSPO2，并且抑制或減少所述癌的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSPO3，并且抑制或減少所述癌的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSPO1，干擾RSPO1/LGR相互作用，并且抑制或減少所述癌的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSPO2，干擾RSPO2/LGR相互作用，并且抑制或減少所述癌的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSPO3，干擾RSPO3/LGR相互作用，并且抑制或減少所述癌的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSPO1，抑制β-連環(huán)素激活，并且抑制或減少所述癌的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSPO2，抑制β-連環(huán)素激活，并且抑制或減少所述癌的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSPO3，抑制β-連環(huán)素激活，并且抑制或減少所述癌的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSPO1，并且減少所述癌中癌干細(xì)胞的頻率。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSPO2，并且減少所述癌中癌干細(xì)胞的頻率。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSPO3，并且減少所述癌中癌干細(xì)胞的頻率。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗-RSPO1抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO1抗體是抗體89M5。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO1抗體是抗體h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗-RSPO2抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO2抗體是抗體130M23。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO2抗體是抗體h130M23-H1L2。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO2抗體是抗體h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗-RSPO3抗體。本發(fā)明提供治療癌的方法，所述方法包括對(duì)受試對(duì)象(例如需要治療的受試對(duì)象)施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象是人。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有癌性腫瘤。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有的腫瘤已經(jīng)除去。在一些實(shí)施方式中，治療癌的方法包括對(duì)受試對(duì)象施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑，其中所述受試對(duì)象具有至少一種RSPO蛋白的表達(dá)升高的腫瘤。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有RSPO1的表達(dá)升高的卵巢瘤，并且對(duì)其施用RSPO1-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有RSPO1的表達(dá)升高的卵巢瘤，并且對(duì)其施用抗-RSPO1抗體。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有RSPO1的表達(dá)升高的卵巢瘤，并且對(duì)其施用抗體89M5。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有RSPO1的表達(dá)升高的卵巢瘤，并且對(duì)其施用抗體h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有RSPO2的表達(dá)升高的卵巢瘤，并且對(duì)其施用RSPO2-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有RSPO2的表達(dá)升高的卵巢瘤，并且對(duì)其施用抗-RSPO2抗體。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有RSPO2的表達(dá)升高的卵巢瘤，并且對(duì)其施用抗體130M23。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有RSPO2的表達(dá)升高的卵巢瘤，并且對(duì)其施用抗體h130M23-H1L2。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有RSPO2的表達(dá)升高的胰腺瘤，并且對(duì)其施用抗體130M23。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有RSPO2的表達(dá)升高的胰腺瘤，并且對(duì)其施用抗體h130M23-H1L2。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有RSPO2的表達(dá)升高的胰腺瘤，并且對(duì)其施用抗體h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有RSPO2的表達(dá)升高的結(jié)腸瘤，并且對(duì)其施用抗體130M23。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有RSPO2的表達(dá)升高的結(jié)腸瘤，并且對(duì)其施用抗體h130M23-H1L2。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有RSPO2的表達(dá)升高的結(jié)腸瘤，并且對(duì)其施用抗體h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有RSPO3的表達(dá)升高的肺瘤，并且對(duì)其施用抗-RSPO3抗體。在一些實(shí)施方式中，所述癌是選自由以下癌組成的組中的癌：結(jié)直腸癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌、黑素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及頭頸癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是胰腺癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是卵巢癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是結(jié)直腸癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是乳腺癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是前列腺癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是肺癌。此外，本發(fā)明提供減少受試對(duì)象中腫瘤的致瘤性的方法，所述方法包括對(duì)受試對(duì)象施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤包含癌干細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)減少所述腫瘤中癌干細(xì)胞的頻率而減少腫瘤的致瘤性。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括使用本文描述的RSPO1-結(jié)合劑、RSPO2-結(jié)合劑或RSPO3-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)施用RSPO-結(jié)合劑而減少所述腫瘤中癌干細(xì)胞的頻率。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括確定所述腫瘤或癌中至少一種RSPO蛋白的表達(dá)水平的步驟。在一些實(shí)施方式中，確定所述腫瘤或癌中RSPO的表達(dá)水平的步驟包括確定RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方式中，將腫瘤或癌中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表達(dá)水平與正常組織中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表達(dá)水平進(jìn)行比較。在一些實(shí)施方式中，將腫瘤或癌中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表達(dá)水平與正常組織中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的預(yù)定表達(dá)水平進(jìn)行比較。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括確定所述腫瘤或癌是否具有APC基因中的失活突變的步驟。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括確定所述腫瘤或癌是否具有β-連環(huán)素基因中的激活突變的步驟。在一些實(shí)施方式中，確定RSPO的表達(dá)水平的步驟在治療之前完成。在一些實(shí)施方式中，如果所述腫瘤或癌具有的RSPO表達(dá)水平與正常組織中相同RSPO蛋白的表達(dá)相比升高，則對(duì)所述受試對(duì)象施用本文描述的RSPO-結(jié)合劑或抗體。例如，在一些實(shí)施方式中，如果所述腫瘤或癌具有的RSPO1表達(dá)水平與正常組織中RSPO1蛋白的表達(dá)水平相比升高，則對(duì)所述受試對(duì)象施用RSPO1-結(jié)合劑(例如，抗-RSPO1抗體)。在一些實(shí)施方式中，如果所述腫瘤或癌具有的RSPO2表達(dá)水平與正常組織中RSPO2蛋白的表達(dá)水平相比升高，則對(duì)所述受試對(duì)象施用RSPO2-結(jié)合劑(例如，抗-RSPO2抗體)。在一些實(shí)施方式中，如果所述腫瘤或癌具有的RSPO3表達(dá)水平與正常組織中RSPO3蛋白的表達(dá)水平相比升高，則對(duì)所述受試對(duì)象施用RSPO3-結(jié)合劑(例如，抗-RSPO3抗體)。如果所述腫瘤的超過(guò)一種RSPO蛋白的表達(dá)水平升高，則對(duì)所述受試對(duì)象首先施用針對(duì)與正常組織相比過(guò)表達(dá)最多的RSPO蛋白的RSPO-結(jié)合劑或抗體。在一些實(shí)施方式中，如果所述腫瘤或癌具有APC基因中的突變，則對(duì)所述受試對(duì)象本文描述的施用RSPO-結(jié)合劑或抗體。此外，本發(fā)明提供鑒定用RSPO-結(jié)合劑治療的人受試對(duì)象的方法，所述方法包括確定所述受試對(duì)象是否具有RSPO表達(dá)水平與正常組織中相同RSPO蛋白的表達(dá)相比升高的腫瘤。在一些實(shí)施方式中，如果所述腫瘤具有的RSPO表達(dá)水平升高，則選擇所述受試對(duì)象以用特異性結(jié)合RSPO蛋白的抗體治療。在一些實(shí)施方式中，如果選定用于治療，則對(duì)所述受試對(duì)象施用本文描述的RSPO-結(jié)合劑或抗體。在一些實(shí)施方式中，如果所述腫瘤具有的超過(guò)一種RSPO的表達(dá)水平升高，則對(duì)所述受試對(duì)象施用結(jié)合表達(dá)水平最高的RSPO蛋白的RSPO-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有的腫瘤已經(jīng)除去。例如，在一些實(shí)施方式中，確定腫瘤中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表達(dá)水平，如果所述腫瘤具有的RSPO1表達(dá)水平與正常組織中RSPO1的水平相比升高，則選擇所述受試對(duì)象以用特異性結(jié)合RSPO1的抗體進(jìn)行治療。如果選定用于治療，則對(duì)所述受試對(duì)象施用本文描述的抗-RSPO1抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體89M5。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有的腫瘤已經(jīng)除去。例如，在一些實(shí)施方式中，確定腫瘤中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表達(dá)水平，如果所述腫瘤具有的RSPO2表達(dá)水平與正常組織中RSPO2的水平相比升高，則選擇所述受試對(duì)象以用特異性結(jié)合RSPO2的抗體進(jìn)行治療。如果選定用于治療，則對(duì)所述受試對(duì)象施用本文描述的抗-RSPO2抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO2抗體是抗體130M23。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO2抗體是抗體h130M23-H1L2。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO2抗體是抗體h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有的腫瘤已經(jīng)除去。本發(fā)明提供選擇用RSPO-結(jié)合劑治療的人受試對(duì)象的方法，所述方法包括確定所述受試對(duì)象是否具有至少一種RSPO蛋白的表達(dá)水平升高的腫瘤，其中如果所述腫瘤具有的至少一種RSPO蛋白的表達(dá)水平升高，則選擇所述受試對(duì)象以用特異性結(jié)合表達(dá)水平升高的RSPO蛋白的抗體進(jìn)行治療。本發(fā)明提供選擇用RSPO-結(jié)合劑治療的人受試對(duì)象的方法，所述方法包括確定所述受試對(duì)象是否具有至少一種RSPO蛋白的表達(dá)水平高的腫瘤，其中如果所述腫瘤具有的至少一種RSPO蛋白的表達(dá)水平高，則選擇所述受試對(duì)象以用特異性結(jié)合表達(dá)水平高的RSPO蛋白的抗體進(jìn)行治療。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)水平“升高”或“高”是與相同組織類(lèi)型的正常組織中的相同RSPO蛋白的表達(dá)水平相比。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)水平“升高”或“高”是與相同腫瘤類(lèi)型的其他腫瘤中的相同RSPO蛋白的表達(dá)水平相比。在一些實(shí)施方式中，如果選定用于治療，則對(duì)所述受試對(duì)象施用本文描述的RSPO-結(jié)合劑或抗體。在一些實(shí)施方式中，所述受試對(duì)象具有的腫瘤已經(jīng)除去。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO1-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體89M5。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO1抗體是抗體h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO2-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體130M23。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO2抗體是抗體h130M23-H1L2。在一些實(shí)施方式中，所述抗-RSPO2抗體是抗體h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO3-結(jié)合劑。本發(fā)明還提供治療人受試對(duì)象中的癌的方法，所述方法包括：(a)基于或至少部分基于具有RSPO1的表達(dá)水平升高或高的癌的受試對(duì)象選擇受試對(duì)象，和(b)對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的本文描述的RSPO1-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體89M5。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體h89M5-H2L2。本發(fā)明還提供治療人受試對(duì)象中的癌的方法，所述方法包括：(a)基于或至少部分基于具有RSPO2的表達(dá)水平升高或高的癌的受試對(duì)象選擇受試對(duì)象，和(b)對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的本文描述的RSPO2-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體130M23。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體h130M23-H1L2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體h130M23-H1L6。本發(fā)明還提供治療人受試對(duì)象中的癌的方法，所述方法包括：(a)基于或至少部分基于具有RSPO3的表達(dá)水平升高或高的癌的受試對(duì)象選擇受試對(duì)象，和(b)對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的本文描述的RSPO3-結(jié)合劑。用于確定細(xì)胞、腫瘤或癌中RSPO的表達(dá)水平的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些方法包括但不限于，用于核酸表達(dá)的基于PCR的檢驗(yàn)、微陣列分析和核苷酸測(cè)序(例如NextGen測(cè)序)。其他方法包括但不限于，用于蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析、蛋白質(zhì)陣列、ELISA和FACS。用于確定腫瘤或癌是否具有升高水平或高水平的RSPO表達(dá)的方法可以使用各種樣品。在一些實(shí)施方式中，所述樣品取自具有腫瘤或癌的受試對(duì)象。在一些實(shí)施方式中，所述樣品是新鮮腫瘤/癌樣品。在一些實(shí)施方式中，所述樣品是冷凍腫瘤/癌樣品。在一些實(shí)施方式中，所述樣品是福爾馬林-固定的石蠟包埋樣品。在一些實(shí)施方式中，將所述樣品處理成細(xì)胞裂解物。在一些實(shí)施方式中，將所述樣品處理成DNA或RNA。還提供治療受試對(duì)象中疾病或病癥的方法，其中所述疾病或病癥與異常(例如，水平增加)的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)。還提供治療受試對(duì)象中疾病或病癥的方法，其中所述疾病或病癥的特征在于干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的水平增加。在一些實(shí)施方式中，所述治療方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑、多肽或抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO1-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體89M5。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO2-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體130M23。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體h130M23-H1L2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO3-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑是抗體。本發(fā)明還提供抑制細(xì)胞中β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與有效量的RSPO-結(jié)合劑接觸。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述方法是體內(nèi)方法，其中使細(xì)胞與RSPO-結(jié)合劑接觸的步驟包括對(duì)受試對(duì)象施用治療有效量的所述RSPO-結(jié)合劑的步驟。在一些實(shí)施方式中，所述方法是體外或離體方法。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑抑制β-連環(huán)素的激活。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑干擾RSPO/LGR相互作用。在一些實(shí)施方式中，所述LGR是LGR4、LGR5和/或LGR6。在一些實(shí)施方式中，所述LGR是LGR4。在一些實(shí)施方式中，所述LGR是LGR5。在一些實(shí)施方式中，所述LGR是LGR6。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO1-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體89M5。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO2-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體130M23。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體h130M23-H1L2。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO3-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑是抗體。還提供本文描述的RSPO-結(jié)合劑、多肽或抗體在誘導(dǎo)細(xì)胞(包括但不限于腫瘤細(xì)胞)分化中的應(yīng)用。在一些實(shí)施方式中，誘導(dǎo)細(xì)胞分化的方法包括使所述細(xì)胞與有效量的本文描述的RSPO-結(jié)合劑(例如，抗-RSPO抗體)接觸。在一些實(shí)施方式中，誘導(dǎo)受試對(duì)象的腫瘤中細(xì)胞分化的方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑、多肽或抗體。在一些實(shí)施方式中，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上的分化標(biāo)記的方法包括施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑、多肽或抗體。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是實(shí)體腫瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤選自由以下腫瘤組成的組：結(jié)直腸瘤、胰腺瘤、肺瘤、卵巢瘤、肝瘤、乳腺瘤、腎瘤、前列腺瘤、胃腸瘤、黑素瘤、子宮頸瘤、膀胱瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及頭頸瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是卵巢瘤。在一些其他實(shí)施方式中，所述腫瘤是結(jié)腸瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是肺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述方法是體內(nèi)方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法是體外方法。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO1-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體89M5。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO2-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體130M23。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO3-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑是抗體。本發(fā)明還提供將致瘤性細(xì)胞分化成非致瘤性細(xì)胞的方法，所述方法包括使所述致瘤性細(xì)胞與RSPO-結(jié)合劑接觸的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括對(duì)具有包含致瘤性細(xì)胞或已經(jīng)除去此類(lèi)腫瘤的受試對(duì)象施用所述RSPO-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述致瘤性細(xì)胞是卵巢瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述致瘤性細(xì)胞是結(jié)腸瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述致瘤性細(xì)胞是肺瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO1-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO1-結(jié)合劑是抗體89M5。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO2-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO2-結(jié)合劑是抗體130M23。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是RSPO3-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO3-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，用本文描述的RSPO-結(jié)合劑治療的疾病不是癌。例如，所述疾病可以是代謝性疾病，例如肥胖癥或糖尿病(例如，II型糖尿病)(JinT.,2008,Diabetologia,51:1771-80)。作為選擇，所述疾病可以是骨病，例如骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(CorrM.,2008,Nat.Clin.Pract.Rheumatol.,4:550-6；Day等,2008,BoneJointSurg.Am.,90Suppl1:19-24)。所述疾病還可以是腎病，例如多囊性腎病(Harris等,2009,Ann.Rev.Med.,60:321-337；Schmidt-Ott等,2008,KidneyInt.,74:1004-8；Benzing等,2007,J.Am.Soc.Nephrol.,18:1389-98)。作為選擇，可以治療眼病，包括但不限于黃斑退化和家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變(Lad等,2009,StemCellsDev.,18:7-16)。還可以治療心血管疾病，包括心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化和瓣膜障礙(Al-AlyZ.,2008,Transl.Res.,151:233-9；Kobayashi等,2009,Nat.CellBiol.,11:46-55；vanGijn等,2002,Cardiovasc.Res.,55:16-24；Christman等,2008,Am.J.Physiol.HeartCirc.Physiol.,294:H2864-70)。在一些實(shí)施方式中，所述疾病是肺病，例如特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓或肺纖維癥(Laumanns等,2008,Am.J.Respir.CellMol.Biol.,2009,40:683-691；等,2008,PLoSONE,3:e2142)。在一些實(shí)施方式中，用所述RSPO-結(jié)合劑治療的疾病是肝病，例如肝硬化或肝纖維癥(Cheng等,2008,Am.J.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol.,294:G39-49)。本發(fā)明還提供包含本文描述的RSPO-結(jié)合劑的藥物組合物。在一些實(shí)施方式中，所述藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的載劑。這些藥物組合物可應(yīng)用在抑制受試對(duì)象(例如，人患者)中的腫瘤生長(zhǎng)和治療受試對(duì)象(例如，人患者)中的癌方面。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)將本發(fā)明的經(jīng)純化抗體或試劑與藥學(xué)上可接受的載劑(例如載體或賦性劑)組合而制備制劑以用于貯存和使用。合適的藥學(xué)上可接受的載劑包括但不限于：非毒性緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；鹽，例如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑，例如十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六烴季銨(hexamethonium)、苯扎氯銨、芐索氯銨、酚、丁基醇或芐基醇、烷基對(duì)羥基苯甲酸酯(例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇和間甲酚；低分子量多肽(例如，小于約10個(gè)氨基酸殘基)；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、凝膠蛋白或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；碳水化合物，例如單糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬絡(luò)合物，例如Zn-蛋白絡(luò)合物；和非離子表面活性劑，例如TWEEN或聚乙二醇(PEG)(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第21版，2005,UniversityoftheSciencesinPhiladelphia,PA)。本發(fā)明的藥物組合物可以以任何方式施用，以用于局部或全身治療。施用可以通過(guò)下述方式進(jìn)行：通過(guò)表皮或透皮貼劑、油膏劑、乳液劑、膏劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末的局部施用；通過(guò)吸入或吹入粉末或氣溶膠而肺部給藥，包括通過(guò)噴霧器、氣管內(nèi)和鼻內(nèi)；口服施用；或胃腸外施用，包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)(例如注射或輸注)或顱內(nèi)(例如鞘內(nèi)或心室內(nèi))。治療制劑可以是單位劑量形式。此類(lèi)制劑包括片劑、丸劑、膠囊劑、粉末劑、顆粒劑、水或非水性介質(zhì)中的溶液劑或懸浮劑、或者栓劑。在諸如片劑等固體組合物中，將主要活性成分與藥物載劑混合。常規(guī)制片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或膠以及稀釋劑(例如水)?？梢允褂盟麄儊?lái)形成固體預(yù)制劑組合物，所述組合物含有本發(fā)明的化合物或其非毒性藥學(xué)上可接受鹽的均勻混合物。然后將固體預(yù)制劑組合物細(xì)分成上述類(lèi)型的單位劑型?？梢詫⑺鲋苿┗蚪M合物的片劑、丸劑等包被或配合，來(lái)提供賦予延長(zhǎng)作用的優(yōu)點(diǎn)。例如，片劑或丸劑可以包含被外部組分覆蓋的內(nèi)部組合物。此外，所述兩種組分可以通過(guò)腸衣分開(kāi)，所述腸衣用于抵抗崩解和允許內(nèi)部組分完整地通過(guò)胃或允許延遲釋放?？梢詫⒏鞣N材料用于此類(lèi)腸衣或包衣，此類(lèi)材料包括許多聚合性酸，以及聚合性酸與諸如蟲(chóng)膠、十六烷醇和乙酸纖維素的混合物。本文描述的RSPO-結(jié)合劑或抗體還可以包封入微膠囊中。此類(lèi)微膠囊可以分別例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合而制備，例如，羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊)中或在巨乳液(macroemulsion)，如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第21版，2005,UniversityoftheSciencesinPhiladelphia,PA中所述。在一些實(shí)施方式中，藥物組合物包括與脂質(zhì)體復(fù)合的本發(fā)明的RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)。生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，一些脂質(zhì)體可以通過(guò)具有包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物進(jìn)行反相蒸發(fā)而生產(chǎn)。脂質(zhì)體通過(guò)規(guī)定孔徑的過(guò)濾器進(jìn)行擠出，以產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體。在一些實(shí)施方式中，可以生產(chǎn)緩釋制品。緩釋制品的合適實(shí)例包括含有RSPO-結(jié)合劑(例如抗體)的固體疏水性聚合物的半滲透基質(zhì)，其中所述基質(zhì)是成型品的形式(例如膜或微膠囊)。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、諸如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚(乙烯醇)等水凝膠、聚乳酸、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物(例如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和亮氨酰脯氨酸醋酸鹽組成的可注射微球))、蔗糖乙酸異丁酸酯和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。在一些實(shí)施方式中，除了施用RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)之外，所述方法或治療還包括施用至少一種另外的治療劑?？梢栽谑┯盟鯮SPO-結(jié)合劑之前、與其同時(shí)和/或之后施用另外的治療劑。還提供包含RSPO-結(jié)合劑和所述另外的治療劑的藥物組合物。在一些實(shí)施方式中，至少一種另外的治療劑包括1種、2種、3種或更多種另外的治療劑。施用兩種以上治療劑的組合治療通常使用通過(guò)不同作用機(jī)制起作用的試劑，但不是必須如此。施用具有不同作用機(jī)制的試劑的組合治療可以產(chǎn)生加合或協(xié)同效應(yīng)。組合治療可以允許每種試劑的劑量比單藥治療使用的劑量更低，由此減少毒性副作用和/或增加所述試劑的治療指數(shù)。組合治療可以減少發(fā)展抗性癌細(xì)胞的可能性。在一些實(shí)施方式中，組合治療包含影響(例如抑制或殺死)非致瘤性細(xì)胞的治療劑和影響(例如抑制或殺死)致瘤性CSC的治療劑。在一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑與至少一種另外的治療劑的組合產(chǎn)生加合或協(xié)同結(jié)果。在一些實(shí)施方式中，所述組合治療導(dǎo)致所述RSPO-結(jié)合劑的治療指數(shù)的增加。在一些實(shí)施方式中，所述組合治療導(dǎo)致所述另外試劑的治療指數(shù)的增加。在一些實(shí)施方式中，所述組合治療導(dǎo)致所述RSPO-結(jié)合劑的毒性和/或副作用的降低。在一些實(shí)施方式中，所述組合治療導(dǎo)致所述另外試劑的毒性和/或副作用的降低。治療劑的有用類(lèi)別包括例如：抗微管蛋白劑、奧利斯達(dá)汀(auristatin)、DNA小槽結(jié)合劑、DNA復(fù)制抑制劑、烷基化劑(例如鉑絡(luò)合物，例如順鉑、單(鉑)、雙(鉑)和三核鉑絡(luò)合物以及卡鉑)、蒽環(huán)類(lèi)化合物、抗生素、抗葉酸藥、抗代謝藥、化學(xué)治療敏化劑、倍癌霉素(duocarmycin)、依托泊苷、氟嘧啶、離子載體(ionophore)、雷昔托普辛(lexitropsin)、亞硝基脲、順氯氨鉑(platinol)、嘌呤抗代謝藥、嘌呤霉素、放射敏化劑、類(lèi)固醇、紫杉烷、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑或長(zhǎng)春花生物堿等。在一些實(shí)施方式中，第二治療劑是烷基化劑、抗代謝藥、抗有絲分裂劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑或血管生成抑制劑。在一些實(shí)施方式中，所述第二治療劑是鉑絡(luò)合物，例如卡鉑或順鉑。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是與紫杉烷組合的鉑絡(luò)合物?？梢耘c所述RSPO-結(jié)合劑組合施用的治療劑包括化學(xué)治療劑。因此，在一些實(shí)施方式中，所述方法或治療包括與化學(xué)治療劑或多種不同化學(xué)治療劑的雞尾酒劑組合施用本發(fā)明的RSPO1-結(jié)合劑或抗體。在一些實(shí)施方式中，所述方法或治療包括與化學(xué)治療劑或多種不同化學(xué)治療劑的雞尾酒劑組合施用本發(fā)明的RSPO2-結(jié)合劑或抗體。在一些實(shí)施方式中，所述方法或治療包括與化學(xué)治療劑或多種不同化學(xué)治療劑的雞尾酒劑組合施用本發(fā)明的RSPO3-結(jié)合劑或抗體。用RSPO-結(jié)合劑(例如抗體)進(jìn)行治療可以在施用化療劑之前、與其同時(shí)或之后發(fā)生。組合施用可以包括在單獨(dú)的藥物制劑中或使用單獨(dú)的制劑共施用，或者以任意順序連續(xù)施用(但通常在一定時(shí)間段內(nèi))，從而使所有活性劑能夠同時(shí)發(fā)揮其生物活性。此類(lèi)化學(xué)治療劑的制備和給藥可以根據(jù)制造商說(shuō)明使用，或者由熟練的從業(yè)者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。此類(lèi)化療劑的制備和給藥方案還描述于TheChemotherapySourceBook,第4版，2008,M.C.Perry編,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA.中。用于本發(fā)明的化學(xué)治療劑包括但不限于：烷基化劑，例如噻替派和環(huán)磷酰胺(CYTOXAN)；烷基磺酸鹽，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三乙撐蜜胺、三乙撐磷酰胺、三乙撐硫代磷酰胺和三羥甲基蜜胺；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磺丙脲(cholophosphamide)、磷雌氮芥、異環(huán)磷酰胺、氮芥、鹽酸氧氮芥、苯丙氨酸氮芥、新氮芥、苯芥膽甾醇、松龍苯芥、氯乙環(huán)磷酰胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲，例如雙氯乙基亞硝脲、氯脲菌素、福莫司汀、環(huán)己亞硝脲、嘧啶亞硝脲、雷莫司?。豢股?，例如阿克拉霉素、放射菌素、安曲霉素、重氮絲氨酸、博來(lái)霉素、放線菌素C、刺孢霉素、卡柔比星、洋紅霉素、嗜癌霉素、色霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、去甲氧基柔紅霉素、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、派來(lái)霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈唑霉素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、新制癌菌素、佐柔比星；抗代謝藥，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類(lèi)似物，例如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸、三甲曲沙；嘌呤類(lèi)似物，例如氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫唑鳥(niǎo)嘌呤、硫鳥(niǎo)嘌呤；嘧啶類(lèi)似物，例如環(huán)胞苷、氮雜胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他賓、氟尿嘧啶脫氧核苷、5-FU；雄激素，例如卡魯睪酮、屈他雄酮丙酸酯、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺藥(anti-adrenal)，例如氨苯哌酮、米托坦、曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充劑，例如亞葉酸(frolinicacid)；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸；安吖啶；比達(dá)布昔(bestrabucil)；比山群；依達(dá)曲沙；磷胺氮芥(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鳥(niǎo)氨酸(elfornithine)；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；二胺硝吖啶；噴司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基肼；甲基芐肼；PSK；丙亞胺；西佐喃；鍺螺胺；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；烏拉坦；長(zhǎng)春酰胺；氮烯咪胺；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿糖胞嘧啶(Ara-C)；紫杉烷類(lèi)，例如紫杉醇(TAXOL)和多西他賽(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥(niǎo)嘌呤；巰基嘌呤；鉑類(lèi)似物，例如順鉑和卡鉑；長(zhǎng)春堿；鉑；依托泊苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng)春瑞濱；諾維本；諾消靈；替尼泊苷；道諾霉素；氨喋呤；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DMFO)；視黃酸；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他濱(XELODA)；以及上述任何一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物?；瘜W(xué)治療劑還包括用于調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素劑，例如抗雌激素劑包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮和托瑞米芬(FARESTON)；以及抗雄激素劑例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任何一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是順鉑。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是卡鉑。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是紫杉醇(紫杉酚)。在一些實(shí)施方式中，方法包括與順鉑組合施用抗-RSPO1抗體89M5或h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，方法包括與順鉑組合施用抗-RSPO2抗體130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述化學(xué)治療劑是拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑是干擾拓?fù)洚悩?gòu)酶(例如拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II)的作用的化學(xué)治療劑。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑包括但不限于鹽酸多柔比星、檸檬酸道諾霉素、鹽酸米托蒽醌、放射菌素D、依托泊苷、鹽酸托泊替康、替尼泊苷(VM-26)和依立替康，以及他們中任何一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是依立替康。因此，在一些實(shí)施方式中，所述治療方法包括與拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑組合施用RSPO1-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，方法包括與依立替康組合施用抗-RSPO1抗體89M5或h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，方法包括與拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑組合施用RSPO2-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，方法包括與依立替康組合施用抗-RSPO2抗體130M23或h130M23-H1L2。在一些實(shí)施方式中，所述化學(xué)治療劑是抗代謝藥?？勾x藥是這樣的化學(xué)品：其與正常生化反應(yīng)所需的代謝物具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)，但是不同之處足以干擾細(xì)胞的一種或多種正常功能，例如細(xì)胞分裂?？勾x藥包括但不限于，吉西他濱、氟尿嘧啶、卡培他濱、甲氨蝶呤鈉、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞、替加氟、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鳥(niǎo)嘌呤、5-阿扎胞苷、6-巰基嘌呤、咪唑硫嘌呤、6-硫鳥(niǎo)嘌呤、噴司他丁、磷酸氟達(dá)拉濱和克拉屈濱，以及他們中任何一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是吉西他濱。因此，在一些實(shí)施方式中，方法包括與抗代謝藥組合施用RSPO1-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，方法包括與吉西他濱組合施用抗-RSPO1抗體89M5或h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，方法包括與抗代謝藥組合施用RSPO2-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，方法包括與吉西他濱組合施用抗-RSPO2抗體130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，所述化學(xué)治療劑是抗有絲分裂劑，其包括但不限于結(jié)合微管蛋白的試劑。在一些實(shí)施方式中，所述試劑是紫杉烷。在一些實(shí)施方式中，所述試劑是紫杉醇或多西他賽，或紫杉醇或多西他賽的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實(shí)施方式中，所述試劑是紫杉醇(TAXOL)、多西他賽(TAXOTERE)、結(jié)合有白蛋白的紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-紫杉醇或PG-紫杉醇。在一些替代實(shí)施方式中，所述抗有絲分裂劑包括長(zhǎng)春花生物堿，例如長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春瑞濱或長(zhǎng)春地辛，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實(shí)施方式中，所述抗有絲分裂劑是驅(qū)動(dòng)蛋白Eg5的抑制劑或諸如AuroraA或Plk1等有絲分裂激酶的抑制劑。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)與RSPO-結(jié)合劑組合施用的化學(xué)治療劑是抗有絲分裂劑時(shí)，正在治療的癌或腫瘤是乳腺癌或乳腺瘤。在一些實(shí)施方式中，另外的治療劑包括諸如小分子等試劑。例如，治療可以包括組合施用本發(fā)明的RSPO-結(jié)合劑(例如抗體)與小分子，所述小分子充當(dāng)針對(duì)另外的腫瘤相關(guān)抗原的抑制劑，所述抗原包括但不限于EGFR、ErbB2、HER2和/或VEGF。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是抑制癌干細(xì)胞途徑的小分子。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是Notch途徑的抑制劑。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是Wnt途徑的抑制劑。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是BMP途徑的抑制劑。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的分子。在一些實(shí)施方式中，另外的治療劑包含生物分子，例如抗體。例如，治療可以包括組合施用本發(fā)明的RSPO-結(jié)合劑(例如抗體)與其他抗體，所述其他抗體針對(duì)另外的腫瘤相關(guān)抗原，其包括包括但不限于結(jié)合EGFR、ErbB2、HER2和/或VEGF的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是第二抗-RSPO抗體。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是與抗-RSPO1抗體組合使用的抗-RSPO2抗體、抗-RSPO3抗體和/或抗-RSPO4抗體。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是與抗-RSPO2抗體組合使用的抗-RSPO1抗體、抗-RSPO3抗體和/或抗-RSPO4抗體。在一些實(shí)施方式中，抗-RSPO1抗體與抗-RSPO2抗體組合使用。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是對(duì)抗癌干細(xì)胞標(biāo)記物具有特異性的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是結(jié)合Notch途徑的組分的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是結(jié)合Wnt途徑的組分的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是抑制癌干細(xì)胞途徑的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是Notch途徑的抑制劑。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是Wnt途徑的抑制劑。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是BMP途徑的抑制劑。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是作為血管生成抑制劑的抗體(例如，抗-VEGF或VEGF受體抗體)。在一些實(shí)施方式中，所述另外的治療劑是貝伐單抗(AVASTIN)、曲妥單抗(HERCEPTIN)、帕尼單抗(VECTIBIX)或西妥昔單抗(ERBITUX)。在一些實(shí)施方式中，本文描述的方法包括與Wnt途徑抑制劑組合施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述Wnt途徑抑制劑是卷曲蛋白(FZD)結(jié)合劑(“FZD-結(jié)合劑”)。FZD-結(jié)合劑的非限制性實(shí)例可見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,982,013，本文通過(guò)參考并入其全部?jī)?nèi)容。FZD-結(jié)合劑可以包括但不限于抗-FZD抗體。在一些實(shí)施方式中，方法包括與抗-FZD抗體組合施用RSPO-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，方法包括與抗-FZD抗體18R5組合施用RSPO-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述Wnt途徑抑制劑是Wnt蛋白結(jié)合劑(“Wnt-結(jié)合劑”)。Wnt-結(jié)合劑的非限制性實(shí)例可見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,723,477和7,947,277以及國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO2011/088127和WO2011/088123中，本文通過(guò)參考并入其全部?jī)?nèi)容。Wnt-結(jié)合劑可以包括但不限于抗-Wnt抗體和FZD-Fc可溶性受體。在一些實(shí)施方式中，方法包括與FZD-Fc可溶性受體組合施用RSPO-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，方法包括與FZD8-Fc可溶性受體組合施用RSPO-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，方法包括與抗-FZD抗體組合施用RSPO1-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，方法包括與抗-FZD抗體組合施用抗-RSPO1抗體89M5或h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，方法包括與抗-FZD抗體18R5組合施用抗-RSPO1抗體89M5或h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，方法包括與FZD-Fc可溶性受體組合施用抗-RSPO1抗體89M5或h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，方法包括與FZD8-Fc可溶性受體組合施用抗-RSPO1抗體89M5或h89M5-H2L2。在一些實(shí)施方式中，方法包括與抗-FZD抗體組合施用RSPO2-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，方法包括與抗-FZD抗體組合施用抗-RSPO2抗體130M23或h130M23-H1L2。在一些實(shí)施方式中，方法包括與抗-FZD抗體18R5組合施用抗-RSPO2抗體130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，方法包括與FZD-Fc可溶性受體組合施用抗-RSPO2抗體130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，方法包括與FZD8-Fc可溶性受體組合施用抗-RSPO2抗體130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，本文描述的方法包括與超過(guò)一種另外的治療劑組合施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑。因此，在一些實(shí)施方式中，所述治療方法包括與化學(xué)治療劑和Wnt途徑抑制劑組合施用RSPO-結(jié)合劑。因此，在一些實(shí)施方式中，所述治療方法包括與化學(xué)治療劑和Wnt途徑抑制劑組合施用RSPO2-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，方法包括與化學(xué)治療劑和抗-FZD抗體18R5組合施用RSPO2-結(jié)合劑。因此，在一些實(shí)施方式中，所述治療方法包括與化學(xué)治療劑和FZD8-Fc可溶性受體組合施用RSPO2-結(jié)合劑。因此，在一些實(shí)施方式中，所述治療方法包括與吉西他濱和Wnt途徑抑制劑組合施用RSPO2-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，方法包括與吉西他濱和抗-FZD抗體18R5組合施用抗-RSPO2抗體130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。在一些實(shí)施方式中，方法包括與吉西他濱和FZD8-Fc可溶性受體組合施用抗-RSPO2抗體130M23、h130M23-H1L2或h130M23-H1L6。此外，用本文描述的RSPO-結(jié)合劑進(jìn)行治療可以包括與諸如一種或多種細(xì)胞因子(例如，淋巴因子、白介素、腫瘤壞死因子和/或生長(zhǎng)因子)等另外的生物分子組合治療，或可以伴隨通過(guò)手術(shù)除去腫瘤、癌細(xì)胞或任何其他治療醫(yī)師認(rèn)為必須的療法。在一些實(shí)施方式中，所述治療包括與放射性治療組合施用本發(fā)明的RSPO-結(jié)合劑(例如抗體)。用RSPO-結(jié)合劑進(jìn)行治療可以在施加放射性療法之前、與其同時(shí)或之后發(fā)生。此類(lèi)放射性療法的給藥方案可由熟練的醫(yī)學(xué)從業(yè)者確定。組合施用可以包括在單獨(dú)的藥物制劑中或使用單獨(dú)的制劑共施用，或者以任意順序連續(xù)施用(但通常在一定時(shí)間段內(nèi))，從而使所有活性劑能夠同時(shí)發(fā)揮其生物活性。應(yīng)該意識(shí)到，RSPO-結(jié)合劑與至少一種另外的治療劑的組合可以以任意順序或同時(shí)施用。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑可以對(duì)之前已經(jīng)施用第二治療劑進(jìn)行治療的患者施用。在一些其他實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑和第二治療劑可以基本上同時(shí)或同時(shí)施用。例如，可以對(duì)受試對(duì)象給藥RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)，并同時(shí)用第二治療劑(例如化療劑)進(jìn)行治療過(guò)程。在一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑在用第二治療劑治療1年內(nèi)施用。在一些替代實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑在用第二治療劑進(jìn)行任何治療10、8、6、4或2個(gè)月內(nèi)施用。在一些其他實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑在用第二治療劑進(jìn)行任何治療4、3、2或1周內(nèi)施用。在一些其他實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑在用第二治療劑進(jìn)行任何治療5、4、3、2或1天內(nèi)施用。應(yīng)該進(jìn)一步意識(shí)到，兩種(或更多種)試劑或治療可以在大約數(shù)小時(shí)或數(shù)分鐘內(nèi)(即基本上同時(shí))施用。為了治療疾病，本發(fā)明的RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)的合適劑量取決于待治療的疾病類(lèi)型、疾病的嚴(yán)重性和歷程、疾病的響應(yīng)性，所述RSPO-結(jié)合劑抗體是用于治療性目的施用還是預(yù)防性目的施用、之前的治療和患者的臨床史等等，所有這些都由治療醫(yī)師裁量。所述RSPO-結(jié)合劑或抗體可以一次施用或在持續(xù)從數(shù)天至數(shù)月的一系列治療中施用，或直到達(dá)到治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的縮減(例如腫瘤尺寸的減小)。最佳給藥方案可以從患者體內(nèi)的藥物累積的測(cè)量結(jié)果計(jì)算，并且會(huì)根據(jù)個(gè)體抗體或試劑的相對(duì)效力而不同。給藥醫(yī)師可以容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)速率。在一些實(shí)施方式中，劑量為0.01μg/kg體重～100mg/kg體重、0.1μg/kg體重～100mg/kg體重、1μg/kg體重～100mg/kg體重、1mg/kg體重～100mg/kg體重、1mg/kg體重～80mg/kg體重、10mg/kg體重～100mg/kg體重、10mg/kg體重～75mg/kg體重或10mg/kg體重～50mg/kg體重。在一些實(shí)施方式中，抗體或其他RSPO-結(jié)合劑的劑量為約0.1mg/kg體重～約20mg/kg體重。在一些實(shí)施方式中，可以每天、每周、每月或每年一次或多次給予劑量。在一些實(shí)施方式中，每周一次、每?jī)芍芤淮位蛎咳芤淮谓o予所述抗體或其他RSPO-結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)可以以起始較高的“加載”劑量施用，然后施用一次或多次較低的劑量。在一些實(shí)施方式中，也可以改變施用頻率。在一些實(shí)施方式中，給藥方案可以包括施用起始劑量，然后每周一次、每?jī)芍芤淮?、每三周一次或每月一次施用另外的劑?或“維持”劑量)。例如，給藥方案可以包括施用起始加載劑量，然后每周施用為起始劑量一半的維持劑量?；蛘呓o藥方案可以包括施用起始加載劑量，然后每隔一周施用為起始劑量一半的維持劑量?；蛘呓o藥方案可以包括3周施用3次起始劑量，然后每隔一周施用例如為相同量的維持劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員還已知，施用任何治療劑都可以產(chǎn)生副作用和/或毒性。在一些情況下，副作用和/或毒性如此嚴(yán)重以致于妨礙以治療有效量施用特定的試劑。在一些情況下，藥物治療必須中斷，并且可以嘗試其他試劑。但是，相同治療類(lèi)別中的許多試劑通常展示相似的副作用和/或毒性，這意味著患者要么必須停止療法，要么如果可能的話，就要遭受與所述治療劑相關(guān)的令人不愉快的副作用。因此，本發(fā)明提供治療受試對(duì)象中的癌的方法，所述方法使用間歇性給藥策略來(lái)施用一種或多種試劑，這可以減少與施用RSPO-結(jié)合劑、化學(xué)治療劑等相關(guān)的副作用和/或毒性。在一些實(shí)施方式中，治療人受試對(duì)象中的癌的方法包括與治療有效量的化學(xué)治療劑組合對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑，其中所述試劑中的一種或兩種根據(jù)間歇性給藥策略施用。在一些實(shí)施方式中，所述間歇性給藥策略包括對(duì)受試對(duì)象施用起始劑量的RSPO-結(jié)合劑，并約每2周1次施用RSPO-結(jié)合劑的后續(xù)劑量。在一些實(shí)施方式中，所述間歇性給藥策略包括對(duì)受試對(duì)象施用起始劑量的RSPO-結(jié)合劑，并約每3周1次施用RSPO-結(jié)合劑的后續(xù)劑量。在一些實(shí)施方式中，所述間歇性給藥策略包括對(duì)受試對(duì)象施用起始劑量的RSPO-結(jié)合劑，并約每4周1次施用RSPO-結(jié)合劑的后續(xù)劑量。在一些實(shí)施方式中，使用間歇性給藥策略施用所述RSPO-結(jié)合劑，并且每周施用所述化學(xué)治療劑。V.包含RSPO-結(jié)合劑的試劑盒本發(fā)明提供包含本文描述的包含RSPO-結(jié)合劑(例如，抗體)的試劑盒，所述試劑盒可用于執(zhí)行本文描述的方法。在一些實(shí)施方式中，試劑盒包含在一個(gè)或多個(gè)容器中的針對(duì)至少一種人RSPO蛋白的至少一種經(jīng)純化抗體。在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒含有對(duì)于執(zhí)行檢查檢驗(yàn)所必需和/或充分的所有組件，包括實(shí)施檢驗(yàn)用的所有控制部件、導(dǎo)引部件，以及用于分析和顯示結(jié)果的任何必需軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地意識(shí)到，能夠容易地將本發(fā)明所公開(kāi)的RSPO-結(jié)合劑引入本領(lǐng)域公知的已建立試劑盒格式之一。還提供的是包含RSPO-結(jié)合劑(例如，抗-RSPO抗體)以及至少一種另外的治療劑的試劑盒。在一些實(shí)施方式中，所述第二(或更多的)治療劑是化學(xué)治療劑。一些實(shí)施方式中，所述第二(或更多的)治療劑是Wnt途徑抑制劑。在一些實(shí)施方式中，所述第二(或更多的)治療劑是血管生成抑制劑。本發(fā)明的實(shí)施方式能夠通過(guò)參考以下非限制性實(shí)例進(jìn)一步定義，所述非限制性實(shí)例詳細(xì)地描述了本發(fā)明的一些抗體的制備以及使用本發(fā)明的抗體的方法。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，無(wú)需背離本發(fā)明的范圍即可對(duì)材料和方法進(jìn)行許多改進(jìn)。實(shí)施例實(shí)施例1人腫瘤中RSPO和LGR的表達(dá)通過(guò)微陣列分析(GenelogicBioExpressDatasuite)分析來(lái)自腫瘤組織、大量人患者的良性腫瘤和惡性腫瘤樣品。該數(shù)據(jù)公開(kāi)了在數(shù)種腫瘤類(lèi)型(包括腎、子宮內(nèi)膜和卵巢)中相對(duì)于正常組織在惡性組織中RSPO1的表達(dá)水平升高。注意到RSPO1在卵巢癌中頻繁過(guò)表達(dá)(圖1A)。此外，該數(shù)據(jù)表明，在數(shù)種腫瘤類(lèi)型(包括卵巢、胰腺和肺)中相對(duì)于正常組織在惡性組織中RSPO3的表達(dá)水平升高。此外，據(jù)發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常組織在惡性胸腺瘤、結(jié)腸瘤、肺瘤和卵巢瘤織中LGR5和LGR6過(guò)表達(dá)，而LGR4在肺瘤中過(guò)表達(dá)。相對(duì)于其他乳腺瘤亞型，LGR5和LGR6過(guò)表達(dá)似乎局限于三重陰性(ERnegPRnegHER2neg)乳腺瘤。從在小鼠異種移植物中生長(zhǎng)的一系列人腫瘤中分離RNA。使用已建立的Affymetrix策略制備RNA樣品并對(duì)其進(jìn)行處理，以產(chǎn)生經(jīng)標(biāo)記cRNA。按照制造商的技術(shù)手冊(cè)將經(jīng)處理的RNA雜交至AffymetrixHG-U133plus2.0微陣列(Affymetrix,SantaClara,CA)。雜交后，對(duì)微陣列進(jìn)行洗滌、掃描和分析。使用GCRMA算法(Bioconductor,www.bioconductor.org)進(jìn)行經(jīng)掃描陣列的背景調(diào)整和信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)特定的人RSPO和人LGRs進(jìn)行評(píng)價(jià)：RSPO1(241450_at)、RSPO2(1554012_at)、RSPO3(228186_s_at)、RSPO4(237423_at)、LGR4(218326_s_at)、LGR5(210393_at)和LGR6(227819_at)。微陣列分析顯示，LGR4和LGR6在幾乎所有腫瘤中廣泛表達(dá)，發(fā)現(xiàn)許多腫瘤僅極大地過(guò)表達(dá)特定的RSPO家族成員和LGR5(表2)，但沒(méi)有將這些表達(dá)水平與正常組織中的表達(dá)水平比較。通常而言，只有一個(gè)RSPO家族成員在給定腫瘤中高度表達(dá)，表明在RSPO家族內(nèi)可能存在功能冗余。表2實(shí)施例2RSPO蛋白與LGR5的結(jié)合使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)通過(guò)將人LGR5的22～564位氨基酸連接至N末端FLAG標(biāo)記和連接至CD4的跨膜結(jié)構(gòu)域和C末端GFP蛋白生成細(xì)胞表面LGR5蛋白(FLAG-LGR5-CD4TM-GFP)。使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)生成RSPO-Fc構(gòu)建體。具體而言，將全長(zhǎng)人RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4框內(nèi)連接至人Fc區(qū)，使用桿狀病毒在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)重組RSPO-Fc蛋白。使用蛋白A色譜從昆蟲(chóng)培養(yǎng)基中純化融合蛋白。用FLAG-LGR5-CD4TM-GFP構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞。48小時(shí)后，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞懸浮在含有2％FBS和肝素的冰冷PBS中，在10μg/mlRSPO1-Fc、RSPO2-Fc、RSPO3-Fc、RSPO4-Fc或FZD8-Fc融合蛋白的存在下在冰上溫育15分鐘。進(jìn)行使用100μl綴合有PE的抗-人Fc第二抗體的第二溫育，以檢測(cè)由Fc融合蛋白結(jié)合的細(xì)胞。將細(xì)胞與作為陽(yáng)性對(duì)照的抗-FLAG抗體(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和與作為陰性對(duì)照的抗-PE抗體一起溫育。在FACSCalibur儀器(BDBiosciences,SanJose,CA)上分析所述細(xì)胞，使用FlowJo軟件處理數(shù)據(jù)。如圖2所示，RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4都與在HEK-293細(xì)胞表面上表達(dá)的LGR5結(jié)合，而陰性對(duì)照FZD8不結(jié)合LGR5。通過(guò)表面等離子共振對(duì)RSPO蛋白和LGR5之間的結(jié)合親和性進(jìn)行分析。使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)生成可溶性LGR5-Fc構(gòu)建體。具體而言，將人LGR5的1～564位氨基酸框內(nèi)連接至人Fc，并且使用桿狀病毒在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)重組LGR5-Fc融合蛋白。使用蛋白A色譜從昆蟲(chóng)培養(yǎng)基中純化LGR5-Fc融合蛋白。LGR5信號(hào)序列的切割產(chǎn)生含有LGR5的22～564位氨基酸的成熟LGR5-Fc融合蛋白。使用標(biāo)準(zhǔn)胺類(lèi)化學(xué)(NHS/EDC)在CM5芯片上固定重組RSPO1-Fc、RSPO2-Fc、RSPO3-Fc和RSPO4-Fc融合蛋白。將可溶性LGR5-Fc的雙倍稀釋液注射在芯片表面上(100nM～0.78nM)。使用來(lái)自BiacoreLifeSciences(GEHealthcare)的Biacore2000系統(tǒng)收集隨時(shí)間推移的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，使用同時(shí)全擬合方程(simultaneousglobalfitequation)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，以產(chǎn)生各RSPO蛋白的親合常數(shù)(KD值)(表3)。表3LGR5(nM)RSPO1110RSPO214RSPO3<1.0RSPO473人RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4都與LGR5結(jié)合，證明RSPO蛋白可以是LGR蛋白的配體。實(shí)施例3抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的體外測(cè)試為了制備細(xì)胞懸浮液，將在NOD/SCID小鼠中增殖的新鮮人肺腺癌異種移植物腫瘤(表2中的肺瘤#1)切碎，并且在含有300U/ml的3型膠原酶(Worthington,Lakewood,NJ)和200U/mlDNA酶I(Worthington,Lakewood,NJ)的培養(yǎng)基199(Invitrogen,Carlsbad,CA)中于37℃消化1～2小時(shí)。通過(guò)40μm尼龍濾器(BDFalcon,FranklinLakes,NJ)對(duì)肺瘤細(xì)胞進(jìn)行過(guò)濾，并在82×g旋轉(zhuǎn)5分鐘。將紅細(xì)胞在ACK緩沖液(0.8％氯化銨、0.1mMEDTA、10mM碳酸氫鈉、0.1NHCl)中裂解、洗滌，并在由HBSS(Mediatech,Manassas,VA)、25mMHEPES緩沖液(Mediatech,Manassas,VA)和2％熱失活胎牛血清(HI-FBS；Invitrogen,Carlsbad,CA)組成的培養(yǎng)基中以150×g離心5分鐘。通過(guò)在HI-FBS的墊子上以82×g離心8分鐘而除去死細(xì)胞和碎片。在用SM中的5μg/ml生物素綴合的抗-H-2Kd和2.5μg/ml抗小鼠CD45單克隆抗體(BioLegend,SanDiego,CA)染色后，每106細(xì)胞/ml使用50μlMagnaBind鏈親和素珠(ThermoScientific,Waltham,MA)使小鼠間質(zhì)細(xì)胞耗盡。為了制造條件培養(yǎng)基，在補(bǔ)充有B27補(bǔ)充劑(Invitrogen,Carlsbad,CA),胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒(Invitrogen,Carlsbad,CA)、青霉素-鏈霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)、0.5μg/ml氫化可的松(StemcellTechnologies,Vancouver,加拿大)、20ng/mlEGF(MBLInternational,Woburn,MA)、20ng/ml堿性FGF(MBLInternational,Woburn,MA)和5U/ml肝素(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的DMEM:F12(3:1)培養(yǎng)基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中培養(yǎng)肺瘤細(xì)胞。24小時(shí)后，收獲所述條件培養(yǎng)基(本文稱為“LT”)。用6xTCF-熒光素酶報(bào)告基因載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染STF-293細(xì)胞。在經(jīng)純化可溶性LGR5-Fc、FZD8-Fc、Jag-Fc融合蛋白(10μg/ml)、抗-FZD單克隆抗體(40μg/ml)或抗體LZ1(40μg/ml)的存在下，將1體積的肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基(LT)或?qū)φ张囵B(yǎng)基添加至STF-293細(xì)胞。此外，使用Wnt3aL細(xì)胞條件培養(yǎng)基作為陽(yáng)性對(duì)照，并且與肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基(LT)以1:4的最終稀釋度組合測(cè)試。使細(xì)胞溫育16小時(shí)，使用LuciferaseAssaySystem根據(jù)制造商說(shuō)明(Promega,Madison,WI)測(cè)定熒光素酶活性。將經(jīng)純化可溶性LGR5-Fc和FZD8-Fc融合蛋白的效應(yīng)與對(duì)照J(rèn)ag1-Fc蛋白比較，將抗-FZD單克隆抗體的效應(yīng)與對(duì)照抗細(xì)菌溶菌酶抗體LZ1比較。如圖3所示(左側(cè))，肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基(LT)含有增強(qiáng)Wnt3a-誘導(dǎo)的β-連環(huán)素活性的活性。在LT培養(yǎng)基中增強(qiáng)β-連環(huán)素活性的蛋白受到與RSPO蛋白結(jié)合的可溶性LGR5-Fc的抑制。該活性還被FZD8-Fc和抗-FZD抗體(為阻斷Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的試劑)抑制。可溶性Jag-Fc和LZ1不抑制所述活性。甚至在不存在Wnt3a時(shí)(圖3右側(cè))，所述LT培養(yǎng)基誘導(dǎo)β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。可溶性Jag-Fc和LZ1不抑制該活性。與之相反，可溶性LGR5-Fc抑制由LT培養(yǎng)基誘導(dǎo)的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)，將響應(yīng)減少至幾乎對(duì)照水平。該數(shù)據(jù)表明肺瘤細(xì)胞產(chǎn)生具有RSPO-樣活性的蛋白(或多種蛋白)，該活性被LGR5抑制，并且該活性區(qū)別于Wnt3a活性。使用利用肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基和卵巢瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基的共培養(yǎng)檢驗(yàn)進(jìn)行類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)。如上所述，將不含間質(zhì)細(xì)胞的新處理腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)基和細(xì)胞轉(zhuǎn)移至使用或不使用Wnt3aL細(xì)胞條件培養(yǎng)基的STF-293細(xì)胞。添加LGR5-Fc融合蛋白、FZD8-Fc融合蛋白或?qū)φ誇c融合蛋白(10μg/ml)。使所述細(xì)胞溫育20小時(shí)，并如上所述測(cè)定熒光素酶活性。如圖13所示，β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)活性通過(guò)腫瘤細(xì)胞和上清液誘導(dǎo)，并與Wnt3aL細(xì)胞條件培養(yǎng)基組合而得到進(jìn)一步增強(qiáng)(圖13A，肺瘤LU2；圖13B，肺瘤LU25；圖13C，卵巢瘤OV38)。FZD8-Fc(Wnt途徑抑制劑)將Wnt3a-誘導(dǎo)的β-連環(huán)素活性幾乎減少至背景水平，而LGR5-Fc強(qiáng)烈地減少了腫瘤衍生的β-連環(huán)素活性。如上所述，該數(shù)據(jù)表明肺瘤和卵巢瘤細(xì)胞產(chǎn)生具有RSPO-樣活性的蛋白(或多種蛋白)，該活性被LGR5抑制，并且該活性區(qū)別于Wnt3a活性。實(shí)施例4通過(guò)可溶性LGR5抑制RSPO活性的體外測(cè)試如實(shí)施例3中所述制備來(lái)自人肺瘤#1細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，如實(shí)施例2中所述制可溶性LGR5-Fc和RSPO2-Fc。用6xTCF-熒光素酶報(bào)告基因載體(TOPflash,Millipore,Billerica,MA)轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞。24至48小時(shí)后，將所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與含有肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基與25％Wnt3a-L-細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基或含有RSPO2(10ng/ml)與25％Wnt3a-L細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基一起溫育。將可溶性LGR5以20μg/ml～0.02μg/ml的4倍連續(xù)稀釋液添加至所述細(xì)胞。使用20μg/ml的可溶性Jag-Fc蛋白作為陰性對(duì)照，使用20μg/ml的FZD8-Fc蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照。使細(xì)胞溫育16小時(shí)，使用LuciferaseAssaySystem根據(jù)制造商說(shuō)明(Promega,Madison,WI)測(cè)定熒光素酶活性。如圖4所示，漸增濃度的可溶性LGR5-Fc減少了RSPO2-Fc與Wnt3a-條件培養(yǎng)基的組合(-□-)對(duì)熒光素酶活性的誘導(dǎo)，以及肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基和Wnt3a-條件培養(yǎng)基的組合(-■-)對(duì)熒光素酶活性的誘導(dǎo)。陰性對(duì)照J(rèn)ag-Fc蛋白不封閉所述熒光素酶活性，而會(huì)封閉Wnt3a的FZD8-Fc封閉了所述熒光素酶活性。重要的是，LGR5展示了與RSPO2蛋白和肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基相同的抑制EC50。該數(shù)據(jù)證明了由肺瘤細(xì)胞產(chǎn)生的具有RSPO-樣活性的蛋白被LGR5抑制，該行為與經(jīng)純化RSPO蛋白非常相似，并且表明肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的該活性可歸因于RSPO蛋白。實(shí)施例5抗-RSPO1單克隆抗體的生成針對(duì)重組人RSPO1蛋白31～263位氨基酸生成抗體(R&DSystems,Minneapolis,MN)。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用RSPO1蛋白對(duì)小鼠(n＝3)進(jìn)行免疫。在開(kāi)始免疫后70天使用FACS分析就RSPO1篩選來(lái)自個(gè)體小鼠的血清。在分離脾細(xì)胞以用于產(chǎn)生雜交瘤后選擇具有最高抗體滴度的動(dòng)物用于最后的抗原加強(qiáng)(antigenboost)。使用SP2/0細(xì)胞作為小鼠脾細(xì)胞的融合伴侶。以1細(xì)胞/孔將雜交瘤細(xì)胞在96孔板上鋪平板，并且針對(duì)人RSPO1通過(guò)FACS分析篩選上清液。為了FACS篩選抗-RSPO1抗體，構(gòu)建能夠使人RSPO1的N末端弗林蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞表面表達(dá)的嵌合融合蛋白。如圖5A所示，該融合蛋白含有N末端FLAG標(biāo)記和C末端綠色熒光蛋白標(biāo)記，所述N末端FLAG標(biāo)記在RSPO1的兩個(gè)弗林蛋白酶(furin)樣結(jié)構(gòu)域(氨基酸34～135)之后，并且融合至人CD4的跨膜細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(FLAG-RSPO1furin-CD4TM-GFP)。將HEK-293細(xì)胞用FLAG-RSPO1furin-CD4TM-GFP轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，將所轉(zhuǎn)染細(xì)胞懸浮在含有2％FBS和肝素的冰冷PBS中，并且在50μl雜交瘤上清液的存在下在冰上溫育30分鐘。進(jìn)行使用100μl綴合有PE的抗-人Fc第二抗體的第二溫育，以檢測(cè)由抗體結(jié)合的細(xì)胞。將細(xì)胞與作為陽(yáng)性對(duì)照的抗-FLAG抗體(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和作為陰性對(duì)照的抗-PE抗體一起溫育。在FACSCalibur儀器(BDBiosciences,SanJose,CA)上分析所述細(xì)胞，使用FlowJo軟件處理數(shù)據(jù)。鑒定結(jié)合RSPO1的數(shù)個(gè)雜交瘤，包括89M2、89M4、89M5、89M7、89M19和89M25(圖5B)。對(duì)來(lái)自數(shù)個(gè)這些抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序。分析后，發(fā)現(xiàn)抗體89M2、89M4、89M5和89M25包含相同的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。將表達(dá)抗體89M5的雜交瘤細(xì)胞系于2011年8月30日在布達(dá)佩斯條約的條件下保藏在ATCC(10801UniversityBoulevard,Manassas,VA,美國(guó))，并給予ATCC指定保藏號(hào)PTA-11970。89M5的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列是SEQIDNO:10和SEQIDNO:11。89M5的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列是SEQIDNO:19和SEQIDNO:20。89M5的重鏈CDR和輕鏈CDR列于本文表1中。89M5的重鏈和輕鏈的氨基酸序列是SEQIDNO:21和SEQIDNO:22；89M5的重鏈和輕鏈的核苷酸序列是SEQIDNO:23和SEQIDNO:24。實(shí)施例6抑制RSPO1誘導(dǎo)β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的抗-RSPO1單克隆抗體的鑒定用6xTCF-熒光素酶報(bào)告基因載體(TOPflash,Millipore,Billerica,MA)轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞。24至48小時(shí)后，將所轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞與Wnt3a(5ng/ml)和人RSPO1(10ng/ml,R&DBioSystems)的組合在抗-RSPO1抗體89M2、89M4、89M5、89M7、89M19和89M25的存在下一起溫育，或者與無(wú)關(guān)對(duì)照抗體254M14和254M26(10μg/ml～0.625μg/ml的2倍稀釋液)一起溫育。使細(xì)胞溫育16小時(shí)，使用LuciferaseAssaySystem根據(jù)制造商說(shuō)明(Promega,Madison,WI)測(cè)定熒光素酶活性。如圖6所示，抗-RSPO1抗體89M2、89M4、89M5和89M25每個(gè)都阻斷信號(hào)傳導(dǎo)，而抗-RSPO1抗體89M7和89M19不阻斷信號(hào)傳導(dǎo)。如通過(guò)對(duì)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序所確定的，抗體89M2、89M4、89M5和89M25都包含相同的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，因此推斷包含相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)果證明抗-RSPO1抗體能夠阻斷RSPO1-誘導(dǎo)的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。實(shí)施例7抗-RSPO1抗體阻斷可溶性RSPO1與LGR5的結(jié)合用FLAG-LGR5-CD4TM-GFP構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞(之前在實(shí)施例2中描述)。48小時(shí)后，將所轉(zhuǎn)染細(xì)胞懸浮在含有2％FBS和肝素的冰冷PBS中，并且在RSPO1-Fc蛋白(10μg/ml)和抗體89M2、89M4、89M5、89M7、89M19或89M25(10μg/ml)的存在下在冰上溫育。進(jìn)行使用100μl綴合有PE的抗人Fc第二抗體的第二溫育，以檢測(cè)由RSPO1-Fc融合蛋白結(jié)合的細(xì)胞。在FACSCalibur儀器(BDBiosciences,SanJose,CA)上分析所述細(xì)胞，使用FlowJo軟件處理數(shù)據(jù)。如圖7所示，抗-RSPO1抗體89M2、89M4、89M5和89M25每個(gè)都阻斷RSPO1與LGR5的結(jié)合，而抗-RSPO1抗體89M7和89M19不阻斷RSPO1與LGR5的結(jié)合。這些結(jié)果與實(shí)施例6中所示的結(jié)果相關(guān)，其證明了在測(cè)定β-連環(huán)素活性的誘導(dǎo)的檢驗(yàn)中在6xTCF熒光素酶報(bào)告基因檢驗(yàn)中抗體89M2、89M4、89M5和89M25阻斷RSPO1信號(hào)傳導(dǎo)的能力，而抗體89M7和89M19不能阻斷RSPO1信號(hào)傳導(dǎo)。如上所述，抗體89M2、89M4、89M5和89M25都包含相同的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，并且據(jù)推測(cè)包含相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，因此預(yù)期這些抗體都以類(lèi)似(或相同)的方式起作用。實(shí)施例8抗-RSPO1抗體的結(jié)合親和性使用來(lái)自BiacoreLifeSciences(GEHealthcare)的Biacore2000系統(tǒng)確定抗體89M2、89M4、89M5和89M25的KD。使用標(biāo)準(zhǔn)胺類(lèi)化學(xué)(NHS/EDC)將重組人RSPO1-Fc或小鼠RSPO1-Fc蛋白固定在CM5芯片上。在HBS-P(0.01MHEPESpH7.4，0.15MNaCl，0.005％v/v表面活性劑P20)中將所述抗體在100nM～0.78nM范圍內(nèi)進(jìn)行連續(xù)2倍稀釋?zhuān)⒆⑸湓谛酒砻嫔?。隨時(shí)間收集動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，并使用全擬合方程進(jìn)行擬合，以產(chǎn)生各抗體的親合常數(shù)(KD值)。表4人RSPO1(nM)小鼠RSPO1(nM)89M4<0.1<0.189M5<0.1<0.189M7<0.1<0.189M25<0.1<0.1如表4所示，抗體89M4、89M5、89M7和89M25對(duì)人RSPO1的親合常數(shù)(KD)都小于0.1nM。這些抗體對(duì)小鼠RSPO1的KD也小于0.1nM。實(shí)施例9抗-RSPO1抗體抑制卵巢瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)在6至8周齡的NOD/SCID小鼠的乳房脂肪墊中注射解離的OV19卵巢瘤細(xì)胞(1×105細(xì)胞)。使腫瘤生長(zhǎng)45天，直到他們達(dá)到134mm3的平均尺寸。將小鼠隨機(jī)化(n＝10每組)，并用以下進(jìn)行治療：抗-RSPO1抗體89M5；89M25；紫杉醇；89M5和紫杉醇的組合；89M25和紫杉醇的組合；或?qū)φ湛贵w1B7.11。每周一次以15mg/kg給藥抗體，并且每周一次以7.5mg/ml給藥紫杉醇。通過(guò)注入腹腔進(jìn)行所述抗體和紫杉醇的施用。監(jiān)視腫瘤生長(zhǎng)，并且用電子卡尺在指定時(shí)間點(diǎn)測(cè)定腫瘤體積。數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±S.E.M。在第35天，與用對(duì)照抗體進(jìn)行的治療相比，用抗體89M5進(jìn)行的治療導(dǎo)致使腫瘤生長(zhǎng)減少40％，89M25使腫瘤生長(zhǎng)減少25％(圖8，分別為p＝0.37和p＝0.19)。89M5或89M25與紫杉醇組合治療導(dǎo)致的腫瘤生長(zhǎng)減少大于用任一單獨(dú)試劑進(jìn)行的治療。用89M5和紫杉醇進(jìn)行治療導(dǎo)致生長(zhǎng)減少48％(p＝0.12，相對(duì)于對(duì)照組)，用89M25和紫杉醇進(jìn)行治療導(dǎo)致生長(zhǎng)減少43％(p＝0.16，相對(duì)于對(duì)照組)。因此，抗體89M5和89M25證明了作為單獨(dú)試劑具有在OV19卵巢瘤模型中的抗腫瘤生長(zhǎng)活性，還展示了與紫杉醇組合的抗腫瘤生長(zhǎng)活性。對(duì)來(lái)自在該實(shí)驗(yàn)中使用的小鼠(對(duì)照小鼠和經(jīng)治療小鼠)的腫瘤進(jìn)行的隨后分析揭示，所述腫瘤是人卵巢瘤細(xì)胞(OV19)和鼠類(lèi)T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的混合物。實(shí)施例10抗-RSPO1單克隆抗體89M5的表位作圖為了進(jìn)一步表征抗體89M5結(jié)合的RSPO1的特定區(qū)，進(jìn)行表位作圖實(shí)驗(yàn)。使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生包含人RSPO1的不同區(qū)的一系列構(gòu)建體(參見(jiàn)圖9A)。構(gòu)建體是各自含有N末端FLAG標(biāo)記的融合蛋白，所述N末端FLAG標(biāo)記在RSPO1蛋白的一部分之后，并且融合至人CD4的跨膜細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一些版本中，所述融合蛋白還包含C末端綠色熒光蛋白標(biāo)記。用各構(gòu)建體轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞。48小時(shí)后，將所轉(zhuǎn)染細(xì)胞懸浮在含有2％FBS和肝素的冰冷PBS中，并且在抗-RSPO1抗體89M5的存在下在冰上溫育30分鐘。進(jìn)行使用100μl綴合有PE的抗-人Fc第二抗體的第二溫育，以檢測(cè)由抗體結(jié)合的細(xì)胞。將細(xì)胞與作為陽(yáng)性對(duì)照的抗-FLAG抗體(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和作為陰性對(duì)照的抗-PE抗體一起溫育。在FACSCalibur儀器(BDBiosciences,SanJose,CA)上分析所述細(xì)胞，使用FlowJo軟件處理數(shù)據(jù)。如圖9B中所示，F(xiàn)ACS分析表明，RSPO1的弗林蛋白酶2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸參與抗-RSPO1抗體89M5的結(jié)合位點(diǎn)(實(shí)施例10、圖9)。這些初步結(jié)果不排除以下事實(shí)：即其他RSPO1結(jié)構(gòu)域中的氨基酸可能不參與所述結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)施例11抗-RSPO2單克隆抗體的生成針對(duì)重組人RSPO2蛋白22-205位氨基酸生成抗體(R&DSystems,Minneapolis,MN)。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用RSPO2蛋白對(duì)小鼠(n＝3)進(jìn)行免疫。在開(kāi)始免疫后70天使用FACS分析就RSPO2篩選來(lái)自個(gè)體小鼠的血清。在分離脾細(xì)胞以用于產(chǎn)生雜交瘤后選擇具有最高抗體滴度的動(dòng)物用于最后的抗原加強(qiáng)。使用SP2/0細(xì)胞作為小鼠脾細(xì)胞的融合伴侶。以1細(xì)胞/孔將雜交瘤細(xì)胞在96孔板上鋪平板，并且就人RSPO2通過(guò)FACS分析篩選上清液。如實(shí)施例5中所示，為了FACS篩選抗-RSPO2抗體，構(gòu)建能夠細(xì)胞表面表達(dá)人RSPO2的N末端弗林蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域的嵌合融合蛋白。與圖5A中關(guān)于RSPO1所描述的相類(lèi)似，RSPO2融合蛋白含有N末端FLAG標(biāo)記和C末端綠色熒光蛋白標(biāo)記，所述N末端FLAG標(biāo)記在RSPO2的兩個(gè)弗林蛋白酶(furin)樣結(jié)構(gòu)域(氨基酸31～146)之后，并且融合至人CD4的跨膜細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(FLAG-RSPO2furin-CD4TM-GFP)。將HEK-293細(xì)胞用FLAG-RSPO2furin-CD4TM-GFP轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，將所轉(zhuǎn)染細(xì)胞懸浮在含有2％FBS和肝素的冰冷PBS中，并且在50μl雜交瘤上清液的存在下在冰上溫育30分鐘。進(jìn)行使用100μl綴合有PE的抗-人Fc第二抗體的第二溫育，以檢測(cè)由抗體結(jié)合的細(xì)胞。將細(xì)胞與作為陽(yáng)性對(duì)照的抗-FLAG抗體(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和作為陰性對(duì)照的抗-PE抗體一起溫育。在FACSCalibur儀器(BDBiosciences,SanJose,CA)上分析所述細(xì)胞，使用FlowJo軟件處理數(shù)據(jù)。鑒定出結(jié)合RSPO2的數(shù)個(gè)雜交瘤，包括130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28(圖10)。對(duì)來(lái)自數(shù)個(gè)這些抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序。將表達(dá)抗體130M23的雜交瘤細(xì)胞系于2011年8月10日在布達(dá)佩斯條約的條件下保藏在ATCC(10801UniversityBoulevard,Manassas,VA,美國(guó))，并賦予ATCC指定保藏號(hào)PTA-12021。130M23的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列是SEQIDNO:27和SEQIDNO:28。130M23的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列是SEQIDNO:35和SEQIDNO:36。130M23的重鏈CDR和輕鏈CDR列于本文表1中。130M23的重鏈和輕鏈的氨基酸序列是SEQIDNO:37和SEQIDNO:38；130M23的重鏈和輕鏈的核苷酸序列是SEQIDNO:39和SEQIDNO:40。實(shí)施例12抑制RSPO2誘導(dǎo)β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的抗-RSPO2單克隆抗體的鑒定用6xTCF-熒光素酶報(bào)告基因載體(TOPflash,Millipore,Billerica,MA)轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞。24至48小時(shí)后，在抗-RSPO2抗體130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28的存在下將所轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞與Wnt3a(5ng/ml)和人RSPO2(10ng/ml,R&DBioSystems)或人RSPO3(10ng/ml,R&DBioSystems)的組合一起溫育。將細(xì)胞與Wnt3a和RSPO的組合、僅Wnt3a或不添加作為對(duì)照一起溫育。使細(xì)胞溫育16小時(shí)，使用LuciferaseAssaySystem根據(jù)制造商說(shuō)明(Promega,Madison,WI)測(cè)定熒光素酶活性。如圖11所示，抗-RSPO2抗體130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28各自都減少RSPO2-誘導(dǎo)的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)，抗-RSPO2抗體130M23、130M24完全阻斷RSPO2-誘導(dǎo)的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。與之相反，這些抗體不阻斷RSPO3誘導(dǎo)的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。這些結(jié)果證明了抗體130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28是RSPO2的特異性抑制劑，能夠減少和/或完全阻斷RSPO2-誘導(dǎo)的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。實(shí)施例13抗-RSPO2抗體阻斷可溶性RSPO2與LGR5的結(jié)合用FLAG-LGR5-CD4TM-GFP構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞(之前在實(shí)施例2中描述)。48小時(shí)后，將所轉(zhuǎn)染細(xì)胞懸浮在含有2％FBS和肝素的冰冷PBS中，并且在RSPO2-Fc蛋白(10μg/ml)和抗體130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28的存在下在冰上溫育。進(jìn)行使用100μl綴合有PE的抗-人Fc第二抗體的第二溫育，以檢測(cè)由RSPO2-Fc融合蛋白結(jié)合的細(xì)胞。在FACSCalibur儀器(BDBiosciences,SanJose,CA)上分析所述細(xì)胞，使用FlowJo軟件處理數(shù)據(jù)。如圖12所示，抗-RSPO2抗體130M23和130M24各自阻斷RSPO2與LGR5的結(jié)合，而抗-RSPO2抗體130M25、130M26、130M27和130M28僅微弱阻斷或不阻斷RSPO2與LGR5的結(jié)合。這些結(jié)果與實(shí)施例11所示的結(jié)果相關(guān)，其證明了抗體130M23和130M24完全阻斷RSPO2-誘導(dǎo)的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的能力，而抗體130M25、130M26、130M27和130M28是較弱的RSPO2-誘導(dǎo)的β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑。實(shí)施例14抗-RSPO3單克隆抗體的生成針對(duì)重組人RSPO3蛋白22～272位氨基酸生成抗體(R&DSystems,Minneapolis,MN)。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用RSPO3蛋白對(duì)小鼠(n＝3)進(jìn)行免疫。在開(kāi)始免疫后70天使用FACS分析就RSPO3篩選來(lái)自個(gè)體小鼠的血清。在分離脾細(xì)胞以用于產(chǎn)生雜交瘤后選擇具有最高抗體滴度的動(dòng)物用于最后的抗原加強(qiáng)。使用SP2/0細(xì)胞作為小鼠脾細(xì)胞的融合伴侶。以1細(xì)胞/孔將雜交瘤細(xì)胞在96孔板上鋪平板，并且就人RSPO3通過(guò)FACS分析篩選上清液。如實(shí)施例5中所示，為了FACS篩選抗-RSPO3抗體，構(gòu)建能夠細(xì)胞表面表達(dá)人RSPO的N末端弗林蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域的嵌合融合蛋白。與圖5A中關(guān)于RSPO1所描述的相類(lèi)似，RSPO3融合蛋白含有N末端FLAG標(biāo)記和C末端綠色熒光蛋白標(biāo)記，所述N末端FLAG標(biāo)記在RSPO3的弗林蛋白酶(furin)樣結(jié)構(gòu)域(aa32-141)之后，并且融合至人CD4的跨膜細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(FLAG-RSPO3furin-CD4TM-GFP)。將HEK-293細(xì)胞用FLAG-RSPO3furin-CD4TM-GFP轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，將所轉(zhuǎn)染細(xì)胞懸浮在含有2％FBS和肝素的冰冷PBS中，并且在50μl雜交瘤上清液的存在下在冰上溫育30分鐘。進(jìn)行使用100μl綴合有PE的抗-人Fc第二抗體的第二溫育，以檢測(cè)由抗體結(jié)合的細(xì)胞。將細(xì)胞與作為陽(yáng)性對(duì)照的抗-FLAG抗體(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和作為陰性對(duì)照的抗-PE抗體一起溫育。在FACSCalibur儀器(BDBiosciences,SanJose,CA)上分析所述細(xì)胞，使用FlowJo軟件處理數(shù)據(jù)。實(shí)施例15抗-RSPO2抗體130M23的結(jié)合親和性使用來(lái)自BiacoreLifeSciences(GEHealthcare)的Biacore2000系統(tǒng)確定130M23的KD。使用標(biāo)準(zhǔn)胺類(lèi)化學(xué)(NHS/EDC)將重組人RSPO2-Fc或小鼠RSPO2-Fc蛋白固定在CM5芯片上。在HBS-P(0.01MHEPESpH7.4，0.15MNaCl，0.005％v/v表面活性劑P20)中將所述抗體在100nM～0.78nM范圍內(nèi)進(jìn)行連續(xù)2倍稀釋?zhuān)⒆⑸湓谛酒砻嫔稀ｋS時(shí)間收集動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，并使用全擬合方程進(jìn)行擬合，以產(chǎn)生各抗體的親合常數(shù)(KD值)?？贵w130M23對(duì)人RSPO2的親和常數(shù)(KD)為0.14nM，對(duì)小鼠RSPO2的KD為0.35nM。實(shí)施例16抗-RSPO2抗體抑制RSPO活性的體外測(cè)試如實(shí)施例3中所述制備來(lái)自人肺瘤LU2細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，如實(shí)施例2中所述制備可溶性LGR5-Fc。使STF-293與LU2細(xì)胞和25％的肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基以及25％Wnt3a-L細(xì)胞條件培養(yǎng)基一起溫育。將抗體130M23和可溶性LGR5-Fc以在50μg/ml～0.0006μg/ml范圍內(nèi)的5倍連續(xù)稀釋液添加至所述細(xì)胞。使用經(jīng)過(guò)類(lèi)似稀釋的無(wú)關(guān)單克隆抗體和對(duì)照Fc融合蛋白(50μg/ml)作為陰性對(duì)照。使細(xì)胞溫育20小時(shí)，使用LuciferaseAssaySystem根據(jù)制造商說(shuō)明(Promega,Madison,WI)測(cè)定熒光素酶活性。如圖14所示，遞增濃度的可溶性LGR5-Fc(-●-)減少了由肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基和Wnt3a條件培養(yǎng)基的組合對(duì)熒光素酶活性的誘導(dǎo)。遞增濃度的抗-RSPO2抗體130M23(-■-)也減少了由肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基和Wnt3a條件培養(yǎng)基的組合對(duì)熒光素酶活性的誘導(dǎo)。130M23阻斷了條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的活性，IC50為129nM，比LGR5-Fc的效力高100倍。對(duì)照Fc融合蛋白(-Δ-)，以及無(wú)關(guān)抗體(-□-)不阻斷熒光素酶活性。實(shí)施例17抗-RSPO抗體抑制胰腺瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)將解離的PN31胰腺瘤細(xì)胞(1×105細(xì)胞)皮下注入6至8周齡的NOD/SCID小鼠的側(cè)腹中。使腫瘤生長(zhǎng)61天，直到他們達(dá)到120mm3的平均尺寸。將小鼠隨機(jī)化(n＝10每組)，并用以下進(jìn)行治療：抗-RSPO1抗體89M5；抗-RSPO2抗體130M23；吉西他濱；89M5和吉西他濱的組合；130M23和吉西他濱的組合；或?qū)φ湛贵w1B7.11。每周一次以15mg/kg給藥抗體，并且每周一次以30mg/ml給藥吉西他濱。通過(guò)注入腹腔進(jìn)行所述抗體和吉西他濱的施用。監(jiān)視腫瘤生長(zhǎng)，并且用電子卡尺在特定時(shí)間點(diǎn)測(cè)定腫瘤體積。數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±S.E.M。如圖15所示，用抗-RSPO1抗體89M5或抗-RSPO2抗體130M23作為單獨(dú)試劑進(jìn)行治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)僅具有最小效果。與對(duì)照相比，用單獨(dú)吉西他濱進(jìn)行治療將腫瘤生長(zhǎng)減少49％(p＝0.09)。但是，89M5或130M23與吉西他濱組合治療導(dǎo)致的腫瘤生長(zhǎng)減少大于用任一單獨(dú)試劑進(jìn)行的治療。用89M5和吉西他濱進(jìn)行的治療導(dǎo)致生長(zhǎng)減少59％(p＝0.015，與對(duì)照組相比)，用130M23和吉西他濱進(jìn)行的治療導(dǎo)致生長(zhǎng)減少58％(p＝0.016，與對(duì)照組相比)。因此，抗-RSPO1抗體89M5和抗-RSPO2抗體130M23與的吉西他濱組合顯示出在胰腺異種移植物模型中的強(qiáng)效抗腫瘤生長(zhǎng)活性。實(shí)施例18抗-RSPO抗體與Wnt途徑抑制劑組合抑制胰腺瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)將解離的PN7胰腺瘤細(xì)胞(1×105細(xì)胞)皮下注入6至8周齡的NOD/SCID小鼠的側(cè)腹中。使腫瘤生長(zhǎng)25天，直到他們達(dá)到130mm3的平均尺寸。將小鼠隨機(jī)化(n＝10每組)，并且用以下治療小鼠：抗-RSPO2抗體130M23；抗-FZD抗體18R5；吉西他濱；130M23和吉西他濱的組合；18R5和吉西他濱的組合；130M23和18R5的組合；130M23、18R5和吉西他濱的組合；或?qū)φ湛贵w1B7.11。每周一次以10mg/kg給藥抗-RSPO2抗體130M23，每周一次以20mg/ml給藥抗-FZD抗體18R5，并且每周一次以30mg/ml給藥吉西他濱。通過(guò)注入腹腔進(jìn)行所述抗體和吉西他濱的施用。監(jiān)視腫瘤生長(zhǎng)，并且用電子卡尺在特定時(shí)間點(diǎn)測(cè)定腫瘤體積。數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±S.E.M。平行實(shí)驗(yàn)組包括用FZD8-Fc可溶性受體(10mg/kg)與吉西他濱組合治療和用FZD8-Fc與130M23和吉西他濱組合治療。用抗體130M23或抗體18R5作為單獨(dú)試劑進(jìn)行治療導(dǎo)致與用對(duì)照抗體進(jìn)行治療相比，腫瘤生長(zhǎng)減少約55％(圖16A,p<0.001)。130M23或18R5與吉西他濱組合治療導(dǎo)致的腫瘤生長(zhǎng)減少大于用任一單獨(dú)試劑進(jìn)行的治療。用130M23和吉西他濱進(jìn)行治療導(dǎo)致生長(zhǎng)減少68％(p<0.001，相對(duì)于對(duì)照組)，用18R5和吉西他濱進(jìn)行治療導(dǎo)致生長(zhǎng)減少75％(p<0.001，相對(duì)于對(duì)照組)。此外，130M23、吉西他濱和18R5的組合導(dǎo)致幾乎完全抑制PN7腫瘤的生長(zhǎng)(圖16A)。用130M23、吉西他濱和FZD8-Fc可溶性受體也看到類(lèi)似的結(jié)果。因此，諸如130M23等抗-RSPO2抗體在抑制胰腺瘤生長(zhǎng)方面具有單試劑活性。此外，抗-RSPO2抗體與吉西他濱的組合、或者抗-RSPO2抗體與吉西他濱以及Wnt途徑抑制劑(諸如抗-FZD抗體18R5或FZD8-Fc可溶性受體)的組合，據(jù)顯示對(duì)于抑制胰腺瘤模型中的腫瘤生長(zhǎng)而言是非常有效的治療劑。IHC研究顯示，與未治療小鼠相比，抗-RSPO2抗體130M23在受治療小鼠的PN7腫瘤中誘導(dǎo)了形態(tài)學(xué)改變。使用抗-Ki67抗體，這些細(xì)胞還展示了增殖方面的顯著下降。這些結(jié)果可能反映了腫瘤細(xì)胞的損失和間質(zhì)的增加。對(duì)上述PN7腫瘤進(jìn)行處理以產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮液。使用生物素化抗-H2Kd和抗-CD45抗體和綴合有鏈親和素的磁珠從細(xì)胞混合物除去小鼠細(xì)胞。將殘留的人腫瘤細(xì)胞連續(xù)移植至新小鼠組中。將來(lái)自各治療組的90個(gè)腫瘤細(xì)胞注入NOD-SCID小鼠(n＝10只小鼠/組)的側(cè)腹中。使腫瘤生長(zhǎng)40天，不進(jìn)行治療，并且使用電子卡尺測(cè)定腫瘤體積。圖16C顯示來(lái)自各組中個(gè)體小鼠的腫瘤體積。與分離自用對(duì)照抗體治療的小鼠的細(xì)胞相比，分離自用作為單試劑的抗-RSPO2抗體130M23或抗-FZD抗體18R5或二者組合治療的小鼠的細(xì)胞的致瘤性極大降低。該致瘤性的減少大于用單獨(dú)吉西他濱觀察到的致瘤性的減少。與分離自用對(duì)照抗體治療的小鼠的細(xì)胞相比，分離自用吉西他濱和130M23的組合、吉西他濱和18R5的組合或者吉西他濱和FZD8-Fc的組合治療的小鼠的細(xì)胞顯示了僅輕微減少的致瘤性。令人感興趣的是，分離自用130M23、18R5和吉西他濱的組合或者130M23、FZD8-Fc和吉西他濱的組合證明了腫瘤生長(zhǎng)的驚人顯著的缺乏，其高于任意單獨(dú)的試劑或兩種試劑的組合。這些結(jié)果顯示，除了標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法之外抑制多種途徑在減少致瘤性和癌干細(xì)胞方面具有加合效應(yīng)并且可能具有協(xié)調(diào)效應(yīng)。實(shí)施例19RSPO抗體的人源化生成針對(duì)人RSPO1和RSPO2的人源化抗體?；旧先鏛arrick,J.M.,等,1989,Biochem.Biophys.Res.Comm.160:1250andJones,S.T.&Bendig,M.M.,1991,Bio/Technology9:88所述使用簡(jiǎn)并PCR從雜交瘤系分離鼠類(lèi)單克隆抗體89M5和130M23的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，并對(duì)其測(cè)序。然后將可能與親本89M5或130M23抗體氨基酸序列結(jié)構(gòu)相似的人重鏈和輕鏈可變框架區(qū)看作參照人框架區(qū)，以幫助指導(dǎo)新型合成框架的設(shè)計(jì)。為了鑒定與鼠類(lèi)框架具有相似性的人框架區(qū)，針對(duì)Genbank中保藏的人序列，利用BLAST搜索對(duì)由89M5和130M23的鼠類(lèi)重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域編碼的預(yù)測(cè)蛋白序列與由所表達(dá)的人cDNA編碼的人抗體序列進(jìn)行比較。對(duì)候選人源化框架重鏈和親本鼠類(lèi)多克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的氨基酸差異就可能的重要性進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)關(guān)于位置方面的每個(gè)差異是否促成正確折疊和可變區(qū)的功能進(jìn)行判斷。通過(guò)檢查其他抗體片段的已解析晶體結(jié)構(gòu)而指導(dǎo)該分析(例如，如Trakhanov等，ActaCrystallogrDBiolCrystallogr,1999,55:122-28中描述的Fab2E8的結(jié)構(gòu)以及其他蛋白晶體結(jié)構(gòu)(例如，蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)構(gòu)1ADQ和1GIG))。使用計(jì)算機(jī)軟件(包括Jmol、快速PDB和Pymol)對(duì)結(jié)構(gòu)建模?？紤]特定位置處的氨基酸對(duì)β折疊框架、重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的相互作用、氨基酸側(cè)鏈的溶劑暴露程度以及氨基酸影響CDR環(huán)的定位的可能性的潛在影響。由該分析，設(shè)計(jì)出框內(nèi)融合至人IgG2恒定區(qū)的候選重鏈可變區(qū)和框內(nèi)融合至人IgKC1恒定區(qū)的候選輕鏈可變區(qū)并進(jìn)行化學(xué)合成。候選重鏈和輕鏈包含：i)設(shè)計(jì)成與天然人框架相似的合成框架，和ii)親本89M5或130M23鼠類(lèi)抗體CDR。通過(guò)共轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中來(lái)測(cè)試各候選變體人源化重鏈和輕鏈的功能性。將上述各候選變體人源化重鏈與鼠類(lèi)輕鏈cDNA一起共轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞中，并通過(guò)FACS就RSPO結(jié)合活性檢驗(yàn)條件培養(yǎng)基。人源化89M5重鏈變體“89M5-H2”(SEQIDNO:68)展現(xiàn)了最強(qiáng)烈的結(jié)合，因而選用。將89M5-H2人源化重鏈與每種候選人源化輕鏈共轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞中，并再次通過(guò)FACS就抗原結(jié)合檢驗(yàn)條件培養(yǎng)基。輕鏈變體“89M5-L2”(SEQIDNO:69)展現(xiàn)了最強(qiáng)烈的結(jié)合，因而選用。類(lèi)似地，130M23重鏈變體“130M23-H1”(SEQIDNO:70)展現(xiàn)了最強(qiáng)烈的結(jié)合，因而選用。將130M23-H1人源化重鏈與每種候選人源化輕鏈共轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞中，并再次通過(guò)FACS就抗原結(jié)合檢驗(yàn)條件培養(yǎng)基。輕鏈變體“130M23-L2”(SEQIDNO:71)展現(xiàn)了最強(qiáng)烈的結(jié)合，因而選用。為了增加抗體的產(chǎn)生，生成130M23-H1L2變體。該變體包含與130M23-H1L2相同的重鏈，但是具有修飾的輕鏈，將其稱為h130M23-H1L6。實(shí)施例20人源化89M5和人源化130M23的結(jié)合親和性使用來(lái)自BiacoreLifeSciences(GEHealthcare)的Biacore2000系統(tǒng)確定h89M5-H2L2的KD。使用標(biāo)準(zhǔn)胺類(lèi)化學(xué)(NHS/EDC)將重組人RSPO1-Fc或小鼠RSPO1-Fc蛋白固定在CM5芯片上。在HBS-P(0.01MHEPESpH7.4，0.15MNaCl，0.005％v/v表面活性劑P20)中將所述抗體在100nM～0.78nM范圍內(nèi)進(jìn)行連續(xù)2倍稀釋?zhuān)⒆⑸湓谛酒砻嫔?。隨時(shí)間收集動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，并使用全擬合方程進(jìn)行擬合，以產(chǎn)生各抗體的親合常數(shù)(KD值)h89M5-H2L2對(duì)人RSPO1和小鼠RSPO1的親和常數(shù)(KD)小于0.1nM。使用來(lái)自BiacoreLifeSciences(GEHealthcare)的Biacore2000系統(tǒng)確定h130M23-H1L2和h130M23-H1L6的KD。使用標(biāo)準(zhǔn)胺類(lèi)化學(xué)(NHS/EDC)將重組人RSPO2-Fc蛋白固定在CM5芯片上。在HBS-P(0.01MHEPESpH7.4，0.15MNaCl，0.005％v/v表面活性劑P20)中將所述抗體在100nM～0.78nM范圍內(nèi)進(jìn)行連續(xù)2倍稀釋?zhuān)⒆⑸湓谛酒砻嫔?。隨時(shí)間收集動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，并使用全擬合方程進(jìn)行擬合，以產(chǎn)生各抗體的親合常數(shù)(KD值)h130M23-H1L2對(duì)人RSPO2的親和常數(shù)(KD)為0.13nM，h130M23-H1L6對(duì)人RSPO2的親和常數(shù)(KD)為0.15nM。實(shí)施例21抗-RSPO抗體的FACS結(jié)合用編碼FLAG-RSPO1furin-CD4TM-GFP的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。如實(shí)施例5中所示，F(xiàn)LAG-RSPO1furin-CD4TM-GFP是能夠使人RSPO1的N末端弗林蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞表面表達(dá)的嵌合融合蛋白。在抗-RSPO1抗體89M5或人源化抗-RSPO1抗體h89M5-H2L2的存在下，對(duì)經(jīng)FLAG-RSPO1furin-CD4TM-GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行溫育。對(duì)每種抗體的5倍連續(xù)稀釋液就其與表達(dá)RSPO1的細(xì)胞結(jié)合的能力進(jìn)行檢查。用綴合有藻紅蛋白的抗-IgG對(duì)細(xì)胞染色，以顯示結(jié)合抗體。在FACSCalibur儀器(BDBiosciences,SanJose,CA)上分析所述細(xì)胞，使用FlowJo軟件處理數(shù)據(jù)。如圖17A所示，這些研究表明，抗-RSPO1抗體89M5和人源化抗-RSPO1抗體h89M5-H2L2都與人RSPO1結(jié)合。用編碼FLAG-RSPO2furin-CD4TM-GFP的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。如實(shí)施例11中所示，F(xiàn)LAG-RSPO2furin-CD4TM-GFP是能夠使人RSPO2的N末端弗林蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞表面表達(dá)的嵌合融合蛋白。在抗-RSPO2抗體130M23或人源化抗-RSPO2抗體h130M5-H1L2的存在下，對(duì)FLAG-RSPO2furin-CD4TM-GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行溫育。對(duì)每種抗體的5倍連續(xù)稀釋液就其與表達(dá)RSPO2的細(xì)胞結(jié)合的能力進(jìn)行檢查。用綴合有藻紅蛋白的抗-IgG對(duì)細(xì)胞染色，以顯示結(jié)合抗體。在FACSCalibur儀器(BDBiosciences,SanJose,CA)上分析所述細(xì)胞，使用FlowJo軟件處理數(shù)據(jù)。如圖17B所示，這些研究表明，抗-RSPO2抗體130M23和人源化抗-RSPO2抗體h130M23-H1L2都與人RSPO2結(jié)合。實(shí)施例22抗-RSPO抗體與化學(xué)治療劑組合抑制乳腺瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)將解離的OMP-B39乳腺瘤細(xì)胞(4×105細(xì)胞)皮下注入6至8周齡的NOD/SCID小鼠的側(cè)腹中。OMP-039是三陰性乳腺癌腫瘤，具有高水平的RSPO2表達(dá)。此外，RSPO1的表達(dá)高于實(shí)施例1中表征的其他乳腺瘤(參見(jiàn)表2)。使腫瘤生長(zhǎng)39天，直到他們達(dá)到120mm3的平均尺寸。將小鼠隨機(jī)化(n＝10每組)，并用以下進(jìn)行治療：抗-RSPO1抗體89M5和抗-RSPO2抗體130M23的組合；順鉑；抗-RSPO1和抗RSPO2抗體與順鉑的組合；或者對(duì)照抗體。每周一次以15mg/kg給藥抗體，并且每周一次以1.5mg/ml給藥順鉑。通過(guò)注入腹腔進(jìn)行所述抗體和順鉑的施用。監(jiān)視腫瘤生長(zhǎng)，并且用電子卡尺在指定天數(shù)測(cè)定腫瘤體積。數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±S.E.M。如圖18所示，抗-RSPO1抗體89M5和抗-RSPO2抗體130M23與順鉑的組合比僅順鉑更好地抑制腫瘤生長(zhǎng)(p＝0.04，組合組與僅順鉑相比)。三者組合具有更顯著的效應(yīng)，但事實(shí)上抗體89M5和130M25的組合(不具有順鉑)對(duì)該腫瘤僅具有最小效應(yīng)。應(yīng)該理解的是本文描述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅出于說(shuō)明性目的，會(huì)啟示本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮其各種改進(jìn)或變化，并且其應(yīng)包含在本申請(qǐng)的主旨和意圖之內(nèi)。本文引用的任何出版物、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、網(wǎng)址和登錄號(hào)/數(shù)據(jù)庫(kù)序列(包括多核苷酸序列和多肽序列)都是以全文引用的方式并入，其引用程度等同于將每個(gè)單獨(dú)的出版物、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、網(wǎng)址和登錄號(hào)/數(shù)據(jù)庫(kù)序列特定且個(gè)別地以全文引用的方式并入。序列具有信號(hào)序列的人RSPO1蛋白序列(SEQIDNO:1)MRLGLCVVALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA具有信號(hào)序列的人RSPO2蛋白序列(SEQIDNO:2)MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTIPCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDRANQ具有信號(hào)序列的人RSPO3蛋白序列(SEQIDNO:3)MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLESSKEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVH具有信號(hào)序列的人RSPO4蛋白序列(SEQIDNO:4)MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIICSEENGCSTCQQRLFLFIRREGIRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVNRCKKCGATCESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLPTCPPGTLAHQNTRECQGECELGPWGGWSPCTHNGKTCGSAWGLESRVREAGRAGHEEAATCQVLSESRKCPIQRPCPGERSPGQKKGRKDRRPRKDRKLDRRLDVRPRQPGLQP不具有預(yù)測(cè)的信號(hào)序列的人RSPO1蛋白序列(SEQIDNO:5)SRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA人RSPO1弗林蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域1(SEQIDNO:6)AEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFD人RSPO1弗林蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域2(SEQIDNO:7)MNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSA人RSPO1血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:8)QCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCP人RSPO1的31～263位氨基酸(SEQIDNO:9)RISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA89M5重鏈可變區(qū)(SEQIDNO:10)EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTGYTMHWVRQSHGKTLEWIGGINPNNGGTTYNQNFKGKATLTVEKSSTTAYLELRSLTSEDSALYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSA89M5輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO:11)DIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQDVIFAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSVSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIK89M5重鏈CDR1(SEQIDNO:12)TGYTMH89M5重鏈CDR2(SEQIDNO:13)GINPNNGGTTYNQNFKG89M5重鏈CDR3(SEQIDNO:14)KEFSDGYYFFAY89M5輕鏈CDR1(SEQIDNO:15)KASQDVIFAVA89M5輕鏈CDR2(SEQIDNO:16)WASTRHT89M5輕鏈CDR3(SEQIDNO:17)QQHYSTPWFLAG標(biāo)記(SEQIDNO:18)DYKDDDDK89M5重鏈可變區(qū)核苷酸序列(SEQIDNO:19)GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGGATACACATTCACTGGATACACCATGCACTGGGTGAGGCAGAGCCATGGAAAGACCCTTGAGTGGATTGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACTTACAACCAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGAGAAGTCCTCCACCACAGCCTACTTGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCACTCTATTACTGTGCAAGAAAGGAGTTCTCTGATGGTTACTACTTTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA89M5輕鏈可變區(qū)核苷酸序列(SEQIDNO:20)GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTGGGAGACAGGGTCAACATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGATTTTTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGTATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA具有預(yù)測(cè)的下劃線信號(hào)序列的89M5重鏈氨基酸序列(SEQIDNO:21)MGWSWIFLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTGYTMHWVRQSHGKTLEWIGGINPNNGGTTYNQNFKGKATLTVEKSSTTAYLELRSLTSEDSALYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK具有預(yù)測(cè)的下劃線信號(hào)序列的89M5輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:22)MGFKMESQIQAFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQDVIFAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSVSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC89M5重鏈核苷酸序列(SEQIDNO:23)ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTTCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGGATACACATTCACTGGATACACCATGCACTGGGTGAGGCAGAGCCATGGAAAGACCCTTGAGTGGATTGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACTTACAACCAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGAGAAGTCCTCCACCACAGCCTACTTGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCACTCTATTACTGTGCAAGAAAGGAGTTCTCTGATGGTTACTACTTTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGATAA89M5輕鏈核苷酸序列(SEQIDNO:24)ATGGGCTTCAAGATGGAGTCACAGATTCAGGCATTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGACGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTGGGAGACAGGGTCAACATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGATTTTTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGTATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAGTGA不具有預(yù)測(cè)的信號(hào)序列的89M5重鏈氨基酸序列(SEQIDNO:25)EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTGYTMHWVRQSHGKTLEWIGGINPNNGGTTYNQNFKGKATLTVEKSSTTAYLELRSLTSEDSALYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK不具有預(yù)測(cè)的信號(hào)序列的89M5輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:26)DIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQDVIFAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSVSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC130M23重鏈可變區(qū)(SEQIDNO:27)EVKLVESGGGLVKPGGSLKFSCAASGFSFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNVRNILYLQMSSLRSEDTAMYFCARGGDPGVYNGDYEDAMDYWGQGTSVTVSS130M23輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO:28)DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSSAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTNSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIK130M23重鏈CDR1(SEQIDNO:29)SSYAMS130M23重鏈CDR2(SEQIDNO:30)SISSGGSTYYPDSVKG130M23重鏈CDR3(SEQIDNO:31)RGGDPGVYNGDYEDAMDY130M23輕鏈CDR1(SEQIDNO:32)KASQDVSSAVA130M23輕鏈CDR2(SEQIDNO:33)WASTRHT130M23輕鏈CDR3(SEQIDNO:34)QQHYSTP130M23重鏈可變區(qū)核苷酸序列(SEQIDNO:35)GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAATTTTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGTTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTAGTACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGTCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTTCTGTGCACGAGGCGGGGATCCGGGGGTCTACAATGGTGACTACGAAGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA130M23輕鏈可變區(qū)核苷酸序列(SEQIDNO:36)GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTCGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTTCTGCTGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAAACAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGTAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA具有預(yù)測(cè)的下劃線信號(hào)序列的130M23重鏈氨基酸序列(SEQIDNO:37)MNFGLRLVFLVLVLKGVQCEVKLVESGGGLVKPGGSLKFSCAASGFSFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNVRNILYLQMSSLRSEDTAMYFCARGGDPGVYNGDYEDAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK具有預(yù)測(cè)的下劃線信號(hào)序列的130M23輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:38)MGIKMESQIQAFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSSAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTNSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC130M23重鏈核苷酸序列(SEQIDNO:39)ATGAACTTCGGGCTGAGATTGGTTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAATTTTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGTTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTAGTACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGTCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTTCTGTGCACGAGGCGGGGATCCGGGGGTCTACAATGGTGACTACGAAGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA130M23輕鏈核苷酸序列(SEQIDNO:40)ATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGATTCAGGCATTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGACGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTCGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTTCTGCTGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAAACAGTGGATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGTAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG不具有預(yù)測(cè)的信號(hào)序列的130M23重鏈氨基酸序列(SEQIDNO:41)EVKLVESGGGLVKPGGSLKFSCAASGFSFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNVRNILYLQMSSLRSEDTAMYFCARGGDPGVYNGDYEDAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK不具有預(yù)測(cè)的信號(hào)序列的130M23輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:42)DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSSAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTNSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC不具有預(yù)測(cè)的信號(hào)序列的人RSPO2蛋白序列(SEQIDNO:43)QGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTIPCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDRANQ人RSPO2的22～205位氨基酸(SEQIDNO:44)QGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTIPCPTIAESRRCKMTMRHCPG人RSPO2弗林蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域1(SEQIDNO:45)YVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYG人RSPO2弗林蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域2(SEQIDNO:46)MNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAP人RSPO2血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:47)GCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTIPCPTIAESRRCKMTMRHCP不具有預(yù)測(cè)的信號(hào)序列的人RSPO3蛋白序列(SEQIDNO:48)QNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLESSKEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVH人RSPO3弗林蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域1(SEQIDNO:49)PNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYG人RSPO3弗林蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域2(SEQIDNO:50)INKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEA人RSPO3血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:51)HCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQh89M5-H2L2重鏈核苷酸序列(SEQIDNO:52)ATGGACTGGACCTGGAGGATACTCTTTCTCGTGGCAGCAGCCACAGGAGCCCACTCCCAGGTCCAGCTCGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCTGTGAAGGTTTCCTGCAAGACTTCTGGATACACCTTCACTGGATACACCATGCACTGGGTTAGACAGGCCCCCGGACAAAGGCTGGAGTGGATGGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACTTACAACCAGAACTTCAAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCAAGCACAGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGATCTGAAGACACAGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAAGGAGTTCTCTGATGGATACTACTTTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCAGCTCAGCCAGCACAAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA具有預(yù)測(cè)的下劃線信號(hào)序列的h89M5-H2L2重鏈氨基酸序列(SEQIDNO:53)MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTGYTMHWVRQAPGQRLEWMGGINPNNGGTTYNQNFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKh89M5-H2L2重鏈可變區(qū)核苷酸序列(SEQIDNO:54)CAGGTCCAGCTCGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCTGTGAAGGTTTCCTGCAAGACTTCTGGATACACCTTCACTGGATACACCATGCACTGGGTTAGACAGGCCCCCGGACAAAGGCTGGAGTGGATGGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACTTACAACCAGAACTTCAAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCAAGCACAGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGATCTGAAGACACAGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAAGGAGTTCTCTGATGGATACTACTTTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCAGCTCAh89M5-H2L2重鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:55)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTGYTMHWVRQAPGQRLEWMGGINPNNGGTTYNQNFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSh89M5-H2L2輕鏈核苷酸序列(SEQIDNO:56)ATGGACATGAGGGTCCCCGCACAGCTCCTGGGGCTCCTGCTCCTCTGGCTCCGGGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGATTTTTGCTGTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCCGGCACACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTACACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGGACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAACACCCTGACACTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCCCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGCTAA具有預(yù)測(cè)的下劃線信號(hào)序列的h89M5-H2L2輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:57)MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVIFAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECh89M5-H2L2輕鏈可變區(qū)核苷酸序列(SEQIDNO:58)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGATTTTTGCTGTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCCGGCACACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTACACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAh89M5-H2L2輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:59)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVIFAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIKh130M23-H1L2重鏈核苷酸序列(SEQIDNO:60)ATGGAACTGGGACTCAGATGGGTTTTCCTCGTTGCTATTCTGGAAGGAGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGATCTCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCTCCTCTTATGCCATGTCTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGGTCTCATCCATTTCTAGTGGAGGTAGCACATATTATCCTGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGTGGAGATCCTGGGGTCTACAATGGAGATTACGAAGATGCTATGGACTACTGGGGGCAAGGAACAACAGTCACAGTCAGCTCAGCCAGCACAAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA具有預(yù)測(cè)的下劃線信號(hào)序列的h130M23-H1L2重鏈氨基酸序列(SEQIDNO:61)MELGLRWVFLVAILEGVQCEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDPGVYNGDYEDAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKh130M23-H1L2重鏈可變區(qū)核苷酸序列(SEQIDNO:62)GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGATCTCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCTCCTCTTATGCCATGTCTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGGTCTCATCCATTTCTAGTGGAGGTAGCACATATTATCCTGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGTGGAGATCCTGGGGTCTACAATGGAGATTACGAAGATGCTATGGACTACTGGGGGCAAGGAACAACAGTCACAGTCAGCTCAh130M23-H1L2重鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:63)EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDPGVYNGDYEDAMDYWGQGTTVTVSSh130M23-H1L2輕鏈核苷酸序列(SEQIDNO:64)ATGAAATACCTCCTCCCTACAGCTGCCGCTGGACTCCTCCTCCTCGCTGCCCAGCCTGCCATGGCCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCTCCCTGTCTGCTTCCGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGTCCTCTGCTGTCGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCAGGCACACAGGAGTCCCTTCCAGGTTCTCCGGCTCTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTCCGTGCAAGCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACATTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAAGAACTGTGGCTGCACCTTCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGCTCAAATCTGGAACTGCCTCCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCTAGAGAGGCCAAAGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGTCTGTCACAGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTCAGCAACACCCTGACACTGTCTAAAGCTGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGACTGAGCTCCCCCGTCACAAAATCCTTCAACAGGGGAGAGTGCTAA具有預(yù)測(cè)的下劃線信號(hào)序列的h130M23-H1L2輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:65)MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECh130M23-H1L2輕鏈可變區(qū)核苷酸序列(SEQIDNO:66)GACATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCTCCCTGTCTGCTTCCGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGTCCTCTGCTGTCGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCAGGCACACAGGAGTCCCTTCCAGGTTCTCCGGCTCTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTCCGTGCAAGCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACATTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAh130M23-H1L2輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:67)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIK不具有預(yù)測(cè)的信號(hào)序列的h89M5-H2L2重鏈氨基酸序列(SEQIDNO:68)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTGYTMHWVRQAPGQRLEWMGGINPNNGGTTYNQNFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK不具有預(yù)測(cè)的下劃線信號(hào)序列的h89M5-H2L2輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:69)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVIFAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC不具有預(yù)測(cè)的下劃線信號(hào)序列的h130M23-H1L2重鏈氨基酸序列(SEQIDNO:70)EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDPGVYNGDYEDAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK不具有預(yù)測(cè)的下劃線信號(hào)序列的h130M23-H1L2輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:71)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECh130M23-H1L6輕鏈核苷酸序列(SEQIDNO:72)ATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGATTCAGGCATTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGACGGAGACATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCTCCCTGTCTGCTTCCGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGTCCTCTGCTGTCGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCAGGCACACAGGAGTCCCTTCCAGGTTCTCCGGCTCTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTCCCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACATTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAAGAACTGTGGCTGCACCTTCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGCTCAAATCTGGAACTGCCTCCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCTAGAGAGGCCAAAGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGTCTGTCACAGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTCAGCAACACCCTGACACTGTCTAAAGCTGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGACTGAGCTCCCCCGTCACAAAATCCTTCAACAGGGGAGAGTGCTAA具有預(yù)測(cè)的下劃線信號(hào)序列的h130M23-H1L6輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:73)MGIKMESQIQAFVFVFLWLSGVDGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC不具有預(yù)測(cè)的下劃線信號(hào)序列的h130M23-H1L6輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:74)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECh130M23-H1L6輕鏈可變區(qū)核苷酸序列(SEQIDNO:75)GACATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCTCCCTGTCTGCTTCCGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGTCCTCTGCTGTCGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCAGGCACACAGGAGTCCCTTCCAGGTTCTCCGGCTCTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTCCCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACATTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAh130M23-H1L6輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:76)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIK當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3