本發(fā)明涉及生物催化技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種增加大腸桿菌胞內(nèi)磷酸吡哆醛（PLP）合成的基因工程菌及其在生產(chǎn)1,5-戊二胺中的用途。

背景技術(shù)：

1,5-戊二胺（簡稱戊二胺），即尸胺，是生物體內(nèi)廣泛存在的具有生物活性的含氮堿，為蛋白質(zhì)腐敗時賴氨酸在脫羧酶作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)時生成的產(chǎn)物。在農(nóng)業(yè)上, 1,5-戊二胺可用于調(diào)控植物衰老過程、促進雌雄蕊的發(fā)育,改善植物果實發(fā)育,提高果實產(chǎn)量；醫(yī)學上，亦可以作為一種有效治療痢疾的藥物成份；工業(yè)上是一種極為重要的化工原料，與己二酸、琥珀酸和癸二酸等二元酸聚合可分別形成新型材料聚酰胺5.6、聚酰胺5.4和聚酰胺5.10。

目前合成戊二胺的方法有化學合成法、酶轉(zhuǎn)化法、微生物發(fā)酵生產(chǎn)法等?；瘜W合成法條件苛刻、污染環(huán)境；酶轉(zhuǎn)化法過程復(fù)雜、成本較高；微生物直接發(fā)酵生產(chǎn)法雖相對生產(chǎn)原料成本較低，但直接發(fā)酵生產(chǎn)的戊二胺含量較低，且發(fā)酵液成分復(fù)雜，副產(chǎn)物多，產(chǎn)物的分離純化比較困難。

全細胞催化是指利用完整的生物有機體作為催化劑進行化學轉(zhuǎn)化，其本質(zhì)是利用細胞內(nèi)的酶進行催化，是介于發(fā)酵法和提取酶催化法之間的一種生物催化技術(shù)。相比發(fā)酵法，全細胞催化克服了發(fā)酵法生產(chǎn)周期長、代謝產(chǎn)物復(fù)雜、底物轉(zhuǎn)化率低、產(chǎn)物分離提取困難及能耗高等缺點。相比純酶催化反應(yīng)，全細胞中各酶系維持原有狀態(tài)和特定位置，酶穩(wěn)定性更好，半衰期更長，適應(yīng)性更強，更易實現(xiàn)能量和輔酶的原位再生；細胞內(nèi)完整的多酶體系可以實現(xiàn)酶的級聯(lián)反應(yīng)，催化效率高。全細胞催化的另一特點是不需考慮催化產(chǎn)物對細胞的毒害作用，非常適合類似1,5-戊二胺等對細胞有毒性的物質(zhì)的生產(chǎn)。

專利CN 103725724 A中利用固定化的蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei ）AS1.1009，通過流加200 g/l的L-賴氨酸母液，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)得到1,5-戊二胺60.54 g/l。專利US 7189543中將E.coli W3110(ATCC 39936)的賴氨酸脫羧酶基因（cadA）克隆到質(zhì)粒pUC18上，而后轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中構(gòu)建了一株基因工程菌株，并利用該菌株采用全細胞催化技術(shù)生產(chǎn)1,5-戊二胺，其在反應(yīng)液中濃度達到69 g/l，是目前報道最高產(chǎn)量。

已知兩種存在于大腸桿菌中賴氨酸脫羧酶(CadA和LdcC)，都需要磷酸吡哆醛（PLP）作為輔酶。經(jīng)實驗驗證（詳見實施例2），在全細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)戊二胺過程中加入賴氨酸脫羧酶的輔酶磷酸吡哆醛，對維持生產(chǎn)菌株的1,5-戊二胺轉(zhuǎn)化能力有顯著作用。同時也表明，菌株胞內(nèi)自身合成的PLP無法滿足賴氨酸脫羧酶高效轉(zhuǎn)化L-賴氨酸生成1,5-戊二胺的需求。其部分原因是大腸桿菌合成PLP主要依賴1-脫氧-5-磷酸木酮糖途徑，該途徑需7種酶參與，合成效率較低；相比較，生物體中存在另一種依賴核糖-5-磷酸的PLP合成途徑，該途徑只需兩個酶參與即可利用細胞中較充足存在的核糖-5-磷酸、甘油醛-3-磷酸和谷氨酰胺一步合成PLP，且該途徑廣泛分布于包括真菌、植物及部分原核生物細胞中，參與PLP合成的酶為YaaD（又稱PdxS、Pdx1或SnzP）和 YaaE （又稱PdxT、 Pdx2, 或SnoP）。此外，菌體胞內(nèi)的PLP含量是受嚴格調(diào)控的，其含量過高或過低均會對菌體造成傷害。（見Pease A J, Roa B R, Luo W, Winkler M E. Positive Growth Rate-Dependent Regulation of the pdxA, ksgA, and pdxB Genes of Escherichia coli K-12 [J]. Journal of bacteriology, 2002, 184(5): 1359-69.）因此，要增加菌體胞內(nèi)PLP的含量，不僅要改造菌體胞內(nèi)PLP的合成途徑，還需要優(yōu)化菌體培養(yǎng)方法，從而實現(xiàn)在不影響菌體生長的前提下，提高菌體積累PLP的能力，進而構(gòu)建出高效的1,5-戊二胺生產(chǎn)菌株。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種增加大腸桿菌胞內(nèi)磷酸吡哆醛（PLP）合成的基因工程菌及該菌在生產(chǎn)1,5-戊二胺中的用途。

為解決的上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種重組表達載體，其含有磷酸吡哆醛（PLP）合成基因。

本發(fā)明所述核糖-5-磷酸途徑依賴的磷酸吡哆醛（PLP）合成基因來源沒有特別限制，但是優(yōu)選使用來源于（例如）芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）等原核生物。

進一步的，所述的表達yaaD的氨基酸序列為SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其突變體。

進一步的，所述的表達yaaE氨基酸序列為SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其突變體。

另一方面，本發(fā)明還公開了一種基因工程菌，其含有上述所述的重組表達載體。

進一步的，所述的基因工程菌，還包括質(zhì)粒pETDuet-pelB-CadB-CadA。

本發(fā)明中所述產(chǎn)戊二胺的基因工程菌所使用的載體系列包括：pETDuet系列質(zhì)粒、pACYCDuet系列、pRSFDuet系列、pCDFDuet系列、pET系列、pGEX系列、pMAL系列、、pTXB1系列、pTYB系列。

本發(fā)明中所述產(chǎn)戊二胺的基因工程菌，其特征在于所述的能高效表達外源基因的宿主菌為下列之一：BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。

另一方面，本申請公開了所述基因工程菌在生產(chǎn)1,5-戊二胺中的用途。

優(yōu)選的，基因工程菌的培養(yǎng)基以甘油與乳糖作為碳源，二者比例為1:1~7:3，總糖量為2%；以氯化銨或硫酸銨為氮源，培養(yǎng)基C/N比為3:2~3:4。

另外，

本發(fā)明中，種子培養(yǎng)基為用于培養(yǎng)大腸桿菌的常規(guī)培養(yǎng)基，如LB培養(yǎng)基。

本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基，可以使用含有可同化的碳源、氮源及無機鹽類等的營養(yǎng)培養(yǎng)基。作為碳源，可以使用例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉水解產(chǎn)物等，優(yōu)選甘油。作為氮源，可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、碳酸銨、醋酸銨等各種無機和有機銨鹽類，尿素，其它含氮化合物，以及肉類提取物、酵母提取物、玉米漿、大豆水解產(chǎn)物等含氮有機物，優(yōu)選氯化銨和硫酸銨。作為無機鹽，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、碳酸鈣、氯化鈉、硫酸銨、鉬酸銨等。此外，根據(jù)需要，可以添加生物素、硫胺素、維生素B6等微量營養(yǎng)源。

所述的底物L-賴氨酸優(yōu)選為L-賴氨酸鹽酸鹽，也可以為其他賴氨酸鹽，例如賴氨酸·己二酸鹽、賴氨酸·癸二酸鹽、賴氨酸·琥珀酸酸鹽等。

對于轉(zhuǎn)化過程pH的調(diào)節(jié)，優(yōu)選使用鹽酸或二羧酸。pH調(diào)節(jié)到5~8，優(yōu)選控制在pH 5.6。

本發(fā)明中，表達yaaD和yaaE的核酸序列來源廣泛，真菌、植物及部分原核生物細胞中的YaaD（又稱PdxS、Pdx1或SnzP）和 YaaE （又稱PdxT、 Pdx2, 或SnoP）核酸序列序列均可。

本發(fā)明所述的產(chǎn)戊二胺基因工程菌的構(gòu)建、表達及應(yīng)用的效果具體體現(xiàn)在：

提供了一種有效提高胞內(nèi)PLP含量的基因構(gòu)建策略，實現(xiàn)胞內(nèi)PLP的高效合成，并保障菌體的正常生長。

（1）提供了一種利用胞內(nèi)PLP合成積累的培養(yǎng)策略，并實現(xiàn)與L-賴氨酸脫羧酶及賴氨酸-尸胺反向轉(zhuǎn)運蛋白協(xié)調(diào)表達策略，從而實現(xiàn)在不另外添加PLP的情況下，高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)戊二胺。

（2）所得基因工程菌菌體活性高，實現(xiàn)胞內(nèi)PLP含量達到1144 nmol/gDCW，單位菌體的1,5-戊二胺生產(chǎn)強度達到25 g/gDCW/h，1,5-戊二胺含量達到210 g/l，遠優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)報道。

附圖說明

圖1為質(zhì)粒pRSF-yaaDE構(gòu)建示意圖。

圖2為磷酸吡哆醛（PLP）的添加對基因工程菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1,5-戊二胺的影響。

圖3為基因工程菌胞內(nèi)磷酸吡哆醛（PLP）含量及1,5-戊二胺產(chǎn)率。

圖4為基因工程菌培養(yǎng)條件優(yōu)化。

圖5、圖6、圖7為補料分批全細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1,5-戊二胺。

圖8為基因工程菌全細胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)物MS分析結(jié)果（單丹酰尸胺）。

圖9為基因工程菌全細胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)物MS分析結(jié)果（雙丹酰尸胺）。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1 產(chǎn)1,5-戊二胺菌株的構(gòu)建

根據(jù)枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis (GenBank: AL009126.3)

的磷酸吡哆醛合成酶基因序列設(shè)計引物：

YaaDE-NcoI-F：CATGccATGGCTCAAACAGGTACTGAACG；

YaaDE-SalI-R:ACGCGTCGACTTATACAAGTGCCTTTTGCTTATATTCCTCAACC。

PCR得到的yaaDE基因克隆至質(zhì)粒pRSF質(zhì)粒上，構(gòu)建得到質(zhì)粒pRSF-yaaDE (圖1)。yaaDE核苷酸序列如SEQ ID NO：1，將質(zhì)粒pETDuet-pelB-CadB-CadA（見本發(fā)明人的公開專利申請文獻：發(fā)明名稱為一種表達重組載體及其應(yīng)用，申請公布號CN104498519A）和pRSF-yaaDE用常規(guī)方法均導入大腸桿菌BL21 (DE3)，菌株命名為BL-BADE，并以甘油菌或凍干菌種形式保存。

實施例2 外源添加磷酸吡哆醛（PLP）對1,5-戊二胺合成的影響

挑取BL- DAB（見本發(fā)明人的公開專利申請文獻：發(fā)明名稱為一種表達重組載體及其應(yīng)用，申請公布號CN104498519A）單菌落于5ml含100 ug/ml 氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 rpm過夜活化菌種?；罨木N按1%接種量轉(zhuǎn)接到50 ml 含相應(yīng)抗生素（100 ug/ml 氨芐青霉素）的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中， 37℃、200 rpm 培養(yǎng)至OD600約為0.5。加入IPTG至終濃度0.5 mM，30 ℃，200 rpm誘導培養(yǎng)12h后4000 x g 離心收集菌體細胞，用0.9%的氯化鈉溶液洗滌兩遍后用轉(zhuǎn)化反應(yīng)液重懸到細胞濃度為4 g(DCW)/l，轉(zhuǎn)化反應(yīng)液含L-賴氨酸鹽酸鹽至終濃度125 g/l （相當于L-賴氨酸濃度為100 g/l）。重懸菌液分為兩組，一組添加終濃度為0.1 mM PLP；另一組為對照組（即不添加PLP組）。37 ℃，250 rpm轉(zhuǎn)化，每隔三小時取樣檢測上清中L-賴氨酸及1,5-戊二胺含量。

L-賴氨酸含量使用SBA-40E型生物傳感儀進行檢測。1,5-戊二胺含量用丹磺酰氯衍生化后，反相高效液相色譜檢測。衍生步驟如下：移取100 ul離心后的轉(zhuǎn)化液到5 ml離心管中，依次加入2 M NaOH溶液200 μl, 飽和NaHCO3溶液300 μl ，10 g/1的1,7-二氨基庚烷溶液（內(nèi)標）100 μl及10 g/l 的丹磺酰氯溶液1 ml?；靹蚝笾糜?0 ℃水浴中避光反應(yīng)45 min，而后加入25%的氨水100 μl，混勻后室溫避光靜置30 min。反應(yīng)結(jié)束后，用乙腈定容至5 ml。HPLC分析使用agilent 1290 infinity system，色譜柱為Prevail C18反向柱(250 mm × 4.6 mm × 5 μm)。HPLC條件為：流動相A：100% 乙腈，流動相B：0.1 M 乙酸銨溶液，采用梯度洗脫，條件如下：初始：50% A；19 min：90% A；20-30 min：50% A；流速：1.0 ml/min；柱溫：40±1 °C；進樣量：10 μl。檢測使用熒光檢測器 (FLD G1321B)，激發(fā)波長：320 nm；發(fā)射波長：523 nm。

結(jié)果如圖2所示，不添加PLP條件下，單位質(zhì)量菌體的1,5-戊二胺產(chǎn)率從3 h的3.91 g/gDCW/h下降到9 h的2.30 g/gDCW/h，降低了41%。而當添加0.1 mM PLP時，單位質(zhì)量菌體的1,5-戊二胺產(chǎn)率僅下降5%。結(jié)果表明，外源PLP的添加對維持菌體活力有顯著效果。

實施例3 基因工程菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1,5-戊二胺

挑取單菌落BL-BADE于5ml含100 ug/ml 氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 rpm過夜活化菌種?；罨木N按1%接種量轉(zhuǎn)接到50 ml 含相應(yīng)抗生素（100 ug/ml 氨芐青霉素，170 μg/ml氯霉素）的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中， 37℃、200 rpm 培養(yǎng)至OD600約為0.5。加入IPTG至終濃度0.5 mM，30 ℃，200 rpm誘導培養(yǎng)12h后4000 x g 離心收集菌體細胞，取10 mg（干重）菌體細胞檢測胞內(nèi)PLP含量。剩余菌體用0.9%的氯化鈉溶液洗滌兩遍后用轉(zhuǎn)化反應(yīng)液重懸到細胞濃度為2 g(DCW)/l，轉(zhuǎn)化反應(yīng)液含L-賴氨酸鹽酸鹽至終濃度12.5 g/l （相當于L-賴氨酸濃度為10 g/l），37 ℃，250 rpm轉(zhuǎn)化30分鐘后，6000 x g離心后，檢測上清中L-賴氨酸及1,5-戊二胺含量。

L-賴氨酸和1,5-戊二胺含量檢測方法見實施例2。

胞內(nèi)PLP含量檢測采用反相高效液相色譜法，條件為：流動相A（pH 3.0）：0.1 M 磷酸二氫鉀, 0.1 M 高氯酸鈉和0.5 g/L 亞硫酸鈉;流動相B（pH 3.0）：0.1 M 磷酸二氫鉀, 0.1 M 高氯酸鈉，0.5 g/L 亞硫酸鈉和20% 乙腈。 采用梯度洗脫，條件如下：0-4 min :100% A；4.1 to 13 min：27% B；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ± 1°C；進樣量：20 μl。檢測使用熒光檢測器 (FLD G1321B)，激發(fā)波長：300 nm；發(fā)射波長：400 nm。

結(jié)果如圖3所示，經(jīng)30分鐘轉(zhuǎn)化后，基因工程菌BL-BADE的胞內(nèi)PLP含量達到533 nmol/gDCW，1,5-戊二胺產(chǎn)率為0.21 g /gDCW /h, 分別是對照菌株BL-DAB的1.5倍和1.6倍；是初始菌株BL21 (DE3)的5.3倍和4.7倍。

實施例4 基因工程菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

挑取BL-BADE單菌落于5ml含100 ug/ml 氨芐青霉素和170 μg/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 rpm過夜活化菌種。活化的菌種按1%接種量轉(zhuǎn)接到50 ml 含100 ug/ml 氨芐青霉素和170 ug/ml氯霉素的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中， 37℃、200 rpm 培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)接優(yōu)化培養(yǎng)基中。優(yōu)化培養(yǎng)基以甘油與乳糖作為碳源，二者比例為1:1~7:3，總糖量為2%；以氯化銨為氮源，培養(yǎng)基C/N比為3:2~3:4；對比試驗以LB培養(yǎng)基使用IPTG誘導作為對照。37 ℃，200 rpm誘導培養(yǎng)6 h后4,000 × g離心10 min收集菌體并進行全細胞轉(zhuǎn)化試驗及檢測胞內(nèi)PLP含量。

全細胞轉(zhuǎn)化條件同實施例3。轉(zhuǎn)化液中L-賴氨酸、1,5-戊二胺和胞內(nèi)PLP含量檢測方法見實施例2和實施例3。

結(jié)果如圖4所示，利用優(yōu)化培養(yǎng)基得到的菌株BL-BADE胞內(nèi)PLP含量達到1051 nmol/gDCW，菌株1,5-戊二胺產(chǎn)率達到0.7 g /gDCW/h，與LB培養(yǎng)基添加IPTG誘導相比，分別提高了1.97倍和3.5倍。且生物量沒有顯著差異。

實施例5 補料分批全細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1,5-戊二胺

挑取單菌落于5ml含100 ug/ml 氨芐青霉素和170 μg/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 rpm過夜活化菌種。活化的菌種按1%接種量轉(zhuǎn)接到250 ml 含100 ug/ml 氨芐青霉素和170 μg/ml氯霉素的種子培養(yǎng)基中，37℃、200 rpm 培養(yǎng)8h。而后按10 %比例接種到4 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200 rpm, 1 vvm，培養(yǎng)12小時，離心收集菌體。種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：1.2% (W/V) 蛋白胨、2.4% (W/V) 酵母提取物、0.4% (V/V) 甘油、17 mM KH2PO4、72 mM K2HPO4。

轉(zhuǎn)化體系包括：菌體8 gDCW/l， L-賴氨酸量150 g/l。轉(zhuǎn)化條件為37 ℃，200 rpm，轉(zhuǎn)化4小時，其間補加5 M 鹽酸維持pH穩(wěn)定。轉(zhuǎn)化過程中定期檢測轉(zhuǎn)化液中L-賴氨酸含量，當賴氨酸消耗至2.5 ~ 4 g /g DCW時，補加底物至150 g/l。

轉(zhuǎn)化液中L-賴氨酸含量使用SBA-40E型生物傳感儀進行檢測。1,5-戊二胺含量用丹磺酰氯衍生化后，HPLC-MS分析。衍生化操作見實施例2。

HPLC-MS分析使用電噴霧離子質(zhì)譜，色譜柱為Prevail C18反向柱(250 mm × 4.6 mm × 5 μm)。HPLC條件為：流動相A：100% 乙腈，流動相B：0.1 M 乙酸銨溶液，采用梯度洗脫，條件如下：初始：50% A；19 min：90% A；20-30 min：50% A；流速：1.0 ml/min；柱溫：40±1 °C；進樣量：10 μl。檢測使用紫外檢測器，檢測波長254 nm。

結(jié)果如圖5所示，菌株BL-BADE在不添加PLP情況下的產(chǎn)率相當于(p=0.143, α=0.05) 添加0.1 mM PLP的菌株BL-DAB的產(chǎn)量，轉(zhuǎn)化液中1,5-戊二胺含量達到210 g/l,最大1,5-戊二胺產(chǎn)率可達到 25 g /gDCW/h，是菌株BL-DAB在不添加PLP情況下的2.9倍；且菌株可維持該產(chǎn)率達1小時，第一小時1,5-戊二胺的平均產(chǎn)率為24 ± 1 g /gDCW/h，是菌株BL-DAB在添加0.1 mM PLP條件下的產(chǎn)率（20 ± 1 g /gDCW/h）的1.2倍（如圖6所示）。經(jīng)過4小時的轉(zhuǎn)化，單位質(zhì)量菌株BL-BADE可生產(chǎn)1,5-戊二胺76 g/L，略高于菌株BL-DAB在添加了0.1 mM PLP下的產(chǎn)率（71.9 g/L）（如圖7所示）。

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)HPLC-MS分析，單丹酰尸胺（圖8）分子量為335（336-1=335），雙丹酰尸胺（圖9）分子量為568（569-1=568），分別于單丹酰尸胺和雙丹酰尸胺的分子量吻合。

本實施例結(jié)果說明本發(fā)明所公開的1,5-戊二胺生產(chǎn)菌構(gòu)建策略可有效協(xié)調(diào)賴氨酸的攝取、賴氨酸脫羧及戊二胺外排等過程，并可高效從頭合成脫羧反應(yīng)所需的輔酶磷酸吡哆醛（PLP），以滿足菌體高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1,5-戊二胺的需求。所構(gòu)建的菌種生產(chǎn)能力強，配合本發(fā)明公開的培養(yǎng)策略，可轉(zhuǎn)化生產(chǎn)得到高濃度的1,5-戊二胺的溶液，遠優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)報道。

本發(fā)明的范圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只作為闡明本發(fā)明各個方面的單個例子，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內(nèi)容外，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發(fā)明的多種改進。所述改進也落入所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。上文提及的每篇參考文獻皆全文列入本文作為參考。

序列表

<110> 南京工業(yè)大學

<120> 一種基因工程菌及其在生產(chǎn)1,5-戊二胺中的用途

<130> xb16052702

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1497

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

atggctcaaa caggtactga acgtgtaaaa cgcggaatgg cagaaatgca aaaaggcggc 60

gtcatcatgg acgtcatcaa tgcggaacaa gcgaaaatcg ctgaagaagc tggagctgtc 120

gctgtaatgg cgctagaacg tgtgccagca gatattcgcg cggctggagg agttgcccgt 180

atggctgacc ctacaatcgt ggaagaagta atgaatgcag tatctatccc ggtaatggca 240

aaagcgcgta tcggacatat tgttgaagcg cgtgtgcttg aagctatggg tgttgactat 300

attgatgaaa gtgaagttct gacgccggct gacgaagaat ttcatttaaa taaaaatgaa 360

tacacagttc cttttgtctg tggctgccgt gatcttggtg aagcaacacg ccgtattgcg 420

gaaggtgctt ctatgcttcg cacaaaaggt gagcctggaa caggtaatat tgttgaggct 480

gttcgccata tgcgtaaagt taacgctcaa gtgcgcaaag tagttgcgat gagtgaggat 540

gagctaatga cagaagcgaa aaacctaggt gctccttacg agcttcttct tcaaattaaa 600

aaagacggca agcttcctgt cgttaacttt gccgctggcg gcgtagcaac tccagctgat 660

gctgctctca tgatgcagct tggtgctgac ggagtatttg ttggttctgg tatttttaaa 720

tcagacaacc ctgctaaatt tgcgaaagca attgtggaag caacaactca ctttactgat 780

tacaaattaa tcgctgagtt gtcaaaagag cttggtactg caatgaaagg gattgaaatc 840

tcaaacttac ttccagaaca gcgtatgcaa gaacgcggct ggtaagaaca taggagcgct 900

gctgacatgt taacaatagg tgtactagga cttcaaggag cagttagaga gcacatccat 960

gcgattgaag catgcggcgc ggctggtctt gtcgtaaaac gtccggagca gctgaacgaa 1020

gttgacgggt tgattttgcc gggcggtgag agcacgacga tgcgccgttt gatcgatacg 1080

tatcaattca tggagccgct tcgtgaattc gctgctcagg gcaaaccgat gtttggaaca 1140

tgtgccggat taattatatt agcaaaagaa attgccggtt cagataatcc tcatttaggt 1200

cttctgaatg tggttgtaga acgtaattca tttggccggc aggttgacag ctttgaagct 1260

gatttaacaa ttaaaggctt ggacgagcct tttactgggg tattcatccg tgctccgcat 1320

attttagaag ctggtgaaaa tgttgaagtt ctatcggagc ataatggtcg tattgtagcc 1380

gcgaaacagg ggcaattcct tggctgctca ttccatccgg agctgacaga agatcaccga 1440

gtgacgcagc tgtttgttga aatggttgag gaatataagc aaaaggcact tgtataa 1497

<210> 2

<211> 294

<212> PRT

<213> yaaD of 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis

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Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met

1 5 10 15

Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys

20 25 30

Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val

35 40 45

Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro

50 55 60

Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala

65 70 75 80

Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met

85 90 95

Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu

100 105 110

Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly

115 120 125

Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser

130 135 140

Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala

145 150 155 160

Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala

165 170 175

Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro

180 185 190

Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val

195 200 205

Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met

210 215 220

Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys

225 230 235 240

Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr

245 250 255

His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly

260 265 270

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290

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<212> PRT

<213> yaaE of 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis

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Ile His Ala Ile Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys Arg

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Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly Glu

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Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu Pro

50 55 60

Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys Ala

65 70 75 80

Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro His

85 90 95

Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg Gln

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Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu Pro

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Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala Lys

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Gln Gly Gln Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu Asp

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His Arg Val Thr Gln Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lys Gln

180 185 190

Lys Ala Leu Val

195