本發(fā)明為分子生物學技術(shù)領域，涉及一種分子生物學技術(shù)領域的質(zhì)粒分子，具體涉及一種用于轉(zhuǎn)基因小麥檢測的標準質(zhì)粒分子及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

轉(zhuǎn)基因作物又稱基因改造作物或基因改良作物。通過對基因的改良，人為地給某一作物植入另一種生物的遺傳基因，從而達到提高產(chǎn)量、增加營養(yǎng)、抗病、抗旱、抗蟲等目的。自1983年全球第一例轉(zhuǎn)基因煙草在美國問世以來，轉(zhuǎn)基因作物在農(nóng)業(yè)領域的作用越來越重要。

小麥作為世界主要糧食來源，其種植面積、總產(chǎn)量和總貿(mào)易額均居各類作物之首，其轉(zhuǎn)基因遺傳改良受到廣泛關注。在糧食作物中，小麥屬于遺傳轉(zhuǎn)化最為困難的作物，轉(zhuǎn)基因研究起步較晚。1993年Weeks等(Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat(Triticum aestivum L).Plant Physiol，1993，102(4)：1077-1084)利用基因槍介導法將bar等基因?qū)肓诵←?，建立了基因槍轉(zhuǎn)化小麥的技術(shù)體系。1997年Cheng等(Genetic transformat of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens，Plant Physiol，1997，115(3)：971-980)首次利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化小麥獲得了攜帶NPTII等基因的轉(zhuǎn)基因植株。同年，由Barro F等(Transformation of wheat with high molecular weight subunit genes results in improved functional properties.Nature Biotechnology，1997，15：1295-1299)使用基因槍將pIDx5、pAHC25兩個質(zhì)粒通過共轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入小麥品種中得到了轉(zhuǎn)基因小麥B73-6-1。該轉(zhuǎn)基因小麥品系可改變其面包制品的烘烤品質(zhì)，同時具有抗除草劑基因Bar，具有抗草丁膦特性。

進行轉(zhuǎn)基因檢測目前主要有兩類技術(shù)：一類為核酸檢測方法，例如PCR和基因芯片等，另一類為蛋白檢測方法，例如ELISA等，其中PCR檢測方法應用最為廣泛。通過PCR法進行轉(zhuǎn)基因檢測按策略可分為四種：通用原件篩選檢測、基因特異性檢測、結(jié)構(gòu)特異性檢測和品系特異性檢測。通用原件篩選檢測主要是檢測轉(zhuǎn)基因常見的啟動子和終止子；基因特異性檢測主要是檢測插入的外源基因片段；結(jié)構(gòu)特異性檢測主要是檢測插入外源DNA序列之間連接處的核酸序列；品系特異性檢測主要檢測外源DNA與植物基因組的連接處的核酸序列。

在進行PCR檢測時，除了設置必要的陰性對照對檢測進行監(jiān)控外，還應設置陽性對照來排除PCR體系可能存在的抑制因子和驗證體系的正確性。一般來說，PCR檢測應以從陽性標準品種提取的基因組DNA作為陽性對照，但是由于轉(zhuǎn)基因生物安全性等種種限制，轉(zhuǎn)基因作物陽性標準品難以獲得，因此需要研發(fā)一種容易獲得的陽性對照材料以滿足轉(zhuǎn)基因檢測的需要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種轉(zhuǎn)基因小麥檢測用標準質(zhì)粒分子及構(gòu)建方法，使其可以代替各種轉(zhuǎn)基因小麥陽性標準物質(zhì)用于轉(zhuǎn)基因小麥的定性、定量PCR檢測。根據(jù)目前小麥常見轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列和內(nèi)參WaXY-D1基因序列片段，進行人工序列合成，然后利用重疊PCR反應的原理設計特異PCR引物，經(jīng)過PCR擴增獲得轉(zhuǎn)基因小麥常見元件和內(nèi)參基因WaXY-D一段序列的重組DNA片段。利用分子克隆技術(shù)將重組DNA片段克隆到pMD-19T載體中，獲得新的質(zhì)粒分子(命名為pPONY-TEST01。本發(fā)明構(gòu)建的標準質(zhì)粒分子可代替遺轉(zhuǎn)基因小麥原有的陽性標準物質(zhì)，用于定性和定量PCR檢測，徹底解決轉(zhuǎn)基因小麥檢測中標準物質(zhì)缺乏的難題。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明所述標準質(zhì)粒分子，以替代轉(zhuǎn)基因小麥的陽性標準物質(zhì)，用于定性和定量PCR檢測。該標準質(zhì)粒分子同時含有小麥常見轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列和內(nèi)參WaXY-D1基因序列。

本發(fā)明所述標準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01構(gòu)建方法，包括如下步驟：

1)利用GenBank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)進行生物信息學分析，獲得小麥內(nèi)參基因WaXY-D1、轉(zhuǎn)基因小麥常見轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列。

所述的小麥內(nèi)參基因WaXY-D1，指的是小麥顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因，其在小麥基因組中高度保守，具有種間特異性、種內(nèi)非特異性和單拷貝數(shù)的特點。

所述的常見小麥轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin，是指玉米泛素蛋白基因啟動子，常用于轉(zhuǎn)基因單子葉植物外源基因的啟動子。

所述的常見小麥轉(zhuǎn)基因元件NPTII，是指新霉素-3’-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，常用于轉(zhuǎn)基因植物的抗生素篩選。

所述的常見小麥轉(zhuǎn)基因元件Bar，是指草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，常用于增強轉(zhuǎn)基因植物對除草劑草丁膦抗性。

所述的常見小麥轉(zhuǎn)基因元件T-NOS，是指胭脂堿合成酶終止子，常用于轉(zhuǎn)基因植物外源基因的終止子。

所述的小麥品系B73-6-1特異性序列，指的是小麥轉(zhuǎn)基因品系B73-6-1外源插入載體與小麥基因組鄰接區(qū)的DNA序列。

2)設計PCR特異性引物。

所述的PCR特異性引物，一般是指長度不大于50bp的寡核苷酸鏈，其與小麥內(nèi)參基因WaXY-D1、轉(zhuǎn)基因小麥常見轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列完全相同或者互補。

3)特異性擴增小麥內(nèi)參基因WaXY-D1、轉(zhuǎn)基因小麥常見轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列。

所述的特異性擴增，指的是利用設計的PCR引物特異性擴增小麥內(nèi)參基因WaXY-D1、轉(zhuǎn)基因小麥常見轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列。

上述涉及的PCR擴增使用的引物如下：

4)小麥內(nèi)參基因WaXY-D1、轉(zhuǎn)基因小麥常見轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列的拼接。

所述的拼接，指的是利用重疊PCR技術(shù)將小麥內(nèi)參基因WaXY-D1、轉(zhuǎn)基因小麥常見轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列幾個獨立的DNA片段連接融合成一個重組的新DNA片段。

5)含有新的重組DNA片段的質(zhì)粒分子克隆。

所述的分子克隆，指的是將上述得到的重組特異性DNA片段連接到質(zhì)粒載體pMD-19T上，獲得標準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01，其質(zhì)粒圖譜如附圖1所示，序列如SEQ ID No：1所示。此標準分子還留有Pst I和HindIII酶切位點，方便后續(xù)轉(zhuǎn)基因元件的加入，并且將pPONY-TEST01導入大腸桿菌EH5α即可長期保存使用。

6)標準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01的定性和定量PCR檢測方法驗證。

所述的定性PCR檢測方法驗證，是指標準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01包含的轉(zhuǎn)基因元件和品系特異性片段只能在轉(zhuǎn)基因小麥基因組DNA中擴增獲得，而不能在其他小麥品系，和其他轉(zhuǎn)基因作物基因組中擴增得到。

所述的定量PCR檢測方法驗證，是指檢測標準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01在進行定量PCR分析時的靈敏度，以鑒定該標準分子替代轉(zhuǎn)基因小麥陽性標準物質(zhì)的能力。

7)本發(fā)明同時提供一種檢測轉(zhuǎn)基因小麥的方法，包括以上述構(gòu)建的標準質(zhì)粒分子為陽性標準物質(zhì)，測定待測小麥樣品中是否存在待測轉(zhuǎn)基因元件及品系，以及轉(zhuǎn)基因品系的含量。

所述檢測方法，指的是采用熒光定量PCR的方法對標準質(zhì)粒中包含的轉(zhuǎn)基因元件和品系按提供的檢測引物進行定量分析并繪制標準曲線，將待測樣品按提供的檢測引物進行熒光定量PCR，通過Ct值判斷是否含有待測轉(zhuǎn)基因元件及品系，如果B73-6-1轉(zhuǎn)基因品系檢測結(jié)果為陽性，還通過標準曲線可獲得轉(zhuǎn)基因品系的含量。

上述涉及的PCR檢測使用的引物和探針如下：

本發(fā)明的有益效果在于，利用重疊PCR和分子克隆的方法構(gòu)建了含有小麥內(nèi)參基因WaXY-D1、轉(zhuǎn)基因小麥常見轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列的標準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01，并通過驗證實驗證明此標準分子可作為陽性標準物質(zhì)用于轉(zhuǎn)基因小麥的PCR檢測，很好的解決了轉(zhuǎn)基因小麥檢測過程中陽性標準物質(zhì)缺乏的問題。

附圖說明

圖1為發(fā)明構(gòu)建的標準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01的示意圖譜。

圖2為小麥內(nèi)參基因WaXY-D1、轉(zhuǎn)基因小麥常見轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列的定性檢測。

圖3為標準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01檢出限和重復性的檢測。

具體實施方式

下面以實施例為例對本發(fā)明作詳細的說明：本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件操作，可參照Sambrook等編著的分子克隆實驗指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2012)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1：標準質(zhì)粒分子的構(gòu)建

在GenBank中搜索小麥內(nèi)參基因WaXY-D1、轉(zhuǎn)基因小麥常見轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列信息。

1)構(gòu)建標準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01的PCR引物序列設計

根據(jù)獲得的小麥內(nèi)參基因WaXY-D1、轉(zhuǎn)基因小麥常見轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列，利用軟件Primer 5.0設計定性PCR引物，用于擴增小麥內(nèi)參基因WaXY-D1、轉(zhuǎn)基因小麥常見轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列。具體的引物序列見下表。

2)小麥內(nèi)參基因WaXY-D1、轉(zhuǎn)基因小麥常見轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列的擴增

根據(jù)上述引物，以含有Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS序列和B73-6-1品系的轉(zhuǎn)基因小麥為模板，對小麥內(nèi)參基因WaXY-D1、轉(zhuǎn)基因小麥常見轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS及品系B73-6-1特異性序列進行PCR擴增，最后得到各元件的擴增片段。對擴增得到的條帶進行回收純化，通過測序分析表明獲得的序列與目的擴增片段序列一致。

上述PCR反應體系為：

所述PCR反應條件為95℃10min，1個循環(huán)；95℃30s、58℃30s、72℃60s，40個循環(huán)，72℃ 10min。

3)利用重疊PCR方法對上述六個片段進行連接

用上述PCR得到的六個片段序列為模板，以WaXY-D1基因的正向引物和B73-6-1品系特異性序列的反向引物作為重疊PCR的引物對，進行PCR擴增，

實現(xiàn)六個片段的重組拼接。

具體PCR反應體系為兩步，第一步PCR反應以回收的六個片段序列為模板，不添加引物進行PCR擴增，具體為：

所述PCR反應條件為95℃10min，1個循環(huán)；95℃30s、42℃50s、72℃4min，10個循環(huán)，72℃ 10min。

第二步PCR反應以第一步PCR反應混合液為模板，添加引物進行PCR擴增，具體為：

所述PCR反應條件為95℃ 10min，1個循環(huán)；95℃30s、56℃30S、72℃2min，35個循環(huán)，72℃ 10min。對擴增得到的條帶進行回收純化。

4)重組DNA片段克隆進入pMD-19T載體

利用分子克隆的方法將上述連接獲得的重組片段連接到質(zhì)粒載體pMD-19T上，連接反應體系如下：

上述混合液42℃ 90秒，經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，進行藍白斑篩選后取陽性菌落進行PCR鑒定，鑒定正確的陽性克隆進行測序，最終得到標準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01。

構(gòu)建的標準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01的簡要圖譜如附圖1所示。圖pPONY-TEST01表示構(gòu)建標準質(zhì)粒分子的載體，插入基因元件依次為：小麥內(nèi)參基因WaXY-D1、轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS、品系B73-6-1特異性序列；品系B73-6-1特異性序列后還有Pst I和HindIII酶切位點，方便后續(xù)轉(zhuǎn)基因元件的加入。

實施例2：構(gòu)建的質(zhì)粒標準分子在實際檢測中的應用

1)標準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01的定性檢測

根據(jù)構(gòu)建的標準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01各元件序列，設計熒光PCR檢測引物和探針，具體如下：

將標準質(zhì)粒分子稀釋至2x10⁹copies/μl，以此為模板，使用上述元件檢測引物，進行熒光定量PCR。

所述的實時熒光PCR反應體系為：

所述的實時熒光PCR反應條件為95℃ 10min，1個循環(huán)；95℃，15s，58℃30s，40個循環(huán)，在每次循環(huán)的58℃/30s時收集熒光。

檢測結(jié)果顯示小麥內(nèi)參基因WaXY-D1、轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS、品系B73-6-1特異性序列均得到有效擴增，見附圖2。

2)標準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01的檢出限和重復性測定

將準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01依次稀釋為2x10⁴copies/μl、2x10³copies/μl、2x10²copies/μl、2x10¹copies/μl和2x10⁰copies/μl進行重復性和可復現(xiàn)性的測試，每個濃度使用品系B73-6-1檢測引物進行3個平行反應并重復3次，結(jié)果表明標準質(zhì)粒分子濃度為2x10⁰copies/μl時，Ct值平均為35.80，為有效擴增，表明標準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01的檢出限可達2個拷貝，具有很好的靈敏性。3個平行反應間和3次不同重復實驗間獲得的Ct值標準偏差基本上都小于0.2，說明根據(jù)構(gòu)建的pPONY-TEST01標準質(zhì)粒分子具有良好的重復性，見附圖3。

本發(fā)明構(gòu)建的標準質(zhì)粒分子pPONY-TEST01對小麥內(nèi)參基因WaXY-D1、轉(zhuǎn)基因元件Ubiquitin、NPTII、Bar、T-NOS、品系B73-6-1特異性序列的檢測引物均具可得到良好的擴增效果，且具有良好的重復性，完全可作為小麥轉(zhuǎn)基因成分檢測的陽性標準物質(zhì)使用。