本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種融合蛋白。

背景技術(shù)：

磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)，是一類普遍存在的磷脂，通常位于真核細(xì)胞膜的內(nèi)層，是細(xì)胞膜組分之一。在正常生理情況下，細(xì)胞質(zhì)膜脂的分布存在不對(duì)稱性，這是由于在細(xì)胞質(zhì)膜中存在一種磷脂轉(zhuǎn)位酶，可以特異地將磷脂酰絲氨酸(PS)與磷脂酰乙醇胺(PE)運(yùn)送到膜的內(nèi)小葉，同時(shí)，另外一種細(xì)胞質(zhì)膜中的翻轉(zhuǎn)酶負(fù)責(zé)將磷脂酰絲氨酸(PS)與磷脂酰膽堿(PC)運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)膜外小葉。這兩種酶對(duì)膜同時(shí)起作用，但翻轉(zhuǎn)酶的反應(yīng)速度比轉(zhuǎn)位酶慢10倍。這兩個(gè)酶促反應(yīng)各自獨(dú)立進(jìn)行，即當(dāng)翻轉(zhuǎn)酶的活性被抑制時(shí)，轉(zhuǎn)位酶仍有活性。在正常生理情況下，這兩種酶的作用相互協(xié)調(diào)，引起膜內(nèi)主要磷脂的不對(duì)稱分布，即鞘磷脂(SM)和磷脂酰膽堿(PC)集中分布在細(xì)胞質(zhì)膜外小葉，而磷脂酰絲氨酸(PS)與磷脂酰乙醇胺(PE)集中分布于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)小葉。這種膜脂的不對(duì)稱性分布是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，與細(xì)胞識(shí)別、內(nèi)吞與外排、凝血及某些疾病如血栓、自身免疫病等的發(fā)展有密切關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞受到損傷或出現(xiàn)早期凋亡(Apoptosis，又稱程序性細(xì)胞死亡)時(shí)，磷脂酰絲氨酸會(huì)出現(xiàn)外翻現(xiàn)象：即雙層脂質(zhì)膜上帶負(fù)電荷的絲氨酸從原來(lái)朝向細(xì)胞漿變成朝向細(xì)胞膜外，其產(chǎn)生原理或機(jī)制尚不十分清楚。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，人們通常會(huì)用熒光標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白A5(Annexin A5，原稱Annexin V)以及碘化丙錠來(lái)檢測(cè)、區(qū)分體外培養(yǎng)細(xì)胞中的正常、早期凋亡和死亡細(xì)胞。

Annexin-V，鈣離子依賴性磷脂結(jié)合膜聯(lián)蛋白家族(ANXA1-ANXA13)的成員之一，是分子量為35～36KD的Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素(FITC、PE)或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidine iodide，PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來(lái)。

早期細(xì)胞凋亡在臨床上與一系列疾病例如大腦與心肌缺血性損傷、神經(jīng)變性、自身免疫性疾病和惡性實(shí)體腫瘤損傷等相關(guān)。然而上述方法難以在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)磷脂酰絲氨酸外翻作用的示蹤和藥物靶向。

鑒于膜聯(lián)蛋白A5與凋亡細(xì)胞膜上外翻的磷脂酰絲氨酸結(jié)合的特點(diǎn)，本發(fā)明以期將磷脂酰絲氨酸的單克隆抗體、膜聯(lián)蛋白A5及其衍生重組蛋白與放射性同位素、藥物、蛋白或發(fā)光劑偶聯(lián)(融合)，用于疾病組織的示蹤(Tracer)、顯影(Imaging)、化療或光療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)該蛋白的免疫殺傷細(xì)胞或干細(xì)胞具有組織浸潤(rùn)或在疾病組織、損傷部位富集能力，可用于疾病組織的示蹤、顯影、化療或光療的融合蛋白。

本發(fā)明第一方面提供一種融合蛋白，包括第一肽段區(qū)和第二肽段區(qū)，所述第一肽段區(qū)的C端與第二肽段區(qū)的N端相連；其中，所述第一肽段區(qū)包括分泌信號(hào)肽、以及磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白肽段，所述第二肽段區(qū)包括連接肽段、以及跨膜肽段，所述磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白肽段包括抗磷脂酰絲氨酸抗體或膜聯(lián)蛋白中與磷脂酰絲氨酸特異結(jié)合的肽段。

具體的，所述連接肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；通過(guò)15個(gè)特殊氨基酸的柔性肽鏈與跨膜成分相偶聯(lián)，轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢栽谡婧思?xì)胞膜上、醫(yī)用病毒包膜上或其它脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)上錨定表達(dá)或存在的膜蛋白。

具體的，所述磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白肽段包括膜聯(lián)蛋白A5中與磷脂酰絲氨酸特異結(jié)合的肽段。

具體的，所述第一肽段區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。

本發(fā)明中的融合蛋白，其細(xì)胞內(nèi)胞漿區(qū)可以是無(wú)功能的寡肽、也可以在跨膜肽段的C端連接有一種或兩種以上的具有細(xì)胞調(diào)節(jié)功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽段。

其中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽段為興奮性的或抑制性的，例如對(duì)免疫細(xì)胞有興奮性刺激作用的CD3zeta分子的胞漿肽段以及具有共刺激作用的CD28分子的胞漿肽段；即，所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽段包括CD3zeta分子的胞漿肽段和/或CD28分子的胞漿肽段。

具體的，所示融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8或11所示。

本發(fā)明第二方面提供一種核酸分子，其包含能夠編碼前述的融合蛋白。

具體的，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7或10所示。

本發(fā)明第三方面涉及載體，其含有本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的核酸分子。

以下對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：

應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“載體”指的是，可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白獲得表達(dá)的一種核酸運(yùn)載工具。載體可通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)得以表達(dá)。舉例來(lái)說(shuō)，載體包括：質(zhì)粒；噬菌粒；柯斯質(zhì)粒；人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)或P1來(lái)源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體及動(dòng)物病毒等。用作載體的動(dòng)物病毒種類有逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。一種載體可能含有多種控制表達(dá)的元件，包括啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列、增強(qiáng)子序列、選擇元件及報(bào)告基因。另外，載體還可含有復(fù)制起始位點(diǎn)。載體還有可能包括有協(xié)助其進(jìn)入細(xì)胞的成分，如病毒顆粒、脂質(zhì)體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質(zhì)。

本發(fā)明中可表達(dá)融合蛋白的載體，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、病毒載體或病毒顆粒感染、電轉(zhuǎn)等方式，可以在任何真核細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞(粒細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或其他血液細(xì)胞)、干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞、胎盤干細(xì)胞、臍帶干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、祖細(xì)胞、iPSC以及其他具有多能性的各種組織干細(xì)胞)各種宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“多肽”指的是，是指α-氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物，也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物。通常由10-100氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫多肽，它們的分子量低于10,000Da(Dalton，道爾頓)，能透過(guò)半透膜，不被三氯乙酸及硫酸銨所沉淀。也有文獻(xiàn)把由2-10個(gè)氨基酸組成的肽稱為寡肽(小分子肽)；10-50個(gè)氨基酸組成的肽稱為多肽；由50個(gè)以上的氨基酸組成的肽就稱為蛋白質(zhì)；換言之，廣義來(lái)講，蛋白質(zhì)有時(shí)也被稱為多肽。術(shù)語(yǔ)“肽段”，指的是多肽或蛋白質(zhì)分子中，具有某一特定功能的由多個(gè)氨基酸組成的肽。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞凋亡”是指某種原因造成的“程序性細(xì)胞死亡”，區(qū)別于其他類型的細(xì)胞溶解性死亡。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞歸巢性”泛指不同細(xì)胞經(jīng)血液循環(huán)趨向性遷移并定居于某種組織的特定區(qū)域的性質(zhì)。例如淋巴細(xì)胞歸巢性和干細(xì)胞歸巢性。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“共刺激信號(hào)分子”(Co-stimulating molecule)是指免疫細(xì)胞表面的一些粘附分子，如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、CD40等，通過(guò)與其配體結(jié)合，激活免疫細(xì)胞的第二信號(hào)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的增殖能力及細(xì)胞因子的分泌功能，延長(zhǎng)活化免疫細(xì)胞的存活時(shí)間。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“胞外區(qū)”和“胞外肽段”是指膜蛋白位于細(xì)胞外的肽鏈區(qū)段。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“跨膜區(qū)”和“跨膜肽段”是指膜蛋白位于細(xì)胞雙層脂質(zhì)膜內(nèi)的肽鏈區(qū)段。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“胞漿區(qū)”和“胞漿肽段”是指膜蛋白位于細(xì)胞內(nèi)的肽鏈區(qū)段。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：運(yùn)用基因重組技術(shù)把磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白，如抗磷脂酰絲氨酸抗體或膜聯(lián)蛋白A5，轉(zhuǎn)變成細(xì)胞膜上錨定的融合蛋白。通過(guò)把具有在疾病損傷部位富集能力的膜聯(lián)蛋白A5變成各種功能性細(xì)胞的一部分，例如具有腫瘤殺傷作用的T淋巴細(xì)胞和具有再生性修復(fù)功能的間充質(zhì)干細(xì)胞，從而使功能性細(xì)胞的歸巢性改變成為可能；根據(jù)細(xì)胞類型和使用目的，重組表達(dá)的膜聯(lián)蛋白A5可以與不同的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)信號(hào)融合，從而改變?cè)摷?xì)胞的部分功能。

上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說(shuō)明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如后。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明中融合蛋白構(gòu)建示意圖；

圖2是本發(fā)明第一實(shí)施例中pEGFP-N1-776linker酶切結(jié)果圖；

圖3是本發(fā)明第一實(shí)施例中pIres2-clone 5-28Z-EGFP酶切結(jié)果圖；

圖4是本發(fā)明第一實(shí)施例中融合蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)結(jié)果圖；

圖5是本發(fā)明第一實(shí)施例中融合蛋白經(jīng)抗體結(jié)合后的熒光圖；

圖6是本發(fā)明第二實(shí)施例中轉(zhuǎn)染“pEGFP-N1-Clone 5-776linker”24小時(shí)后的HEK293細(xì)胞熒光圖；

圖7是本發(fā)明第一實(shí)施例中轉(zhuǎn)染“pEGFP-N1-Clone 5-314linker”24小時(shí)后的HEK293細(xì)胞熒光圖；

圖8是本發(fā)明第二實(shí)施例中轉(zhuǎn)染“pEGFP-N1-Clone 5-776linker”的HEK293流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖；

圖9是本發(fā)明第一實(shí)施例中轉(zhuǎn)染“pEGFP-N1-Clone 5-314linker”的HEK293流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1膜表達(dá)功能性膜聯(lián)蛋白A5融合蛋白構(gòu)建及表達(dá)

本實(shí)施例提供一種融合蛋白，其構(gòu)建方式如圖1B所示，包括第一肽段區(qū)和第二肽段區(qū)，第一肽段區(qū)包括分泌信號(hào)肽、以及磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白肽段，第二肽段區(qū)包括連接肽段、跨膜肽段、以及具有細(xì)胞調(diào)節(jié)功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽段。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1、融合蛋白第二肽段區(qū)構(gòu)建

選取商用真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1(SEQ ID NO：1)作為載體。基因合成編碼融合蛋白第二肽段區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)，該序列自5’端依次包含Hind III位點(diǎn)、Kozak序列g(shù)ccacc、翻譯起始密碼ATG、3xGGGGS肽鏈編碼核酸序列(SEQ ID NO：12)、CD8a片段(P01732-1中382nt-630nt)、CD28片段(P10747-1中538nt-660nt)、CDzeta片段(P20963-1中154nt-491nt)、BamHI位點(diǎn)。其中，3xGGGGS肽鏈編碼核酸序列編碼連接肽段，CD8a片段編碼跨膜肽段，CD28片段和CDzeta片段編碼信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽段。

將第二肽段區(qū)的雙鏈cDNA用內(nèi)切酶Hind III和BamHI處理后，接入雙酶處理過(guò)的載體pEGFP-N1，得到產(chǎn)物“pEGFP-N1-776linker”；酶切結(jié)果如圖2所示，圖中A條帶為未酶切質(zhì)粒，B條帶為HindIII和BamHI雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物(插入基因776bp)，C條帶為核酸分子大小標(biāo)志物，結(jié)果表明載體正常，包含編碼融合蛋白第二肽段區(qū)的核苷酸序列。

2、融合蛋白第一肽段區(qū)構(gòu)建

基因合成編碼融合蛋白第一肽段區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，該序列自5’端依次包含NheI位點(diǎn)、CD8a分泌信號(hào)肽片段(P01732-1中1nt-63nt)、膜聯(lián)蛋白A5(P08758中編碼堿基4nt-960nt)、BglII位點(diǎn)，接入商用質(zhì)粒pIres2-EGFP的衍生質(zhì)粒pIres2-28Z-EGFP(SEQ ID NO：4)，得到質(zhì)粒pIres2-clone5-28Z-EGFP，酶切結(jié)果如圖3所示，條帶a為核酸分子大小標(biāo)志物，條帶b為NheI和BglII雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物(插入基因1020bp)，條帶c為未酶切質(zhì)粒，結(jié)果表明載體正常，包含編碼融合蛋白第一肽段區(qū)的核苷酸序列。

3、融合蛋白載體構(gòu)建

設(shè)計(jì)PCR克隆上游引物GAagatctgccaccATGGCCTTACCAGTGACCG(SEQ ID NO：5)和下游引物cgaagcttGTCATCTTCTCCACAGAG(SEQ ID NO：6)，經(jīng)常規(guī)PCR擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳后純化PCR產(chǎn)物，經(jīng)雙酶切處理，接入“pEGFP-N1-776linker”；所得質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序檢驗(yàn)無(wú)誤。所得融合質(zhì)粒為“pEGFP-N1-Clone 5-776linker”，其表達(dá)的膜表達(dá)功能性膜聯(lián)蛋白A5融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：7所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

4、融合蛋白表達(dá)

所得質(zhì)?！皃EGFP-N1-Clone 5-776linker”經(jīng)工程菌培養(yǎng)、放大和制備后，用于真核細(xì)胞的表達(dá)檢測(cè)。將HEK293細(xì)胞接種于6孔板，等到70-80％飽和度時(shí)，用Lip2000轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒至293細(xì)胞，24小時(shí)后，用適量一抗兔抗酶聯(lián)蛋白A5多抗(北京義翹神州生物技術(shù)公司)與細(xì)胞在37℃孵溫30分鐘，生理鹽水清洗兩次；再加二抗PE標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，在37℃孵溫15分鐘，生理鹽水清洗兩次后，觀察細(xì)胞熒光。在同一目鏡框下，改變?yōu)V色鏡片，部分細(xì)胞同時(shí)顯示胞漿內(nèi)的EGFP綠色熒光(圖4)和細(xì)胞膜上抗體染色的PE紅色熒光(圖5)，表明功能性膜聯(lián)蛋白A5融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)而且膜聯(lián)蛋白A5錨定在細(xì)胞膜外。

實(shí)施例2膜表達(dá)非功能性膜聯(lián)蛋白A5融合蛋白構(gòu)建及表達(dá)

本實(shí)施例提供一種融合蛋白，其構(gòu)建方式如圖1A所示，包括第一肽段區(qū)和第二肽段區(qū)，第一肽段區(qū)包括分泌信號(hào)肽、以及磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白肽段，第二肽段區(qū)包括連接肽段、以及跨膜肽段。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1、融合蛋白第二肽段區(qū)構(gòu)建

基因合成編碼融合蛋白第二肽段區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)，該序列自5’端依次包含Hind III位點(diǎn)、Kozak序列g(shù)ccacc、翻譯起始密碼ATG、3xGGGGS肽鏈編碼核酸序列、CD8a片段(P01732-1中382nt-629nt)、BamHI位點(diǎn)。

2、融合蛋白載體構(gòu)建

與實(shí)施例一中的融合蛋白第二肽段區(qū)相比，CD28的共刺激信號(hào)肽和CD3zeta的信號(hào)肽編碼序列已經(jīng)除去，只包含CD8a的九個(gè)細(xì)胞內(nèi)氨基酸；接入質(zhì)?！皃EGFP-N1-776linker”。所得質(zhì)粒“pEGFP-N1-Clone 5-314linker”經(jīng)測(cè)序檢驗(yàn)無(wú)誤，其表達(dá)的膜表達(dá)非功能性膜聯(lián)蛋白A5融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：10所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

3、融合蛋白表達(dá)

所得質(zhì)?！皃EGFP-N1-Clone 5-314linker”和“pEGFP-N1-Clone 5-776linker”經(jīng)工程菌培養(yǎng)、放大和制備后，用于真核細(xì)胞的表達(dá)檢測(cè)。將HEK293細(xì)胞接種于6孔板，等到70-80％飽和度時(shí)，用Lip2000轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒至293細(xì)胞，24小時(shí)后，觀察和記錄膜聯(lián)蛋白A5融合蛋白在細(xì)胞表達(dá)顯示的綠色EGFP熒光，結(jié)果分別如圖7和圖6所示。

將六孔板內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)胰酶處理后收集，PBS清洗三次，用適量一抗兔抗酶聯(lián)蛋白A5多抗(北京義翹神州生物技術(shù)公司)與細(xì)胞在37℃孵溫15分鐘，PBS清洗兩次；再加二抗PE標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，在37?！娣鯗?0分鐘，PBS清洗兩次后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP和PE信號(hào)。EGFP信號(hào)顯示，不論是膜表達(dá)功能性膜聯(lián)蛋白A5融合蛋白(pEGFP-N1-Clone 5-776linker，圖8)，還是膜表達(dá)非功能性膜聯(lián)蛋白A5融合蛋白(pEGFP-N1-Clone 5-314linker，圖9)，膜聯(lián)蛋白A5融合蛋白均在細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)，而PE信號(hào)表明在細(xì)胞膜外錨定的膜聯(lián)蛋白A5三維構(gòu)象沒(méi)有改變，提示膜聯(lián)蛋白A5的功能性正常。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。