本發(fā)明涉及生物醫(yī)用聚合物領(lǐng)域，具體涉及含有雙硫鍵的陽離子型聚酰胺、制備方法及其作為轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞株或干細(xì)胞的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因治療的成功依賴高效、低毒的可將外源基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)的基因載體。目前基于聚合物的非病毒基因載體（轉(zhuǎn)染試劑）因其更高的安全性、生產(chǎn)成本低、基因載藥量大等優(yōu)點(diǎn)，倍受研究關(guān)注。基于陽離子型的聚合物基因載體，如可降解的聚賴氨酸、聚乙烯亞胺和聚酰胺等已經(jīng)被廣泛研究。但它們因不可降解的原因，轉(zhuǎn)染過程中導(dǎo)致較大的細(xì)胞毒性。生物可降解的雙硫鍵是設(shè)計(jì)可降解聚合物基因載體的重要分子構(gòu)建。含有雙硫鍵的陽離子型聚合物因其在進(jìn)入細(xì)胞后便會(huì)被降解,對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較弱的毒性。因此將雙硫鍵引入陽離子型聚合物是設(shè)計(jì)高效、低毒基因載體的重要方法。

聚酰胺是一類在主鏈上含有酰胺鍵(amide linkage)的聚合物。在過去十年里，聚酰胺在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是藥物緩釋和組織工程方面得到廣泛的應(yīng)用。目前，含有雙硫鍵的聚酰胺有大量的報(bào)道，主要是通過N,N'-雙(丙稀酰)胱胺和伯胺通過麥克加成反應(yīng)制備的聚（酰胺-胺）。但麥克加成反應(yīng)原理表明，該類聚（酰胺-胺）分子鏈上介于酰胺鍵（-NH-C=O）和叔胺（N-R）基團(tuán)之間的碳原子個(gè)數(shù)不可變，只能是兩個(gè)碳原子。如下式所示：

目前報(bào)道的陽離子型聚酰胺，其介于酰胺鍵（-NH-C=O）和雙硫鍵（SS）之間的碳原子個(gè)數(shù)只是兩個(gè)。這些因素限制了制備分子結(jié)構(gòu)多樣性的陽離子型聚酰胺，進(jìn)而影響了后續(xù)轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化。

參考文獻(xiàn):

1.Thomas CE, Ehrhardt A, Kay MA. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet 2003;4: 346-358.

2. Li S, Huang L. Non-viral gene therapy: promises and challenges. Gene Ther 2000;7: 31-34.

3. Pack DW, Hoffman AS, Pun S, Stayton PS. Design and development of polymers for gene delivery. Nat Rev Drug Discov 2005;4: 589-593

4. Lin C, Zhiyuan Zhong, Martin C. Lok, Xulin Jiang, Wim E. Hennink, Feijen J, et al. Novel bioreducible poly(amido amine)s for highly efficient gene delivery. Bioconjuate Chem 2007;18: 138-145.

5. Son S, Namgung R, Kim J, Singha K, Kim WJ. Bioreducible polymers for gene silencing and delivery. Acc Chem Res 2012;45: 1100-1112。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種含有雙硫鍵的陽離子型聚酰胺、制備方法及其作為轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞株或干細(xì)胞的應(yīng)用。

本發(fā)明提出的含有雙硫鍵的陽離子型聚酰胺，其結(jié)構(gòu)式如式（1）所示：

（１）

其中，R₁基團(tuán)選自： 或中任一種；

R₂基團(tuán)選自：或；

聚合度n為20-100。

本發(fā)明提出的含有雙硫鍵的陽離子型聚酰胺的制備方法，首先合成二對(duì)硝基苯基二硫代二丙（?。┧狨?，將其和含有叔胺基團(tuán)的二伯胺化合物通過逐步縮合，得到含有雙硫鍵和可質(zhì)子化胺基的聚酰胺；具體步驟如下：

（1）將二硫代二丙酸或二硫代二丁酸與氯化亞砜一起攪拌，進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到二對(duì)硝基苯基二硫代二丙（?。┧狨?；其中：二硫代二丙（丁）酸與氯化亞砜的摩爾比為1:（3~ 5）；

（2）將步驟（１）得到的產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除未反應(yīng)的氯化亞砜，殘余物與對(duì)硝基苯酚在有機(jī)溶劑中反應(yīng)；

（3）將步驟（２）得到的產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去未反應(yīng)的有機(jī)溶劑，殘余物在冰水中重結(jié)晶，得到二對(duì)硝基苯基二硫代二丙（?。┧狨ィ?/p>

（４）制備含有雙硫鍵的聚酰胺

將二對(duì)硝基苯基二硫代二丙（丁）酸酯與二伯胺化合物加入到有機(jī)溶劑中在室溫下進(jìn)行反應(yīng)；二對(duì)硝基苯基二硫代二丙（?。┧狨ヅc二伯胺化合物的摩爾比為1:1；

（５）反應(yīng)完畢后，向步驟（４）所得產(chǎn)物中加入去離子水稀釋，每1g反應(yīng)物加入10mL ddH₂O（重蒸水）, 用4M 鹽酸調(diào)節(jié)pH值到5-6，然后用透析袋透析、冷凍干燥，得到含有雙硫鍵的聚酰胺。

本發(fā)明中，步驟（1）中所述酯化反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)。

本發(fā)明中，步驟（2）中所述有機(jī)溶劑為丙酮，殘余物與對(duì)硝基苯酚在有機(jī)溶劑中反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)。

本發(fā)明中，步驟（４）中所述有機(jī)溶劑為二甲基亞砜，室溫下反應(yīng)時(shí)間為24-36小時(shí)。

本發(fā)明中，步驟（４）中所述二伯胺化合物選自氨基酸、1,4-雙(3-氨基丙基)-哌嗪、N-甲基-2,2’-二氨基二乙胺、雙（2 -氨基乙基）2 -（叔丁氧羰基氨基）乙基胺或1,4-哌嗪二乙胺等中任一種。

本發(fā)明中，步驟（５）中所述透析袋的截留分子量為1000-3000。

一種含有雙硫鍵的陽離子型聚酰胺作為轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和干細(xì)胞的應(yīng)用，具體步驟如下：

（1）將培養(yǎng)至80-90％融合度的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株或干細(xì)胞用胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)，并以1-2×10⁵/孔接種6孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h，至細(xì)胞達(dá)70％融合度，得到pCMV-GFP質(zhì)粒；

（2）按N/P比值為20、40、80的不同濃度比例的含有雙硫鍵的陽離子型聚酰胺與pCMV-GFP質(zhì)粒進(jìn)行復(fù)合，得到復(fù)合物，室溫復(fù)合半個(gè)小時(shí)；

轉(zhuǎn)染前，先用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞，更換新鮮無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)1h后，隨后向孔板中滴加復(fù)合物，充分混勻后，培養(yǎng)1-4 h；

（3）去除培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清和100U/ml雙抗（青霉素和鏈霉素）的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，后用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠色熒光表達(dá)情況并拍照。

通過上述方法制備的聚酰胺具有很低的細(xì)胞毒性和生物相容性。本發(fā)明提供的含有雙硫鍵的聚酰胺基因轉(zhuǎn)染試劑可適用于螢火蟲熒光素酶、綠色熒光蛋白報(bào)告基因，以及其它功能基因質(zhì)粒。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)：1）本發(fā)明通過含有雙硫鍵的對(duì)二硝基苯基二硫代二丙（?。┧狨ヅc二伯胺化合物通過逐步縮聚方法制備陽離子型聚酰胺。不同于傳統(tǒng)的陽離子型聚酰胺的制備方法，即麥克加成方法。合成反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)少。本方法便于引入雙硫鍵和胺基官能團(tuán)，可以得到結(jié)構(gòu)多樣性的聚酰胺；該方法得到的聚酰胺碳原子數(shù)目可調(diào)。2）本發(fā)明中制備的含有雙硫鍵的聚酰胺相比普通聚酰胺能夠有效的提高包裹基因的能力以及在胞漿內(nèi)釋放基因的能力。因此，該類新型的聚酰胺生物相容性好且細(xì)胞毒性低。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，該系聚酰胺與基因形成的復(fù)合物在多種哺乳細(xì)胞株（如SKOV3、MCF-7、HepG2和干細(xì)胞）的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中，均表現(xiàn)出比商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectamine2000）更高的轉(zhuǎn)染效率和更低的細(xì)胞毒性。因此，本發(fā)明制備的含有雙硫鍵聚酰胺在基因轉(zhuǎn)染試劑領(lǐng)域具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。

附圖說明

圖1為二對(duì)硝基苯基二硫代二丙酸酯的¹H NMR譜圖。

圖2為含有1,4-雙(3-氨基丙基)-哌嗪的二硫代二丙基聚酰胺（DTPA-BAP）的¹H NMR譜圖。

圖3為含有N-甲基-2,2’-二氨基二乙胺的二硫代二丙基聚酰胺（DTPA-MDE）的¹H NMR譜圖。

圖4為含有雙硫鍵聚酰胺和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染MCF-7和SKOV-3細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）基因，熒光顯微鏡下觀察所拍攝的照片。其中：ａ)為DTPA-BAP轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，ｂ)為DTPA-BAP轉(zhuǎn)染SKOV-3細(xì)胞，ｃ)為L(zhǎng)ipofectamine2000轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，ｄ)為L(zhǎng)ipofectamine2000轉(zhuǎn)染SKOV-3細(xì)胞。

圖5含有雙硫鍵的聚酰胺在不同濃度下與MCF-7細(xì)胞共培養(yǎng)后的細(xì)胞存活率。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明

實(shí)施例1：合成二對(duì)硝基苯基二硫代二丙酸酯 (DTPA-PNC)

（1）先將二硫代二丙酸（5 g）和二氯亞砜 （20 mL）按摩爾比1:5稱取，加入到反應(yīng)器內(nèi)，反應(yīng)４小時(shí)；

（2）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)二氯亞砜，并將殘余固體溶解在丙酮中，加入對(duì)硝基苯酚固體（6.7 g），反應(yīng)24小時(shí)；

（3）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)丙酮，殘余物在水（500 mL）中重結(jié)晶，得到針狀晶體 (3.4 g)。

固體產(chǎn)物的核磁數(shù)據(jù)為：¹HNMR(300 MHz, CDCl₃, ppm)：δ 7.3 和8.3 (aromatic protons, 8H); δ 3.1 (2×CH2CH2S, 8H)（見圖1）。

實(shí)施例2：合成含有1,4-雙(3-氨基丙基)-哌嗪的二硫代二丙基聚酰胺（DTPA-BAP）

（1）稱取實(shí)施例１所得的DTPA-PNC（0.5 g）和1,4-雙(3-氨基丙基)-哌嗪（0.22 g）與反應(yīng)瓶中，加入3 mL二甲基亞砜，混合均勻后，40℃油浴環(huán)境下反應(yīng)5天；

（2）在反應(yīng)器內(nèi)加入1,4-雙(3-氨基丙基)-哌嗪（0.02 g）和1 mL的二甲基亞砜終止反應(yīng)，油浴環(huán)境下繼續(xù)反應(yīng)2天；

（3）將反應(yīng)瓶?jī)?nèi)的液體全部轉(zhuǎn)移到透析裝置中，用4 M的鹽酸將pH調(diào)至5，用截留分子量為1000的透析袋透析、冷凍干燥，得到固體產(chǎn)物（0.34 g）。

固體產(chǎn)物的核磁數(shù)據(jù)為：¹HNMR(300 MHz, D₂O, ppm)：δ1.95 (4H, 2×N-CH₂CH₂CH₂); 2.66 (4H, 2×N-CH₂CH₂CH₂); 2.92 (4H, 2×N-CH₂CH₂CH₂); 3.28 (8H, CH₂CH₂SSCH₂CH₂); 3.3-4.1 (8H, 2×N-CH₂CH₂-N) (見圖2) 。

實(shí)施例3：N-甲基-2,2’-二氨基二乙胺的二硫代二丙基聚酰胺（DTPA-MDE）

（1）將N-甲基-2,2’-二氨基二乙胺（1 g ）和實(shí)施例１所得的DTPA-PNC（0.2 g）放入燒瓶中；

（2）用5 mL二甲基亞砜溶解，在室溫下反應(yīng)5天；

（3）反應(yīng)結(jié)束后，用10 mL去離子水溶解產(chǎn)物，用鹽酸將pH值調(diào)到6，

（4）用分子截留量為1000 g/mol的透析袋透析；

（5）冷凍干燥，得到固體產(chǎn)物（0.3 g）。

固體產(chǎn)物的核磁數(shù)據(jù)為：¹HNMR(300 MHz, D₂O, ppm)：δ 2.66 (4H, 2×N-CH₂CH₂CH₂); 2.92 (4H, 2×N-CH₂CH₂CH₂, 3H, CH₃); 3.1-3.6 (8H, 2×N-CH₂CH₂-N) (見圖3)。

實(shí)施例4：含有雙硫鍵的聚酰胺轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞株

（1）培養(yǎng)至85-90％融合的所需細(xì)胞用胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)，并以6×10⁴細(xì)胞/孔的濃度接種24孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24h，至細(xì)胞達(dá)50-70％融合；

（2）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組，每亞組設(shè)平行的3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照組，及以樹枝狀的PEI（25萬分子量）或lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染試劑的陽性對(duì)照組；

（3）配置不同濃度比例的實(shí)施例１或?qū)嵤├菜玫木郯滨ヅcpCMV-GFP質(zhì)粒的混合物。并按PEI或lipofectamine 2000的說明書要求，配置質(zhì)粒復(fù)合物；

（4）將孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)基吸除，以PBS沖洗細(xì)胞，更換新鮮無血清培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5 h；

（5）按照不同組別向孔板中滴加質(zhì)粒復(fù)合物，充分混勻后置培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h；（6）吸除孔板中的液體，以PBS沖洗細(xì)胞，更換新鮮的含10%胎牛血清和100 U/mL（1%）雙抗的培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠色熒光表達(dá)情況并拍照。(見圖4)。

實(shí)施例5：含有雙硫鍵的陽離子型聚酰胺的細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià)

（1）配置 10:1的RPMI 1640（無酚紅）與 Alamar Blue混合液，充分混勻，預(yù)熱至37 oC；

（2）吸除孔板中的培養(yǎng)基，PBS沖洗細(xì)胞后，每孔加入500 μL上述混液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h ；

（3） 每孔吸取200μL上清液，按分組順序依次加入一個(gè)新的96孔板；（4）將96孔板置于酶標(biāo)儀上，以630 nm為參考波長(zhǎng)，570 nm為試驗(yàn)波長(zhǎng)，測(cè)定各孔吸光度；

（4）細(xì)胞存活率(%)=各組細(xì)胞吸光度/陰性對(duì)照組細(xì)胞吸光度×100% (見圖5)。

上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和應(yīng)用本發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于這里的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。