背景技術(shù)：
：藍(lán)靛果(Loniceraedulis)又叫藍(lán)靛果忍冬、黑瞎子果、山茄子、鳥啄李和羊奶子等，在植物分類學(xué)上屬于忍冬科、忍冬屬、忍冬亞屬、囊管組、藍(lán)果亞組，多年野生漿果類落葉小灌木，是一種新興的野生漿果資源，主要分布在我國(guó)吉林省長(zhǎng)白山、黑龍江省大興安嶺東部山區(qū)以及內(nèi)蒙古、華北、西北和四川等地。藍(lán)靛果果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多酚、花色苷等功能性成分，被世界糧農(nóng)組織定為世界稀有珍貴野生漿果。

目前藍(lán)靛果提取出來(lái)的花色苷,具有抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)視力、降血脂、抗炎以及促進(jìn)肝損傷修復(fù)等多種生物活性，在食品、化妝甚至醫(yī)藥等方面都有著巨大的應(yīng)用潛力。

近年來(lái)對(duì)藍(lán)靛果花色苷的提取進(jìn)行了大量研究，藍(lán)靛果花色苷的提取方法主要有傳統(tǒng)有機(jī)溶劑萃取、超聲波輔助提取、微波輔助提取、超臨界CO₂萃取，然而這些方法均存在一定的缺陷，傳統(tǒng)有機(jī)溶劑萃取操作簡(jiǎn)單，但得率低、溶劑消耗量大、生產(chǎn)周期長(zhǎng)；超聲波輔助提取和微波輔助提取得率高于傳統(tǒng)有機(jī)溶劑萃取，但操作復(fù)雜、能耗過(guò)大，且微波過(guò)程中產(chǎn)生的高溫有可能造成花色苷的降解或氧化，降低得率；超臨界CO₂萃取得率高，但生產(chǎn)成本過(guò)高。現(xiàn)今，高壓脈沖電場(chǎng)被廣泛用于生物活性物質(zhì)的提取，具有明顯的效果，多數(shù)研究表明，其主要原因是在強(qiáng)電場(chǎng)作用下細(xì)胞膜受到破壞而導(dǎo)致細(xì)胞裂解，利于活性物質(zhì)的釋放，同時(shí)，高壓脈沖電場(chǎng)具有簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、效率高、各項(xiàng)參數(shù)易調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)。

基于此，本發(fā)明提供了一種高壓脈沖電場(chǎng)輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷的方法，利用高壓脈沖電場(chǎng)的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)藍(lán)靛果花色苷的高效快速提取。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：基于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明提出一種高壓脈沖電場(chǎng)輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷的方法，該方法工藝簡(jiǎn)單、提取率高、耗時(shí)少，可實(shí)現(xiàn)藍(lán)靛果花色苷的高效快速提取。

其工藝流程及其控制條件如下：

A.原料預(yù)處理：將置于-20℃冰柜冷凍保存的藍(lán)靛果取出放于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，干燥后的果實(shí)經(jīng)破碎機(jī)破碎成粉末過(guò)1mm尼龍篩網(wǎng)后儲(chǔ)存在室溫下備用。

B.酸化乙醇混合：取一定量的藍(lán)靛果粉末，按照比例加入0.1％(v/v)鹽酸乙醇。

C.高壓脈沖電場(chǎng)處理：將上述混合漿液以7mL/min流速經(jīng)蠕動(dòng)泵泵送至高壓脈沖電場(chǎng)處理室，在一定電場(chǎng)強(qiáng)度(kV/cm)和脈沖數(shù)(個(gè))條件下進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)處理。

D.分離：將經(jīng)高壓脈沖電場(chǎng)處理的漿液置于低速離心機(jī)中離心(4000r/min,15min)，取上清液，即為花色苷提取液。

E.定容：準(zhǔn)確吸取1.25mL花色苷提取液，加入50mL容量瓶中，分別用pH1.0的氯化鉀-鹽酸緩沖溶液和pH4.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液定容備用。

F.測(cè)定吸光值：分別取適量定容后的溶液置于試管中，于40℃恒溫水浴中水浴40min后，以蒸餾水為空白對(duì)照分別在510nm和700nm下測(cè)定吸光值，計(jì)算花色苷含量。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：

1.本發(fā)明首次采用高壓脈沖電場(chǎng)輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷，在高壓脈沖電場(chǎng)作用下，植物細(xì)胞破壁裂解或穿孔，促進(jìn)藍(lán)靛果細(xì)胞內(nèi)花色苷活性成分的釋放，提高花色苷得率，縮短提取時(shí)間，減少耗能，真正達(dá)到高效提取。

2.本發(fā)明的方法具有操作工藝簡(jiǎn)單、易行，生產(chǎn)成本低，提取效率高，產(chǎn)品質(zhì)量好等顯著優(yōu)點(diǎn)。

3.本發(fā)明得到的藍(lán)靛果花色苷，可作為一種天然食品添加劑應(yīng)用于食品和保健食品等各領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明：

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

圖1是乙醇濃度變化對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量的影響規(guī)律圖；

圖2是電場(chǎng)強(qiáng)度變化對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量的影響規(guī)律圖；

圖3是脈沖數(shù)變化對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量的影響規(guī)律圖；

圖4是料液比變化對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量的影響規(guī)律圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、高壓脈沖電場(chǎng)輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

1、樣品準(zhǔn)備與試驗(yàn)過(guò)程

(1)將置于-20℃冰柜冷凍保存的藍(lán)靛果取出放于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，干燥后的果實(shí)經(jīng)破碎機(jī)破碎成粉末過(guò)1mm尼龍篩網(wǎng)后儲(chǔ)存在室溫下備用。

(2)取一定量的藍(lán)靛果粉末，按照比例加入0.1％(v/v)鹽酸乙醇后以7mL/min流速經(jīng)蠕動(dòng)泵泵送至高壓脈沖電場(chǎng)處理室，在一定電場(chǎng)強(qiáng)度(kV/cm)和脈沖數(shù)(個(gè))條件下進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)處理。

(3)將經(jīng)高壓脈沖電場(chǎng)處理的漿液置于低速離心機(jī)中離心(4000r/min,15min)，準(zhǔn)確吸取1.25mL上清液即花色苷提取液，加入50mL容量瓶中，分別用pH1.0的氯化鉀-鹽酸緩沖溶液和pH4.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液定容。

(4)分別取適量定容后的溶液置于試管中，于40℃恒溫水浴中水浴40min后，以蒸餾水為空白對(duì)照分別在510nm和700nm下測(cè)定吸光值，通過(guò)pH示差法計(jì)算花色苷含量。

(5)花色苷含量計(jì)算公式為：

2、試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析

(1)單因素試驗(yàn)

以乙醇濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)和料液比為主要影響因素，花色苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每次試驗(yàn)平行測(cè)定三次，取其平均值。

(2)響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量響較顯著的乙醇濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)和料液比這四個(gè)因素，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并利用design expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，建立二次多項(xiàng)回歸模型，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。設(shè)計(jì)因素水平表見表1。

表1響應(yīng)面試驗(yàn)變量與編碼表

以乙醇濃度(X₁)、電場(chǎng)強(qiáng)度(X₂)、脈沖數(shù)(X₃)和料液比(X₄)為自變量,以藍(lán)靛果花色苷含量為響應(yīng)值(Y)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

(3)模型的建立和統(tǒng)計(jì)分析

利用designexpert軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，去除不顯著項(xiàng)后，得到響應(yīng)變量(乙醇濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)和料液比)與響應(yīng)值(花色苷含量)之間的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y＝-76.76933+0.57962X₁+1.68863X₂+6.30625X₃+1.07572X₄+3.55000E-003X₁X₂-0.015000X₁X₃+2.27500E-003X₁X₄+7.00000E-003X₂X₃-1.85000E-003X₂X₄-9.5000E-003X₃X₄-5.10083E-003X₁²-0.043403X₂²-0.24940X₃²-6.95083E-003X₄²

F檢驗(yàn)可判定各因子與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著性，P值越小，說(shuō)明變量越顯著。由方差分析表(表3)可知，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著(R²＝0.9982)，模型顯著水平小于0.0001，所以該回歸方差模型極顯著。

表3二次回歸模型方差分析結(jié)果

(4)試驗(yàn)結(jié)果分析與優(yōu)化

模型分析可知，高壓脈沖電場(chǎng)輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷最佳工藝參數(shù)：乙醇濃度68.12％，電場(chǎng)強(qiáng)度21.31kV/cm，脈沖數(shù)9.38個(gè)，料液比1:79.27g/mL。在此條件下，得到的花色苷含量為33.1877mg/g藍(lán)靛果粉末。

試驗(yàn)1、高壓脈沖電場(chǎng)輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷過(guò)程試驗(yàn)

(1)將置于-20℃冰柜冷凍保存的藍(lán)靛果取出放于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，干燥后的果實(shí)經(jīng)破碎機(jī)破碎成粉末過(guò)1mm尼龍篩網(wǎng)后儲(chǔ)存在室溫下備用。

(2)取一定量的藍(lán)靛果粉末，按照比例加入0.1％(v/v)鹽酸乙醇后以7mL/min流速經(jīng)蠕動(dòng)泵泵送至高壓脈沖電場(chǎng)處理室，在一定電場(chǎng)強(qiáng)度(kV/cm)和脈沖數(shù)(個(gè))條件下進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)處理。

(3)將經(jīng)高壓脈沖電場(chǎng)處理的漿液置于低速離心機(jī)中離心(4000r/min,15min)，準(zhǔn)確吸取1.25mL上清液即花色苷提取液，加入50mL容量瓶中，分別用pH1.0的氯化鉀-鹽酸緩沖溶液和pH4.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液定容。

(4)分別取適量定容后的溶液置于試管中，于40℃恒溫水浴中水浴40min后，以蒸餾水為空白對(duì)照分別在510nm和700nm下測(cè)定吸光值，通過(guò)pH示差法計(jì)算花色苷含量為32.96mg/g藍(lán)靛果粉末。

試驗(yàn)2、乙醇濃度變化對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量的影響

在電場(chǎng)強(qiáng)度20kV/cm、脈沖數(shù)8個(gè)、料液比1:80的條件下，將酸化乙醇濃度設(shè)定為40-80％共5個(gè)變化值；其余同試驗(yàn)1，結(jié)果如圖1。

當(dāng)酸化乙醇濃度小于70％時(shí)，藍(lán)靛果花色苷含量隨乙醇濃度的增大而提高，這可能是由于隨著乙醇濃度的增大，溶劑的滲透能力也隨之增大，有利于花色苷類水溶性物質(zhì)的溶出；當(dāng)酸化乙醇濃度大于70％時(shí)，藍(lán)靛果花色苷含量下降，這可能是由于乙醇濃度過(guò)大時(shí)，極性過(guò)低反而不利于花色苷類物質(zhì)的溶出，導(dǎo)致花色苷含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此,最佳的酸化乙醇濃度為70％。

試驗(yàn)3、電場(chǎng)強(qiáng)度變化對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量的影響

在酸化乙醇濃度70％、脈沖數(shù)8個(gè)、料液比1:80的條件下，將電場(chǎng)強(qiáng)度設(shè)定為10-30kV/cm共5個(gè)變化值；其余同試驗(yàn)1，結(jié)果如圖2。

當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度小于20kV/cm時(shí)，藍(lán)靛果花色苷含量隨電場(chǎng)強(qiáng)度的增大而提高，這可能是由于在較大的外加電場(chǎng)的作用下會(huì)使藍(lán)靛果表面的電荷量變多，導(dǎo)致藍(lán)靛果細(xì)胞內(nèi)外電位差增大，當(dāng)其高于細(xì)胞膜的臨界電位時(shí)，細(xì)胞膜就會(huì)被擊穿，促進(jìn)藍(lán)靛果中花色苷等物質(zhì)的溶出，增加提取量；當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度大于20kV/cm時(shí)，藍(lán)靛果花色苷含量下降，這可能是由于過(guò)高的電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)導(dǎo)致花色苷結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，造成花色苷降解，使花色苷的提取量降低，導(dǎo)致花色苷含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，最佳的電場(chǎng)強(qiáng)度為20kV/cm。

試驗(yàn)4、脈沖數(shù)變化對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量的影響

在酸化乙醇濃度70％、場(chǎng)強(qiáng)度20kV/cm、料液比1:80的條件下，將脈沖數(shù)設(shè)定為4-12個(gè)共5個(gè)變化值；其余同試驗(yàn)1，結(jié)果如圖3。

當(dāng)脈沖數(shù)小于10時(shí),藍(lán)靛果花色苷含量隨著脈沖數(shù)增大而提高，這可能是由于增大脈沖數(shù)個(gè)數(shù)，增加了電場(chǎng)與藍(lán)靛果作用的時(shí)間和頻率，溶劑在電流的帶動(dòng)下能夠快速滲入細(xì)胞內(nèi)部，促進(jìn)花色苷的溶出；當(dāng)脈沖數(shù)大于10時(shí),藍(lán)靛果花色苷含量降低，這可能是由于脈沖數(shù)過(guò)大破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使花色苷提取量降低，導(dǎo)致花色苷含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，最佳的脈沖數(shù)為10個(gè)。

試驗(yàn)5、料液比變化對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量的影響

在酸化乙醇濃度70％、場(chǎng)強(qiáng)度20kV/cm、脈沖數(shù)10個(gè)的條件下，將料液比設(shè)定為1:60-1:100個(gè)共5個(gè)變化值；其余同試驗(yàn)1，結(jié)果如圖4。

當(dāng)料液比小于1:80時(shí)，藍(lán)靛果花色苷含量隨著料液比增大而提高，這可能是由于提取溶劑體積的增大，擴(kuò)大了組織細(xì)胞內(nèi)外的濃度差，促進(jìn)藍(lán)靛果花色苷向提取溶劑中擴(kuò)散，有利于花色苷溶出；當(dāng)料液比大于1:80時(shí)，藍(lán)靛果花色苷含量降低，這可能是由于溶劑過(guò)多影響了電流與藍(lán)靛果細(xì)胞間的作用，影響了花色苷的溶出，使花色苷提取量降低，導(dǎo)致花色苷含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，最佳的料液比為1:80。