本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種PCR檢測(cè)方法，具體為基于特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

麗草蛉(Chrysopa formosa Brauer)，脈翅目，草蛉科，主要分布于我國(guó)的黑龍江、遼寧、吉林、北京、河北、山東、山西、河南、湖北、天津、甘肅、新疆、上海、四川、陜西等地區(qū)。成蟲和幼蟲的捕食能力都很強(qiáng)，主要捕食蚜蟲、介殼蟲、紅蜘蛛和多種昆蟲卵，也捕食蛾類幼蟲等。是田間生物防治的主要捕食性天敵。

集團(tuán)內(nèi)捕食(Intraguild predation,簡(jiǎn)稱IGP)作用是一種更為復(fù)雜的種間關(guān)系,廣泛存在于各種生態(tài)系中,充分認(rèn)識(shí)IGP作用的內(nèi)在本質(zhì)和作用機(jī)理,對(duì)發(fā)展和完善更有效的生物防治理論和策略、增強(qiáng)生物控害的功能、推進(jìn)生物防治工程的建設(shè)有重大的意義。而常規(guī)的腸道解剖、行為觀察等傳統(tǒng)研究方法不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)草蛉之間的捕食作用。目前，對(duì)麗草蛉的特異性檢測(cè)的方法尚未建立。

同時(shí)，傳統(tǒng)的草蛉鑒定是依據(jù)形態(tài)的差異，需具有一定的專業(yè)知識(shí)才能準(zhǔn)確鑒定，而通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)進(jìn)行鑒定只需常規(guī)分子生物學(xué)方面的知識(shí)就能解決，并且準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)便快速。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問題，提供一種基于特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測(cè)方法，具有檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)。

本基于特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測(cè)方法包括以下步驟：

(1)制備特異性SS-COI引物：根據(jù)麗草蛉的線粒體DNA序列(genbank:KJ592501.1)，設(shè)計(jì)一對(duì)麗草蛉的特異性SS-COI引物，其包括：

正向引物CfF5：5'-TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG-3’

反向引物CfR1：5'-TTGAAGATGCCAGTAATAAG-3’；

(2)提取樣品總DNA：在棉田采集麗草蛉，將單頭蟲體放入離心管中將其磨碎，用提取試劑盒提取單頭蟲體基因組溶液，將基因組溶液保存?zhèn)溆茫M(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)吸取基因組溶液作為DNA模板；

(3)以步驟2)提取的總DNA為模板，利用正向引物CfF5和反向引物CfR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；PCR反應(yīng)體系以20μL計(jì)為：

(4)分析PCR產(chǎn)物：對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如出現(xiàn)大小為250bp的DNA擴(kuò)增條帶，則表明樣品為麗草蛉。

在上述的基于特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測(cè)方法中，所述步驟(1)中，通過genbank的KJ592501.1，結(jié)合DNA條形碼技術(shù)中的通用引物：

LepF1：(5'-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’)和

LepR1：(5'-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’)

擴(kuò)增出麗草蛉的COI產(chǎn)物，進(jìn)行多條引物設(shè)計(jì)，從中篩選出特異性SS-COI引物，即正向引物CfF5和反向引物CfR1。

在上述的基于特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測(cè)方法中，所述步驟(3)中PCR反應(yīng)條件為：首先，94℃3分鐘；其次，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分鐘，共45循環(huán)次；最后，72℃10分鐘。

與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：采用SS-COI PCR技術(shù)檢測(cè)麗草蛉，該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速、高效，靈敏度較高，麗草蛉的DNA最低檢出濃度為0.143ng/μL。

附圖說明

圖1為本發(fā)明麗草蛉特異性引物CfF5/CfR1的PCR檢測(cè)結(jié)果圖。其中，M：100bp DNA ladder；1-64為表1中序號(hào)所對(duì)應(yīng)昆蟲的擴(kuò)增結(jié)果，-為陰性對(duì)照。

圖2為本發(fā)明麗草蛉特異性引物CfF5/CfR1的DNA濃度梯度檢測(cè)結(jié)果圖。其中，M：100bp DNA ladder；1-8為麗草蛉DNA原模板濃度89.54ng/μL依次4倍稀釋濃度梯度，-為陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

如圖1、圖2所示，本方案包括以下步驟：

(1)制備特異性SS-COI引物：根據(jù)麗草蛉的線粒體DNA序列(genbank:KJ592501.1)，設(shè)計(jì)一對(duì)麗草蛉的特異性SS-COI引物，其包括：

正向引物CfF5：5'-TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG-3’

反向引物CfR1：5'-TTGAAGATGCCAGTAATAAG-3’；

(2)提取樣品總DNA：在棉田采集麗草蛉，將單頭蟲體放入1.5mL離心管中將其磨碎，用OMEGA Insect Genomic DNA Kit提取試劑盒(OMEGA公司，美國(guó))提取單頭蟲體基因組溶液。將基因組溶液保存于-20℃?zhèn)溆?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)吸取1μL溶液作為DNA模板；

(3)以步驟2)提取的總DNA為模板，利用正向引物CfF5和反向引物CfR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；PCR反應(yīng)體系以20μL計(jì)為：

(4)分析PCR產(chǎn)物：對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，取8μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1％瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后，于凝膠成像系統(tǒng)中，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小來鑒定麗草蛉，如出現(xiàn)大小為250bp的DNA擴(kuò)增條帶，則表明樣品為麗草蛉。

在上述的基于特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測(cè)方法中，所述步驟(1)中，通過genbank的KJ592501.1，結(jié)合DNA條形碼技術(shù)中的通用引物：

LepF1：(5'-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’)和

LepR1：(5'-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’)

擴(kuò)增出麗草蛉的COI產(chǎn)物，進(jìn)行多條引物設(shè)計(jì)，從中篩選出特異性SS-COI引物，即正向引物CfF5和反向引物CfR1。

在上述的基于特異性SS-COI引物的麗草蛉PCR快速檢測(cè)方法中，所述步驟(3)中PCR反應(yīng)條件為：首先，94℃3分鐘；其次，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分鐘，共45循環(huán)次；最后，72℃10分鐘。

利用引物CfF5/CfR1，以麗草蛉DNA為模板，以麗草蛉同域的44種其他昆蟲(見表1)為對(duì)照進(jìn)行SS-COI PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。1、2泳道對(duì)應(yīng)的麗草蛉擴(kuò)增出了250bp的目的條帶，表明根據(jù)麗草蛉線粒體DNA CO1基因設(shè)計(jì)的SS-COI引物的特異性強(qiáng)，其250bp序列如SEQ ID No.3所示。

表1引物特異性檢測(cè)中所涉及的昆蟲種類

第二部分，引物CfF5/CfR1對(duì)麗草蛉最低檢出量的測(cè)定

按第一部分中的方法提取單頭麗草蛉基因組DNA，然后原模板濃度89.54ng/μL以5倍進(jìn)行遞減稀釋至檢測(cè)不出條帶，取1μL作為PCR檢測(cè)的模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為：首先，94℃3分鐘；其次，94℃30秒，51℃30秒，72℃1分鐘，共45循環(huán)次；最后，72℃10分鐘。

利用引物CfF5/CfR1做最低檢出量的測(cè)定，麗草蛉的DNA最低檢出濃度為0.143ng/μL，結(jié)果如圖2所示。

本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。

序列表:

SEQ ID No.1

CfF5: 5'- TAGTTTAAGTTTATTAATTCGGG -3’

SEQ ID No.2

CfR1: 5’- TTGAAGATGCCAGTAATAAG -3’

SEQ ID No.3

1 TAGTTTAAGT TTATTAATTC GGGCTGAATT AGGTCAACCA GGATCTTTAATTGGTGATGA

61 TCAAATTTAT AATGTAATTG TAACAGCACA TGCTTTTATT ATAATTTTTTTTATAGTAAT

121 ACCAATTGTA ATTGGAGGTT TTGGTAATTG ATTAGTACCT TTAATACTTGCGGCTCCTGA

181 TATAGCTTTT CCACGTATAA ATAATATAAG TTTTTGAATA CTTCCTCCTTCATTAACCTT

241 ATTACTGGCA TCTTCAA

SEQ ID No.4

LepF1：5'-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3’

SEQ ID No.5

LepR1：5'-AAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3’