本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)，基因治療技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種能夠應(yīng)用于干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因修飾、基因重組進(jìn)行干細(xì)胞基因治療應(yīng)用的基因技術(shù)。

背景技術(shù)：

由于慢病毒的非特異靶向性，能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)多種不同性能的細(xì)胞，包括非分裂(non-dividing)細(xì)胞。慢病毒載體已被廣泛應(yīng)用于基因治療和基因修改細(xì)胞中，利用慢病毒載體對(duì)人體造血干細(xì)胞Hematopoetic stem and progenitor Cells(HSPC)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和修飾并用于干細(xì)胞的基因治療，包括腎上腺腦白質(zhì)失養(yǎng)癥(Cartier N,H.Science,2009；326:818-823)和地中海貧血(Cavazzana-Calvo M.Nature,2010；467:318-322)已有報(bào)道，近年來(lái)通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)入外源基因，基因重組干細(xì)胞用以基因治療也越來(lái)越多地進(jìn)入臨床。然而，現(xiàn)有的慢病毒引導(dǎo)外源基因?qū)Ω杉?xì)胞的基因重組率還較低。盡管在某些條件下顯示出較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)率，轉(zhuǎn)入的基因卻難以對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行有效的基因修飾。外源基因在干細(xì)胞內(nèi)顯示出不穩(wěn)定性，難以有效地整合到干細(xì)胞的基因組。另外，目前干細(xì)胞在基因治療上的應(yīng)用所受到的限制因數(shù)之一是技術(shù)上難以擴(kuò)大化，難以生產(chǎn)大量的可用于臨床上的基因修飾后的干細(xì)胞。有些在臨床試驗(yàn)人體內(nèi)所能檢測(cè)到的外源基因率只有0.1％-0.3％，療效亦未能達(dá)到滿意的結(jié)果。因此，如何提高慢病毒對(duì)干細(xì)胞的基因重組率，同時(shí)又保持干細(xì)胞的多元性，保持干細(xì)胞在體內(nèi)的移植成活率，以及轉(zhuǎn)入的外源基因在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性和如何生產(chǎn)大量的足夠用以臨床的基因重組的干細(xì)胞，并且達(dá)到臨床應(yīng)用的有效性，都一直是干細(xì)胞基因治療領(lǐng)域的難題和挑戰(zhàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的之一在于提供一種提高慢病毒對(duì)干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因修飾率，同時(shí)又能保持干細(xì)胞的多元性和重組基因的穩(wěn)定性和安全性，及提高在體內(nèi)的移植成活率的應(yīng)用于細(xì)胞治療，基因治療的改造干細(xì)胞的基因技術(shù)：一種可應(yīng)用于干細(xì)胞和基因治療的改造細(xì)胞的基因技術(shù)，其中，具體應(yīng)用如下：(1)干細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，干細(xì)胞生長(zhǎng)因子激活；(2)慢病毒載體對(duì)干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和修飾；(3)重組慢病毒載體在雷帕霉素(rapamycin)的作用下進(jìn)行干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和重組；(4)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的干細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)或者體外細(xì)胞性能檢測(cè)和基因重組檢測(cè)。

在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞可為干細(xì)胞，免疫細(xì)胞，或者不同類(lèi)型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。干細(xì)胞可采用新鮮優(yōu)選或凍存復(fù)蘇的干細(xì)胞。所述干細(xì)胞是造血干細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞，所述造血干細(xì)胞來(lái)源于成人運(yùn)動(dòng)型外周血造血CD34+干細(xì)胞，骨髓干細(xì)胞或臍帶血干細(xì)胞，所述間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源不同組織如骨髓，皮膚，脂肪，胎盤(pán)，臍帶，臍帶血等；所述的培養(yǎng)基是含有干細(xì)胞生長(zhǎng)因子例如SCF(recombinant human stem cell factor),Flt-3L(FMS-like tyrosine kinase-3 ligand),thrombopoietin(TPO)的培養(yǎng)基。

在一些實(shí)施方式中，慢病毒載體可以是含有不同啟動(dòng)子promoter或者不同抗病基因分子therapuetic molecules結(jié)構(gòu)的重組慢病毒載體。

在一些實(shí)施方式中，重組慢病毒載體為自身失活的基于HIV的慢病毒載體(self-inactivating HIV-based Lentiviral vectors)。

在一些實(shí)施方式中，慢病毒載體可以是攜帶不同抗病基因分子的重組慢病毒載體，例如攜帶抗艾滋病的抗病基因分子therapuetic molecules和EGFP報(bào)告基因。

在一些實(shí)施方式中，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細(xì)胞功能性檢測(cè)應(yīng)用humanized mouse model動(dòng)物模型。

另外，由于雷帕霉素具有免疫抑制，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)自噬的功能，在臨床上，雷帕霉素已用來(lái)防止器官移植免疫排斥和GVHD，以及抗腫瘤試 劑。同時(shí)，雷帕霉素能夠增強(qiáng)干細(xì)胞在免疫缺陷小鼠(immunodeficient mice)體內(nèi)的移植和重建。結(jié)合雷帕霉素作用于干細(xì)胞的基因重組有可能增強(qiáng)干細(xì)胞基因治療的臨床應(yīng)用，因此，本發(fā)明的另一目的在于開(kāi)發(fā)雷帕霉素(Rapamycin)在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，修飾，重組，以及臨床應(yīng)用的新用途。一種利用雷帕霉素(Rapamycin)和慢病毒載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、修飾，和重組，應(yīng)用于基因治療的改造細(xì)胞的基因技術(shù)，其中，具體應(yīng)用如下：，以在干細(xì)胞上的應(yīng)用為例，(1)將干細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，之后干細(xì)胞生長(zhǎng)因子激活；(2)應(yīng)用雷帕霉素和慢病毒載體，在雷帕霉素作用下，利用慢病毒載體對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)；(3)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的干細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)或者用于動(dòng)物體外細(xì)胞性能檢測(cè)和基因重組檢測(cè)。同時(shí)，所采用的慢病毒載體攜帶抗艾滋病的基因分子，因此本發(fā)明所提供的干細(xì)胞可臨床上用以基因治療艾滋病。

在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞可為干細(xì)胞，免疫細(xì)胞，或者不同類(lèi)型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；所述干細(xì)胞是造血干細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞，所述造血干細(xì)胞來(lái)源于成人運(yùn)動(dòng)型外周血造血CD34+干細(xì)胞，骨髓干細(xì)胞或臍帶血干細(xì)胞，所述間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源不同組織如骨髓，皮膚，脂肪，胎盤(pán)，臍帶，臍帶血等；所述的培養(yǎng)基是含有干細(xì)胞生長(zhǎng)因子其中包括SCF(recombinant human stem cell factor),Flt-3L(FMS-like tyrosine kinase-3 ligand),thrombopoietin(TPO)的培養(yǎng)基。

在一些實(shí)施方式中，雷帕霉素結(jié)合病毒載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因重組應(yīng)用于基因治療。

在一些實(shí)施方式中，慢病毒載體可以是含有不同啟動(dòng)子promoter或者不同抗病基因分子therapuetic molecles結(jié)構(gòu)的重組慢病毒載體。

在一些實(shí)施方式中，重組慢病毒載體為自身失活的基于HIV的慢病毒載體(self-inactivating HIV-based Lentiviral vectors)。

在一些實(shí)施方式中，慢病毒載體攜帶有抗艾滋病的基因分子或攜帶EGFP報(bào)告基因。

在一些實(shí)施方式中，慢病毒載體可以是攜帶不同抗病基因分子(therapuetic molecules)的重組慢病毒載體。

在一些實(shí)施方式中，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細(xì)胞功能性檢測(cè)應(yīng)用humanized mouse model動(dòng)物模型。

本發(fā)明的有益效果是具有提高慢病毒載體對(duì)細(xì)胞的基因重組率。具體在干細(xì)胞的應(yīng)用上，提高對(duì)干細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因修飾，重組率，同時(shí)又能保持干細(xì)胞的多元性和重組基因的穩(wěn)定性和安全性，及提高在體內(nèi)的移植成活率的效果。由于將人體造血干細(xì)胞CD34+HSPC在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入雷帕霉素和慢病毒載體，在雷帕霉素作用下，利用慢病毒載體對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，有效地提高慢病毒載體對(duì)干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)所測(cè)試的慢病毒載體的結(jié)構(gòu)沒(méi)有限制，對(duì)不同個(gè)體的干細(xì)胞，對(duì)不同來(lái)源的干細(xì)胞也沒(méi)有限制。更重要的是，有效地增強(qiáng)基因修飾和基因重組率。所轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因在動(dòng)物模型體內(nèi)以及體外實(shí)驗(yàn)都表現(xiàn)出穩(wěn)定性，而且在動(dòng)物體內(nèi)有效地種植并能分化成不同的子細(xì)胞。上述的雷帕霉素是可以加入，也可以是不加入。在雷帕霉素的作用下，慢病毒對(duì)造血干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率提高兩到三倍。利用該技術(shù)轉(zhuǎn)入的外源基因明顯顯示出其穩(wěn)定性。重組后的干細(xì)胞在體外實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都顯示出良好的干細(xì)胞性能，保持干細(xì)胞的多元性和再生性。不僅能夠大大地提高慢病毒對(duì)干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率，而且大大地提高對(duì)干細(xì)胞的基因修飾和重組率。對(duì)多種不同結(jié)構(gòu)的慢病毒，對(duì)多種造血干細(xì)胞包括成人運(yùn)動(dòng)型外周血干細(xì)胞，臍帶血干細(xì)胞，骨髓干細(xì)胞都有同樣的效果?？蓮V泛地應(yīng)用在基因治療，細(xì)胞治療上。在醫(yī)學(xué)臨床上具有很好的應(yīng)用前景。實(shí)現(xiàn)了提高慢病毒載體對(duì)干細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因修飾率，同時(shí)又能保持干細(xì)胞的多元性和重組基因的穩(wěn)定性和安全性，及提高在動(dòng)物/人體內(nèi)的移植成活率的技術(shù)效果。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中雷帕霉素增強(qiáng)慢病毒載體對(duì)成人造血干細(xì)胞的基因修飾的變化分析圖；

圖2為本發(fā)明中雷帕霉素對(duì)不同結(jié)構(gòu)的慢病毒載體的干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化分析圖；

圖3為本發(fā)明中LV2慢病毒載體對(duì)六個(gè)不同個(gè)體的CD34+干細(xì)胞所進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化分析圖；

圖4為本發(fā)明中雷帕霉素對(duì)基因修飾的干細(xì)胞多元性影響的變化分析 圖；

圖5為本發(fā)明中基因修飾重組的干細(xì)胞在NSG小鼠體內(nèi)的移植和重建的變化分析圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

實(shí)施例1

一種應(yīng)用于干細(xì)胞的基因技術(shù)，具體應(yīng)用如下：(1)干細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，干細(xì)胞生長(zhǎng)因子激活，細(xì)胞培養(yǎng)采用24-well plate，細(xì)胞濃度為1-2x10⁵cells/mL。37℃的溫度環(huán)境下,在5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)干細(xì)胞12-16小時(shí)。(2)慢病毒載體對(duì)干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和修飾。(3)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的干細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)或者動(dòng)物體外細(xì)胞性能檢測(cè)和基因重組檢測(cè)?；蜣D(zhuǎn)導(dǎo)率的檢測(cè)是將經(jīng)過(guò)12-16小時(shí)培養(yǎng)的干細(xì)胞用離心機(jī)離心10分鐘，去除培養(yǎng)基。沉淀的細(xì)胞再用PBS洗10分鐘，之后繼續(xù)在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-16小時(shí)后取出。用流速細(xì)胞儀檢測(cè)含GFP+％細(xì)胞以檢測(cè)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率。在該實(shí)施例中，干細(xì)胞為CD34+HSPC，只用于說(shuō)明該發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍。干細(xì)胞來(lái)源不限；所述的培養(yǎng)基是含有干細(xì)胞生長(zhǎng)因子10ug/mL的SCF(recombinant human stem cell factor),Flt-3L(FMS-like tyrosine kinase-3 ligand),thrombopoietin(TPO)的培養(yǎng)基。

慢病毒載體：采用了四種不同結(jié)構(gòu)自身失活的基于HIV的慢病毒載體(self-inactivating HIV-based Lentiviral vectors),這些慢病毒載體只用于說(shuō)明該發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍。生產(chǎn)慢病毒載體的方式以及來(lái)源不限。

Lenti-V1,Lenti-V2,Lenti-V3,以及Lenti-V4.其中，Lenti-V1,V2,V3慢病毒含有EGFP報(bào)告基因?？捎靡苑奖愕貦z測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)率。Lenti-V4不含報(bào)告基因GFP,其檢測(cè)通過(guò)qPCR來(lái)檢測(cè)。所述慢病毒載體帶有不同結(jié)構(gòu)的抗艾滋病基因分子。

CD34+HSPC干細(xì)胞：成人運(yùn)動(dòng)型外周血造血CD34+干細(xì)胞(CD34+HSPC)。CD34+HSPC的慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)：CD34+干細(xì)胞，在含有10ng/mL的SCF(recombinant human stem cell factor),Flt-3L(FMS-like tyrosine kinase-3 ligand,10ng/mL of thrombopoietin(TPO)的SCGM(Stem cell growth medium,CellGenix)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-24小時(shí)。細(xì)胞濃度為2-5x10⁵cells/mL。同時(shí)加入MOI2至MOI5的慢病毒載體。小規(guī)模的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程可利用本領(lǐng)域所介紹的方法在利用24-孔板，細(xì)胞濃度為1-2x10⁵cells/mL.在37℃,5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16小時(shí)。

實(shí)施例2，開(kāi)發(fā)雷帕霉素(Rapamycin)在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)/修飾/重組的新用途以及臨床應(yīng)用。

一種應(yīng)用于基因治療的改造細(xì)胞的基因技術(shù)，其中，具體應(yīng)用如下：下面結(jié)合雷帕霉素在細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)/修飾/重組的應(yīng)用，(1)將干細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，之后干細(xì)胞生長(zhǎng)因子被激活，細(xì)胞培養(yǎng)采用24-孔板，細(xì)胞濃度為1-2x10⁵cells/mL。37℃的溫度環(huán)境下,在5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)干細(xì)胞12-16小時(shí)。(2)應(yīng)用雷帕霉素和慢病毒載體，在雷帕霉素作用下，利用慢病毒載體對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)；(3)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的干細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)或者用于動(dòng)物體外細(xì)胞性能檢測(cè)和基因重組檢測(cè)。基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率的檢測(cè)是將經(jīng)過(guò)12-16小時(shí)培養(yǎng)的干細(xì)胞用離心機(jī)離心10分鐘，去除培養(yǎng)基。沉淀的細(xì)胞再用PBS洗10分鐘，之后繼續(xù)在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-16小時(shí)后取出。用流速細(xì)胞儀檢測(cè)含GFP+％細(xì)胞以檢測(cè)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率。所述的干細(xì)胞為CD34+HSPC所述的培養(yǎng)基是含有干細(xì)胞生長(zhǎng)因子SCF(recombinant human stem cell factor),Flt-3L(FMS-like tyrosine kinase-3 ligand),thrombopoietin(TPO)的培養(yǎng)基。同時(shí)加入MOI2至MOI5的慢病毒載體。小規(guī)模的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程可利用本領(lǐng)域所介紹的方法在利用24-孔板，細(xì)胞濃度為1-2x10⁵cells/mL，在37℃,5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16小時(shí)。加入雷帕霉素結(jié)合慢病毒載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因重組應(yīng)用于基因治療。慢病毒載體可以是含有不同啟動(dòng)子promoter或者不同抗病基因分子therapuetic molecles結(jié)構(gòu)的重組慢病毒載體。重組慢病毒載體為自身失活的基于HIV的慢病毒載體(self-inactivating HIV-based Lentiviral vectors)。要特別強(qiáng)調(diào)的是，慢病毒載體攜帶有抗艾滋病的基因分子therapuetic molecules或攜帶EGFP報(bào)告基因。因此，有效地將這種抗艾滋病的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到干細(xì)胞中，是有效地進(jìn)行基因 治療，干細(xì)胞治療艾滋病的前提。慢病毒載體可以是攜帶不同抗病基因分子的重組慢病毒載體?；蜣D(zhuǎn)導(dǎo)的干細(xì)胞功能性檢測(cè)的humanized animal model動(dòng)物模型。

實(shí)施例3如圖1所示，雷帕霉素增強(qiáng)慢病毒對(duì)成人造血干細(xì)胞的基因修飾。

慢病毒載體：采用自身失活的慢病毒載體(self-inactivated lentiviral vector)攜帶EGFP報(bào)告基因(reporter gene)以便于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)方法的檢測(cè)。實(shí)施例1采用上述技術(shù)方案中所提到的LV1為例子以便說(shuō)明，但并不限制本發(fā)明的實(shí)用范圍。

干細(xì)胞是優(yōu)選的CD34+adult hematopoietic stem and progenitor cells(HPSC)成人造血干細(xì)胞.

1.慢病毒載體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)干細(xì)胞：采用重組慢病毒載體LV1對(duì)培養(yǎng)的CD34+HSPC干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。以加或沒(méi)加雷帕霉素進(jìn)行對(duì)照。利用細(xì)胞流速儀對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細(xì)胞進(jìn)行GFP+細(xì)胞分析。結(jié)果如圖1所示。圖中結(jié)果來(lái)至9個(gè)不同人的CD34+HSPC的轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表達(dá)為me an±SD。如圖1所示，Gray bar：慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細(xì)胞(-雷帕霉素)。Black bar：慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細(xì)胞(+雷帕霉素)。結(jié)果表明，在雷帕霉素的作用下，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率在CD34+干細(xì)胞以及CD34+CD90+原始的干細(xì)胞亞群都顯著的提高。而對(duì)于CD90+CD49f+干細(xì)胞亞群，盡管統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)顯著變化，但也表現(xiàn)出增長(zhǎng)的趨勢(shì)。

實(shí)施例4雷帕霉素對(duì)不同結(jié)構(gòu)的腺病毒載體的干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)作用

慢病毒載體：在該實(shí)施例中，分別檢測(cè)了三種不同結(jié)構(gòu)的自身失活的慢病毒載體(self-inactivated lentiviral vector)，LV1和LV3攜帶GFP以便于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)方法的檢測(cè)，LV4不含GFP，因此，采用qPCR的方法來(lái)檢測(cè)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率。

CD34+成人造血干細(xì)胞:該實(shí)施例檢測(cè)了三個(gè)健康成人的運(yùn)動(dòng)型外周血CD34+干細(xì)胞。

慢病毒載體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)：采用LV1，LV3,LV4慢病毒載體對(duì)激活的CD34+HSPC干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。以加或沒(méi)加雷帕霉素進(jìn)行對(duì)照。利用細(xì)胞流速儀對(duì) LV1,LV3轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細(xì)胞進(jìn)行GFP+細(xì)胞分析。結(jié)果如圖2所示。圖中結(jié)果來(lái)至三個(gè)不同人的CD34+HSPC的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表達(dá)為mean±SD。

如圖2所示，在雷帕霉素的作用下，對(duì)不同結(jié)構(gòu)的慢病毒載體LV1,LV3,LV4干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率都有顯著提高的效果。這三種慢病毒載體都帶有不同的抗艾滋病基因。

如圖3所示，LV2慢病毒載體對(duì)六個(gè)不同個(gè)體的CD34+干細(xì)胞所進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，雷帕霉素對(duì)不同個(gè)體來(lái)源的干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)都有增強(qiáng)的效應(yīng)。結(jié)果表明，該發(fā)明不受個(gè)體的限制，在不同個(gè)體上都有效果。

實(shí)施例5，雷帕霉素對(duì)基因修飾的干細(xì)胞的造血潛能(hematopoet ic potential)的影響。

利用干細(xì)胞進(jìn)行基因治療的主要原因是干細(xì)胞所擁有的特性。干細(xì)胞能夠分化成多種不同的血細(xì)胞，免疫細(xì)胞。同時(shí)干細(xì)胞具有再生性。因此保留基因修飾后的干細(xì)胞本身具有的性能是將干細(xì)胞成功地應(yīng)用在基因治療上的關(guān)鍵。對(duì)實(shí)施例3的應(yīng)用該發(fā)明基因修飾后的干細(xì)胞的生物性能進(jìn)行了體外檢測(cè)。體外干細(xì)胞CFU(colony forming Unit)實(shí)驗(yàn)：利用上述實(shí)施例的非基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細(xì)胞在CFU培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-14天(具體培養(yǎng)方法可參照產(chǎn)商的說(shuō)明)。圖3顯示的是來(lái)至三個(gè)不同個(gè)體的干細(xì)胞的differential lineage colonies的結(jié)果，并對(duì)其平均值(mean±SD)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。如圖4所示，Untd:Untransduced；Untd+Rapa:Untranduced+雷帕霉素；LV1：LV1transduced；LV1+Rapa：LV1transduced加雷帕霉素。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，經(jīng)過(guò)雷帕霉素處理，慢病毒載體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后的干細(xì)胞同樣保持其干細(xì)胞的特性，在分化成多種子細(xì)胞的能力上沒(méi)有差別。

實(shí)施例6基因修飾重組的干細(xì)胞在NSG小鼠體內(nèi)的移植和重建

小鼠模型采用，NSG Mice,NOD.Cg-Prkdc^scid IL2rg^tm1wj1/SzJ。8-10周的Adult NSG mice經(jīng)放射線照射，每只小鼠注射2-5X10⁵的慢病毒LV1改造后的干細(xì)胞或未經(jīng)改造的CD34+干細(xì)胞。LV1慢病毒載體如上所述 含有EGFP報(bào)告基因，其表達(dá)用于檢測(cè)基因重組率以及在動(dòng)物體內(nèi)的移植重建。8周后，收集小鼠的骨髓和胰腺進(jìn)行移植重建的細(xì)胞分析。

動(dòng)物體內(nèi)器官的移植重建檢測(cè)分析:用anti-human CD45-PC7。

CD14-APC-Alexa750來(lái)檢測(cè)小鼠的骨髓細(xì)胞中人體細(xì)胞，CD45-PC7，CD3-ECD和CD4-APC來(lái)檢測(cè)小鼠胰腺中的人體細(xì)胞以及人體干細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的重建。

如圖5所示，小鼠脾移植分析(spleen engraftme nt analysis)。Non-Transduced:小鼠注射了未經(jīng)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD34+干細(xì)胞。Transduced:小鼠注射了基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細(xì)胞。Transduced+Rapa:小鼠注射了雷帕霉素作用下基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細(xì)胞。結(jié)果顯示，接受LV1轉(zhuǎn)導(dǎo)和雷帕霉素作用的CD34+細(xì)胞移植的小鼠脾，57％的CD45+人體細(xì)胞表達(dá)EGFP，而接受LV1轉(zhuǎn)導(dǎo)未經(jīng)雷帕霉素作用的干細(xì)胞移植的小鼠脾，只有12％的CD45+細(xì)胞表達(dá)EGFP，結(jié)果表明雷帕霉素作用下的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的移植較對(duì)照組的小鼠有顯著的提高(57％vs12％)。其中，Rapa-Transduced實(shí)驗(yàn)組14％的CD4+細(xì)胞表達(dá)GFP，而Transduced實(shí)驗(yàn)組只有1％的CD4+細(xì)胞表達(dá)GFP。結(jié)果表明，雷帕霉素作用下慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的干細(xì)胞不僅能夠成功地在動(dòng)物體能移植，而且移植的CD34+干細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)能夠分化成功能性子細(xì)胞，例如CD4+免疫細(xì)胞。CD4+是N4tropic HIV病毒的靶細(xì)胞，LV1慢病毒帶有抗艾滋病基因。抗艾滋病基因在CD4+靶細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)使得該發(fā)明在臨床上用以干細(xì)胞治療艾滋病具有重大的意義。

以上所述的僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于發(fā)明的保護(hù)范圍。