本發(fā)明屬于化學分析檢測技術領域，具體涉及一種新型季銨鹽類熒光探針及其應用。

背景技術：

一氧化氮分子(no)是生物體內(nèi)一種重要的信使小分子,參與了體內(nèi)多個系統(tǒng)的生理功能的調(diào)控。目前很多證據(jù)顯示一氧化氮也與多種疾病相關，如糖尿病、帕金森癥和阿茲海默癥等。因此no供體藥物作為潛在的心血管、抗腫瘤、新型抗炎和抗阿爾茲海默病藥物，引起了廣泛的關注。no作為氣體自由基在生物體內(nèi)極不穩(wěn)定，濃度很低，容易擴散,容易被氧氣及其他氧化物氧化，因此在生物體內(nèi)檢測no的方法一直是相關研究的一個的熱點,建立一種有靈敏度高、選擇性強的檢測一氧化氮的方法是非常必要的。

no的檢測方法有電化學法、化學發(fā)光法等，與這幾種no的檢測方法相比，熒光探針法對no的選擇性好、空間和時間響應性高。作為一種常規(guī)的檢測手段,熒光探針法具有需樣量少、取樣容易、操作簡便易行等優(yōu)點，被認為是最有應用前景的檢測技術。

目前，應用較好的一類探針為鄰苯二胺類，但其因檢測極限較高、必須在氧氣存在下才能檢測到與no，使其應用受到限制。因此，研究一種能直接與no作用，不受氧化劑和生理條件下ph的影響、溶解性好，檢測生物體內(nèi)外no、no供體藥物釋放的一氧化氮、食品中亞硝酸鹽含量的熒光探針迫在眉睫。

亞硝酸鹽作為一種常用的食品添加劑廣泛存在于肉類及咸菜等腌制食品中。但是，當人體攝入過量的亞硝酸鹽以后，會對人體健康構成危害。因此，食品中亞硝酸鹽的含量測定方法研究具有重要的意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種季銨鹽熒光探針。

本發(fā)明的目的還在于提供一種選擇性強、靈敏度高、能夠用于細胞內(nèi)外no檢測的方法。

本發(fā)明的目的還在于提供一種選擇性強、靈敏度高、在酸性條件下能夠用季銨鹽類熒光法檢測和分析食品中及環(huán)境中的亞硝酸鹽的方法。

本發(fā)明的目的還在于提供一種季銨鹽類熒光光度法測定no供體藥物含量的測定方法。

一種季銨鹽熒光探針，所述熒光探針的分子結構如下述通式i或通式ii所示：

式中，r為甲基，乙基，異丙基，丙基；r’為氯、溴或碘；n＝2-6。

上述的季銨鹽熒光探針在細胞內(nèi)外no的檢測中的應用。

上述的季銨鹽熒光探針在分析食品和環(huán)境中亞硝酸鹽中的應用。

上述的季銨鹽熒光探針在熒光光度法測定no供體藥物含量中的應用。

上述的季銨鹽為off-on型季銨鹽類。

本發(fā)明的熒光探針分子的應用方法如下，將探針分子溶解在去離子水中，當其捕捉到一氧化氮后或者在酸性條件下和亞硝酸根離子反應后，二氫吡啶單元被芳香化為吡啶單元。使得熒光得以恢復。探針分子與亞硝酸根離子的作用如下所示：

本發(fā)明的探針分子本身無明顯的發(fā)射峰，但是當探針捕捉到no或在酸性條件下與亞硝酸根離子反應后，就會出現(xiàn)明顯的發(fā)射峰，熒光強度明顯增強(如圖1所示，dhps1(cdhps1＝5.0×10^-6mol·l^-1)在鹽酸(chcl＝0.18mol·l^-1)條件下，與不同濃度的亞硝酸根離子作用后的熒光光譜圖，反應溫度,75℃；反應時間,30min)。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明的季銨鹽類熒光探針法具有靈敏度高、選擇性好、檢測限低、儀器設備簡單、操作簡便等諸多優(yōu)點。應用季銨鹽類熒光探針建立的no供體藥物含量測定方法準確可靠，建立的細胞內(nèi)外no檢測方法靈敏，還可應用于食品中亞硝酸鹽的檢測方法，用途廣泛。

附圖說明

圖1為探針分子dhps1和dhps1與no反應后pys1的紫外吸收圖譜。

圖2為探針分子dhps1和dhps1與no反應后pys1的熒光激發(fā)和發(fā)射圖譜。

圖3為為探針分子dhps1分別與no(2equiv.)和其他干擾性離子(100equiv.)在同等條件下反應。橫坐標為干擾性離子，縱坐標為熒光強度的增強值。

圖4為探針分子dhps1和dhps1與no反應后pys1的熒光強度和溶液ph的關系。橫坐標為ph值，縱坐標為熒光強度。

圖5為為探針分子dhps1與no反應熒光強度隨時間的變化。橫坐標為時間，縱坐標為熒光強度的增強值。

圖6為熒光強度和no當量之間的線性關系圖。橫坐標為一氧化氮當量值，縱坐標為熒光強度。

圖7為dhps1和不同當量no反應的熒光發(fā)射光譜圖。橫坐標為波長，縱坐標為熒光強度。

圖8為在亞硝酸根離子濃度為4×10^-7mol·l^-1時，在0.18mol·l^-1鹽酸條件下，本發(fā)明熒光探針的濃度與熒光強度的增強度之間的關系，橫坐標為探針的濃度(2×10^-5mol·l^-1-8×10^-5mol·l^-1)，縱坐標為熒光強度的增強值。

圖9為本發(fā)明熒光探針dhps1(5×10^-6mol·l^-1)在60℃和30min條件下，在不同濃度的鹽酸條件下與亞硝酸根離子(4×10^-7mol·l^-1)作用后的熒光強度增強值得變化，橫坐標為鹽酸的濃度(0.10mol·l^-1-0.22mol·l^-1)，縱坐標為熒光強度的增強值。

圖10為本發(fā)明熒光探針dhps1(5×10^-6mol·l^-1)在0.18mol·l^-1鹽酸條件下，與亞硝酸根離子(4×10^-7mol·l^-1)作用后的熒光強度隨時間和溫度的變化，橫坐標為時間，縱坐標為熒光強度的增強值。

圖11為本發(fā)明熒光探針dhps1(5×10^-5mol·l^-1)在0.18mol·l^-1鹽酸條件下，與不同濃度的亞硝酸根離子(0-8×10^-7mol·l^-1)作用后的熒光光譜的變化，橫坐標為波長，縱坐標為熒光強度增強值。

圖12為本發(fā)明熒光探針dhps1(5×10^-6mol·l^-1)在0.18mol·l^-1鹽酸條件下，與亞硝酸根離子作用后的熒光光譜的變化與亞硝酸根離子濃度(0-8×10^-7mol·l^-1)的線性關系，橫坐標為亞硝酸根離子的濃度，縱坐標為熒光強度的增強值。

圖13為探針dhps1在raw264.7細胞中對一氧化氮的檢測成像:明場(上)和相應的熒光(下)；(左)只加探針(10μm)培養(yǎng)8h；(右)先加lps(0.5μg/ml)培養(yǎng)4h，再加探針(10μm)培養(yǎng)8h。

具體實施方式

下面結合附圖，對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述，但應當理解本發(fā)明的保護范圍并不受具體實施方式的限制。

實施例1探針分子dhps1的合成

合成路線如下所示：

將化合物4-丙醛基-7甲氧基香豆素溶于乙醇溶液中，再加入3當量的醋酸銨，3當量的乙酰乙酸四氯丁醇酯，加熱回流4h，柱層析分離，真空干燥得到淡黃色固體產(chǎn)物dhp-a¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.41(d,j＝8.8hz,1h),6.81(m,2h),6.11(s,1h),5.84(s,1h),4.24–4.03(m,5h),3.85(s,3h),3.56(t,j＝6.2hz,4h),2.63–2.67(t,＝8hz2h),2.34(s,6h),1.93–1.64(m,10h).¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ167.04,161.97,161.11,156.56,/154.98,145.55,124.69,112.40,111.77,109.80,101.60,100.51,76.84,76.52,76.20,62.66,55.22,43.96,34.45,32.57,28.90,26.89,25.75,18.99.esi-mscalculated579.2,found602.2[m+na]⁺。

將上述產(chǎn)物dhp-a和三甲胺醇溶液溶于乙醇中，加熱回流12h，加有機溶劑處理析出淡黃色固體，抽濾，用有機溶劑洗滌3次，真空條件下干燥12-36h得黃色固體，黃色固體即為探針分子dhps1.¹hnmr(400mhz,d2o)δ7.12(d,j＝8.9hz,1h),6.71–6.69(d,j＝8.9hz,1h),6.57(d,j＝2.0hz,1h),5.80(s,1h),4.01(t,j＝6.1hz,4h),3.77(s,3h),3.73(s.1h)3.35–3.24(m,4h),3.04(s,18h),2.34(m,2h),2.09(s,6h),1.84–1.41(m,10h).¹³cnmr(100mhz,d2o)δ169.44,163.64,162.33,159.38,154.31,148.71,125.52,112.55,112.50,108.56,100.98,99.99,66.09,63.60,59.49,56.00,52.90,33.36,32.67,26.21,25.04,19.51,18.27.esi-mscalculated[m]²⁺313.9,found(c35h53n3o7)²⁺313.4.

實施例2季銨鹽熒光探針用于細胞內(nèi)外no的檢測

為證明該探針能夠檢測細胞內(nèi)外的no，我們做了如下實驗，首先我們考察探針dhps1與no反應前后紫外光譜和熒光光譜的變化如圖1和圖2所示，dhps1和其與no反應產(chǎn)物pys1的紫外吸收峰位移沒有發(fā)生很大變化，但是熒光強度明顯增強。同時我們考察了探針dhps1對no的選擇性和靈敏度、對ph耐受性、以及與no響應快慢。如圖3所示，探針dhps1只在no存在的條件下，熒光強度才發(fā)生明顯的變化，而在其他活性氮化物和活性氧化物aa、no^-2、no^-3、h2o2、oono^-、clo^-、¹o2存在的條件下，熒光強度相對于空白的變化可以忽略不計，說明熒光探針dhps1對no的選擇性強；同時良好的熒光探針還需要對ph具有強的耐受性，如圖4所示，在ph為4-10范圍變化，熒光探針dhps1和其產(chǎn)物pys1的熒光強度穩(wěn)定，說明探針對ph的耐受性良好；良好的熒光探針應與no作用迅速，我們考察了dhps1在2當量的no的條件下，熒光強度在10min就達到最大且穩(wěn)定(如圖5-7所示)，說明熒光探針dhps1能很快與no響應，符合良好探針應具備的性質(zhì)。所以我們將其應用檢測raw264.7細胞在lps刺激下產(chǎn)生的內(nèi)源性no。

將培養(yǎng)好的raw264.7細胞在顯微鏡下觀察，待其生長狀態(tài)良好，將其消化分裝到1ml的共聚焦培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，待其完全貼壁。用不同的方式培養(yǎng):1，加入一定的探針，培養(yǎng)8h。2，先加入lps(0.5μg/ml)(刺激raw264.7產(chǎn)生no)培養(yǎng)4h，再加探針(10μm)培養(yǎng)8h。先加入一定的lps刺激細胞產(chǎn)生no后，再加入探針培養(yǎng)，可以觀察到明顯的熒光現(xiàn)象，而沒有l(wèi)ps刺激的，只加探針的熒光現(xiàn)象不明顯。由此可推斷dhps1可以測定內(nèi)源性no。

實施例3季銨鹽熒光探針用于分析食品和環(huán)境中的亞硝酸鹽

探針dhps1在酸性條件下與亞硝酸鹽反應生成pys1，熒光強度大大增強?；诖私橐环N能夠準確檢測亞硝酸鹽的含量的方法，我們對該方法進行條件優(yōu)化，選擇探針的濃度、鹽酸的濃度、反應的溫度和時間、共存影響離子的考察。在其他三種條件(鹽酸的濃度、反應的溫度和時間)固定的條件下，改變熒光探針dhps1的濃度，如圖8所示，當熒光探針的濃度在3×10^-5mol·l^-1-8×10^-5mol·l^-1,體系的熒光強度穩(wěn)定，所以選擇5×10^-5mol·l^-1為最佳探針濃度；在其他三種條件(探針的濃度、反應的溫度和時間)固定的條件下，改變鹽酸的濃度(如圖9所示)，當鹽酸的濃度在0.18mol·l^-1時，體系的熒光強度最大，所以選擇0.18mol·l^-1為最佳鹽酸濃度；在其他兩種條件(探針的濃度、鹽酸的濃度)固定的條件下，通過改變體系反應的時間和溫度，得出熒光強度與溫度和時間的關系曲線，如圖10所示，為了使該方法更具有應用價值，我們選在最佳溫度75℃和最佳反應時間為30min。

在上述幾種反應條件固定的條件下，我們向反應體系中分別加入下列干擾物質(zhì)nacl、nabr、ch3coona、nh4cl、cacl2、ki、nahco3、na2co3、cacl2、nh4cl、kcl，當熒光強度的改變值與不加干擾離子的熒光強度相比，誤差不超過5％時，體系中所允許的最大濃度的干擾離子。如表1所示。探針分子dhps1表現(xiàn)出很好的抗干擾能力，對于食品中和環(huán)境中亞硝酸根離子的檢測和分析具有一定的應用價值。

表1dhps1的抗干擾能力，亞硝酸根離子與其他離子共存，與熒光探針在鹽酸條件下作用

我們在上述幾種實驗條件固定條件下，分別取0.00,0.04,0.08,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6ml的5.0×10^-6mol·l^-1亞硝酸鈉標準使用溶液于10個10ml比色管中,加入1.00ml探針溶液,1.00mlhcl,去離子水定容到5.00ml,在最佳條件下反應,定容。以325nm為激發(fā)波長,測在393nm熒光強度。得到隨著亞硝酸鈉濃度升高的一系列熒光發(fā)射光譜(如圖11)和亞硝酸鈉濃度一熒光強度增強值的關系曲線(見圖12)。在最佳實驗條件下，當亞硝酸鈉的濃度在0.2×10^-7mol/l-8×10^-7mol/l。兩者線性關系良好。標準曲線方程為y＝106.9c-3.7(y為熒光強度增強值,c為亞硝酸鈉的濃度10^-7mol/l),相關系數(shù)r²＝0.9991。

向6只10ml的比色管中加入各加入1ml5.0×10^-5mol·l^-1的探針溶液，其中三只加入相同量的腌菜的提取液，另外三只做空白對照。向六只比色管中加入1ml0.18mol·l^-1的鹽酸溶液，分別加入去離子水稀釋至5ml，于75℃的水浴鍋中反應30min，取出比色管，使用冰水迅速將其冷卻至室溫。用0.1m的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉(ph＝7.4)緩沖溶液稀釋至刻度，以325nm為激發(fā)波長，測定溶液在393nm的熒光強度，與空白試驗對比，計算熒光強度的增強值。根據(jù)線性方程求出腌制咸菜的亞硝酸含量。如表2所示。

表2

以上公開的僅為本發(fā)明的具體實施例，但是，本發(fā)明并非局限于此，任何本領域的技術人員能思之的變化都應落入本發(fā)明的保護范圍。