本發(fā)明的一種人胎盤中分子量為4.7KD多肽的純化方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

目前，人胎盤在我國有悠久的保健歷史，是一味重要的人源性藥物，在本草綱目中學(xué)名叫“紫河車”，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中還被稱為“人胞”或“胞衣”,中醫(yī)上胎盤藥性溫補,能滋補強壯、養(yǎng)血填精、益氣健脾、改善神經(jīng)衰弱、提高人體免疫力等；醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)人胎盤中含有大量的多肽、蛋白質(zhì)、免疫因子、女性激素、助孕酮、類固醇激素、促性腺激素、促腎上腺皮質(zhì)激素等有效活性成分；經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)提取的人胎盤提取液，已廣泛用于癌癥化療后的輔助治療、并且能促進乳腺、子宮、陰道、睪丸的發(fā)育、對甲狀腺也有促進作用、對肺結(jié)核、支氣管哮喘、以及內(nèi)分泌失調(diào)等亦有良效，還可應(yīng)用于化妝品中。

我國是最早從事人胎盤多肽研究的國家之一，人胎盤多肽是從人胎盤中所含的多種營養(yǎng)成分中提取出的分子量少于10000 道爾頓的小分子活性功能多肽，目前醫(yī)學(xué)上對人胎盤多肽的研究大多主要集中在功能和應(yīng)用上，對其中有效成分的純化研究報道相當(dāng)少，市場上銷售的胎盤多肽提取液和胎盤提取液多為組合成分，這種組合提取液組分相對復(fù)雜，可控性差，有效成分利用率和利用效果也難以達到最佳。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一種人胎盤中分子量為4.7KD多肽的純化方法，主要是為了解決傳統(tǒng)工藝中人胎盤提取液組分復(fù)雜，可控性差，單一有效成分利用率低，利用效果差等問題，通過樣品凍融提取、調(diào)pH離心、超濾以及HPLC和RP-HPLC純化，對人胎盤中4.7KD多肽進行單獨純化，有效的提高了人胎盤中4.7KD多肽的利用率和利用效果，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：一種人胎盤中分子量為4.7KD多肽的純化方法，該純化方法按下列步驟依次進行：人胎盤高速勻漿、反復(fù)凍融后調(diào)pH離心處理、超濾濃縮、HPLC和RP-HPLC純化。

所述人胎盤高速勻漿、反復(fù)凍融后調(diào)pH離心處理、超濾濃縮包括如下步驟：

（1）取人胎盤去筋膜后用生理鹽水洗去血污，稱重后加入胎盤質(zhì)量2倍的生理鹽水勻漿，勻漿溫度控制在0℃～4℃之間；

（2）勻漿后樣品放入-70℃冰箱冷凍，冷凍后樣品再放入室溫中融化，樣品反復(fù)凍融處理3-7次；

（3）凍融后樣品用鹽酸調(diào)pH至3.5～4.5，攪拌均勻后10000rpm離心30min，收集離心上清得人胎盤粗提液；

（4）人胎盤粗提液先用10KD膜包進行超濾，超濾過程中不斷向超濾液中補加冷藏后的生理鹽水，超濾得到的濾過液再用1KD膜包進行濃縮，超濾溫度控制在0℃～4℃之間；

所述HPLC、RP-HPLC純化包括如下步驟：

（1）用流動相A平衡HPLC柱子，流速0.8ml～1.2ml/min，將（1）步驟中超濾濃縮液過柱，收集流出峰，流動相A為PBS；

（2）用流動相B平衡RP-HPLC柱子，流速0.8ml～1.2ml/min，將收集的HPLC流出峰過柱，收集流出峰，流動相B為含有0.1%TFA的水溶液和含有0.1%TFA的乙腈溶液；

（3）將收集的RP-HPLC流出峰用1KD膜包超濾濃縮，超濾過程中不斷加入冷藏后的磷酸鹽緩沖液，反復(fù)超濾置換體系，得人胎盤4.7KD多肽純化樣品。

所述的人胎盤為懷孕足月的健康人胎盤，胎盤保存良好，無變質(zhì)無異味。

所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01-0.15mol/L。

所述柱1包括G2000SW，G2000SWXL，G3000SW，G3000SWXL，G4000SW，G4000SWXL，SuperSW2000，SuperSW3000。

所述柱2包括RP-8，RP-18。

由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明通過改進人胎盤傳統(tǒng)混合提取工藝，優(yōu)化提取步驟，可簡單、快速、低成本對人胎盤中分子量為4.7KD的多肽進行單獨純化，多肽回收率大于87%，純度大于92%，純化后的多肽利用率和利用效果都有明顯提高，在現(xiàn)代生物制藥行業(yè)人胎盤原料嚴(yán)重缺乏的情況下，本發(fā)明具有巨大的經(jīng)濟價值和社會效益。

附圖說明

圖1為為純化后4.7KD多肽Tricine-SDS-PAGE檢測結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但不作為對本發(fā)明的限制。

本發(fā)明的實施例：實施例 1：人胎盤粗提液調(diào)pH離心及超濾濃縮：取健康足月的人胎盤去筋膜后用生理鹽水洗去血污，濾干水分，稱取100g加入200ml冷藏生理鹽水高速勻漿，勻漿溫度控制在0℃～4℃之間，勻漿后樣品放入-70℃冰箱冷凍，冷凍凝固后樣品再放入室溫中融化，樣品反復(fù)凍融處理4次，凍融后樣品用2M/mol鹽酸調(diào)pH至3.5， 10000rpm離心30min收集上清。離心沉淀加入100ml生理鹽水?dāng)嚢柘礈?0min，洗滌結(jié)束后用2M/mol鹽酸調(diào)pH至3.5，10000rpm離心30min收集上清，合并兩次上清液得人胎盤粗提液。

人胎盤粗提超濾液先用10KD膜包進行超濾，超濾溫度控制在0℃-4℃之間，超濾至原體積六分之一（約50ml）后向超濾液中不斷補加冷藏生理鹽酸，每次加入70ml，共加入5次，最后超濾至30-40ml，收集所有濾過液（約600ml），收集的濾過液用1KD膜包進行超濾濃縮，超濾溫度控制在0℃-4℃之間，濃縮至50ml左右得人胎盤粗提濃縮液。

HPLC、RP-HPLC純化及超濾置換：

HPLC安裝TSK G2000SWXL凝膠柱，用流動相PBS平衡柱子，流速控制1.2ml/min，柱平衡好后將人胎盤粗提濃縮液進行HPLC，流速控制1.2ml/min，檢測波長280nm，收集流出峰進行RP-HPLC。

HPLC安裝RP-18柱，用流動相0.1%TFA的水溶液平衡柱子，流速控制1.2ml/min，將收集的HPLC流出峰進行RP-HPLC，流動相調(diào)整為0.1%TFA的水溶液100%-0%及0.1%TFA的乙腈溶液0%-100%，時間30min，流速控制1.2ml/min，檢測波長280nm，收集流出峰，經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳檢測，RP-HPLC純化后的4.7KD多肽純度為94%。

將收集的RP-HPLC流出峰用1KD膜包超濾濃縮，超濾過程中不斷加入樣品等體積的冷藏磷酸鹽緩沖液進行體系置換，共加入6次，最后超濾至30-40ml，得人胎盤4.7KD多肽純化樣品。

實施例2：人胎盤粗提液調(diào)pH離心及超濾濃縮：取健康足月的人胎盤去筋膜后用生理鹽水洗去血污，濾干水分，稱取200g加入400ml冷藏生理鹽水高速勻漿，勻漿溫度控制在0℃～4℃之間，勻漿后樣品放入-70℃冰箱冷凍，冷凍凝固后樣品再放入室溫中融化，樣品反復(fù)凍融處理3次，凍融后樣品用2M/mol鹽酸調(diào)pH至4.0，10000rpm離心30min收集上清。離心沉淀加入200ml生理鹽水?dāng)嚢柘礈?0min，洗滌結(jié)束后用2M/mol鹽酸調(diào)pH至4.0，10000rpm離心30min收集上清，合并兩次上清液得人胎盤粗提液。

人胎盤粗提超濾液先用10KD膜包進行超濾，超濾溫度控制在0℃-4℃之間，超濾至原體積十分之一（約60ml）后向超濾液中不斷補加冷藏生理鹽酸，每次加入100ml，共加入6次，最后超濾至30-40ml，收集所有濾過液（約1100ml），收集的濾過液用1KD膜包進行超濾濃縮，超濾溫度控制在0℃-4℃之間，濃縮至60ml左右得人胎盤粗提濃縮液。

HPLC、RP-HPLC純化及超濾置換：

HPLC安裝TSK G2000SWXL 凝膠柱，用流動相PBS平衡柱子，流速控制1.0ml/min，柱平衡好后將人胎盤粗提濃縮液進行HPLC，流速控制1.0ml/min，檢測波長280nm，收集流出峰進行RP-HPLC。

HPLC安裝RP-18柱，用流動相0.1%TFA的水溶液平衡柱子，流速控制1.0ml/min，將收集的HPLC流出峰進行RP-HPLC，流動相調(diào)整為0.1%TFA的水溶液100%-0%及0.1%TFA的乙腈溶液0%-100%，時間30min，流速控制1.0ml/min，檢測波長280nm，收集流出峰，經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳檢測，RP-HPLC純化后的4.7KD多肽純度為93%。

將收集的RP-HPLC流出峰用1KD膜包超濾濃縮，超濾過程中不斷加入樣品等體積的冷藏磷酸鹽緩沖液進行體系置換，共加入6次，最后超濾至30-40ml，得人胎盤4.7KD多肽純化樣品。