本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種秸稈降解酸化菌劑及其制造方法。

背景技術(shù)：

隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，對環(huán)保的要求和能源的需要越來越高。將廢棄物通過沼氣發(fā)酵進(jìn)一步制備生物天然氣，不僅可以解決廢棄物的污染問題，同時(shí)可以在一定程度上應(yīng)對化石能源短缺的問題。傳統(tǒng)的沼氣發(fā)酵原料如畜禽糞便，有機(jī)廢水等，已經(jīng)不能滿足生物天然氣的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。目前我國每年產(chǎn)生約7億噸秸稈，其產(chǎn)氣潛力巨大。秸稈的主要成分木質(zhì)纖維素是由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素之間通過復(fù)雜的化學(xué)鍵緊密結(jié)合而成，沼氣發(fā)酵的微生物和酶很難接近分解其中的纖維素和半纖維素，致使發(fā)酵效率低下。因此，有效的預(yù)處理—在沼氣發(fā)酵之前將秸稈有效降解酸化，成為秸稈沼氣發(fā)酵的關(guān)鍵。

目前已經(jīng)報(bào)道或申請專利的秸稈預(yù)處理方法有多種，主要為物理、化學(xué)和生物類方法。生物預(yù)處理技術(shù)，由于其低成本、低能耗、環(huán)境友好，不需使用化學(xué)品等優(yōu)勢，近年來引起了研究人員和工程技術(shù)人員的關(guān)注，但仍存在如下一些問題：預(yù)處理過程中，降解的對象(秸稈成分)不明確。秸稈的主要成分為纖維素和半纖維素，木質(zhì)素的含量次之，這三種主要成分形成一種在自然狀態(tài)下難以被微生物分解的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)。目前在文獻(xiàn)和專利中已報(bào)道的預(yù)處理菌劑主要是針對其中的木質(zhì)素，優(yōu)先降解木質(zhì)素達(dá)到破壞木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的目的。然而木質(zhì)素最難降解，導(dǎo)致總的降解速率較慢，預(yù)處理效果不佳。

目前大多數(shù)用于秸稈沼氣發(fā)酵的預(yù)處理菌劑為好氧真菌復(fù)合制劑。真菌是通過降解木質(zhì)纖維素類原料中的木質(zhì)素，而達(dá)到破壞原料結(jié)構(gòu)，最終達(dá)到提高厭氧發(fā)酵的目的。真菌預(yù)處理中，最大的弊端在于預(yù)處理所需的時(shí)間較長(3周以上)，必須在好氧條件下繁殖，培養(yǎng)條件較為苛刻。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種降解秸稈的復(fù)合菌劑。

本發(fā)明提供的復(fù)合菌劑，其為1)或2)：

1)所述復(fù)合菌劑的活性成分為產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)、產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)；

2)所述復(fù)合菌劑的活性成分為產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)發(fā)酵液、產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)發(fā)酵液、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)發(fā)酵液、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)發(fā)酵液。

上述菌劑中各菌或所述菌劑中各發(fā)酵液中各菌配比如下：

所述產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)、所述產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)、所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和所述蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)的菌落形成單位比為3:3:2:2。

所述復(fù)合菌劑由所述產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)發(fā)酵液、所述產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)發(fā)酵液、所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)發(fā)酵液、所述蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)發(fā)酵液和載體組成；

所述產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)ACCC No.11055、所述產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)ACCC No.00522、所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC No.11089、所述蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ACCC No.01955和所述吸附載體的配比為30CFU:30CFU:20CFU:20CFU：1×10^-4－1×10^-3g；

或所述產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)ACCC No.11055、所述產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)ACCC No.00522、所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC No.11089、所述蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ACCC No.01955和所述吸附載體的配比為30CFU:30CFU:20CFU:20CFU：5×10^-4g；

或各個(gè)所述發(fā)酵液中的活菌數(shù)均大于等于10⁹個(gè)/mL。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種制備上述菌劑的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)發(fā)酵液、產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)發(fā)酵液、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)發(fā)酵液和蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)發(fā)酵液混勻，得到混合菌液，即得到菌劑。

上述方法中，所述產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)發(fā)酵液、所述產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)發(fā)酵液、所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)發(fā)酵液和所述蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)發(fā)酵液中的各菌菌落形成單位比為3:3:2:2。

上述方法還包括如下步驟：將所述混合菌液和吸附載體混勻，得到菌劑。

或，所述菌劑中，所述產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)ACCC No.11055、所述產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)ACCC No.00522、所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC No.11089、所述蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ACCC No.01955和所述吸附載體的配比為30CFU:30CFU:20CFU:20CFU：1×10^-4－1×10^-3g；

或，所述菌劑中，所述產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)ACCC No.11055、所述產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)ACCC No.00522、所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC No.11089、所述蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ACCC No.01955和所述吸附載體的配比為30CFU:30CFU:20CFU:20CFU：5×10^-4g。

所述產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)ACCC No.11055在菌劑中的濃度為60000cfu/g；

所述產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)ACCC No.00522在菌劑中的濃度為60000cfu/g；

所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC No.11089在菌劑中的濃度為40000cfu/g；

所述蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ACCC No.01955在菌劑中的濃度為40000cfu/g；

上述方法中，所述混合菌液的菌體和所述吸附載體的配比為1CFU：1×10^-6－1×10^-5g，具體為1CFU：5×10^-6g。

上述方法中，所述吸附載體由麥飯石和秸稈粉組成；吸附載體按照如下方法制備：將40目麥飯石和40目秸稈粉按照質(zhì)量比為2：8混勻得到。

和/或，所述麥飯石和秸稈粉的質(zhì)量比具體為2:8。

和/或，所述發(fā)酵液中的活菌數(shù)均大于等于10⁹個(gè)/mL。

上述菌劑在降解纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或，上述菌劑在降解秸稈中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

或，上述菌劑在秸稈酸化處理中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種降解纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：用上述菌劑發(fā)酵秸稈或含有秸稈的原料，實(shí)現(xiàn)降解秸稈中的纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的秸稈降解酸化菌劑，是一種由細(xì)菌復(fù)合而成的兼性厭氧分解菌劑。細(xì)菌主要針對纖維素和半纖維素分解，在較短的時(shí)間(1-3天之內(nèi))即可有效破壞木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，并可以將纖維素和半纖維素分解成沼氣發(fā)酵可以直接利用的小分子物質(zhì)，大大加快整體的產(chǎn)氣速率。另外，其菌種組成既有好氧菌，也有厭氧菌。酸化池的液面上部一般為好氧和微好氧環(huán)境，而在酸化池底物為厭氧環(huán)境。一般的好氧菌劑需進(jìn)行大量的曝氣才能維持好氧環(huán)境，而本發(fā)明提供的菌劑可在多種酸化環(huán)境中發(fā)揮作用。

總之本發(fā)明構(gòu)建的秸稈降解酸化菌劑具有如下的特點(diǎn)和優(yōu)勢：

①纖維素酶活和木聚糖酶活高，可在預(yù)處理過程中快速分解纖維素和半纖維素，從而快速破壞堅(jiān)硬的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)。

②本發(fā)明的菌劑為兼性厭氧細(xì)菌復(fù)合系：在沒有曝氣的條件下，可在酸化反應(yīng)器或酸化反應(yīng)池的各個(gè)部位，有效的分解秸稈中的纖維素和半纖維素成分。

本發(fā)明菌劑突破由真菌及其分解酶無法快速高效分解天然纖維素的局限，為秸稈沼氣發(fā)酵提供關(guān)鍵預(yù)處理技術(shù)，在秸稈等木質(zhì)纖維素原料制備生物天然氣領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

秸稈降解酸化菌系由產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)保藏號ACCC No.11055、產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)保藏號ACCC No.00522、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)保藏號ACCC No.11089、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)保藏號ACCC No.01955組成。

其中的產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)為好氧細(xì)菌，具有較強(qiáng)的纖維素分解能力，該菌種保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)，保藏號為DSM No.11055；產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)為厭氧細(xì)菌，可利用纖維素產(chǎn)生乙酸、乙醇、氫氣和二氧化碳，該菌種保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)，保藏號為ACCC No.00522；枯草芽孢桿菌(Pseudomonas sp.)為好氧細(xì)菌，可分解秸稈中的半纖維素，該菌種保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)，保藏號為ACCC No.11089；蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)為好氧細(xì)菌，可分解利用秸稈中的纖維素成分，該菌種保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)，保藏號為ACCC No.01955。

實(shí)施例1、秸稈降解酸化菌劑的制備

(一)菌種的活化

將產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)ACCC No.11055接種于蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCS)改良培養(yǎng)基中，在室溫(30℃)條件下靜止培養(yǎng)1d，收集所有的發(fā)酵液；

將產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)ACCC No.00522接種于蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCS)改良培養(yǎng)基中，在室溫(30℃)條件下靜止培養(yǎng)1d，收集所有的發(fā)酵液；

將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC No.11089接種于蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCS)改良培養(yǎng)基中，在室溫(30℃)條件下靜止培養(yǎng)1d，收集所有的發(fā)酵液；

將蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ACCC No.01955接種于蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCS)改良培養(yǎng)基中，在室溫(30℃)條件下靜止培養(yǎng)1d，收集所有的發(fā)酵液；

培養(yǎng)中所用的蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCS)改良培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨5g、酵母提取物1g、NaCl 5g、K₂HPO₄ 1g、MgSO₄ 7H₂O 0.35g、CaCO₃ 3g，溶解在1L水中。

(二)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)

將步驟(一)中經(jīng)活化的菌種發(fā)酵液分別接種于蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCS)改良培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為30℃的發(fā)酵罐中靜止逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大過程按5％的比例轉(zhuǎn)接，當(dāng)發(fā)酵液中的有效活菌數(shù)達(dá)到10⁹個(gè)/mL時(shí)終止培養(yǎng)，得到產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)ACCC No.11055發(fā)酵液、產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)ACCC No.00522發(fā)酵液、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC No.11089發(fā)酵液和蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ACCC No.01955發(fā)酵液。

(三)復(fù)合菌系的制備

將步驟(二)得到的產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)ACCC No.11055發(fā)酵液、產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)ACCC No.00522發(fā)酵液、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC No.11089發(fā)酵液和蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ACCC No.01955發(fā)酵液按產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)ACCC No.11055、產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)ACCC No.00522、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC No.11089、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ACCC No.01955的集落形成單位數(shù)目cfu比例為＝30:30:20:20混合配制即得秸稈降解酸化菌系。

(四)秸稈降解酸化菌劑的制備

吸附載體制備：將40目麥飯石和40目秸稈粉按照質(zhì)量比為2：8混勻得到吸附載體；

向上述步驟(三)得到的秸稈降解酸化菌系中添加吸附載體，得到秸稈降解酸化菌劑；

上述秸稈降解酸化菌劑中，產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)ACCC No.11055、產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)ACCC No.00522、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC No.11089、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ACCC No.01955和吸附載體的配比為30CFU:30CFU:20CFU:20CFU：5×10^-4g；

上述秸稈降解酸化菌劑中，產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)ACCC No.11055的菌含量為60000cfu/g；

產(chǎn)纖維二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)ACCC No.00522的菌含量為60000cfu/g；

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC No.11089的菌含量為40000cfu/g；

蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ACCC No.01955的菌含量為40000cfu/g。

實(shí)施例2、秸稈降解酸化菌劑應(yīng)用于玉米秸稈厭氧發(fā)酵的酸化預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：北京市海淀區(qū)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站；

實(shí)驗(yàn)材料：玉米秸稈，實(shí)施例1制備的秸稈降解酸化菌劑；

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：設(shè)置兩個(gè)酸化池，每個(gè)酸化池體積為1立方米，每個(gè)酸化池連續(xù)運(yùn)行十個(gè)水力停留時(shí)間，同時(shí)保證其他實(shí)驗(yàn)條件相同。

處理1：不加實(shí)施例1制備的秸稈降解酸化菌劑。

處理2：使用實(shí)施例1制備的秸稈降解酸化菌劑。

實(shí)施方法：將玉米秸稈粉碎為1-2cm，按每立方米酸化池體積接種實(shí)施例1制備的秸稈降解酸化菌劑30公斤(菌劑添加量為酸化池體積的3％)，其余體積由自來水補(bǔ)充，水力停留時(shí)間為3天，連續(xù)運(yùn)行30天。每天進(jìn)料玉米秸稈60Kg(以干重計(jì))。

檢測每天的纖維素、半纖維素和揮發(fā)性有機(jī)酸的含量，并計(jì)算降解率。纖維素、半纖維素和揮發(fā)性有機(jī)酸的檢測方法依據(jù)文獻(xiàn)：《近紅外光譜法測定玉米秸稈纖維素和半纖維素含量》劉會(huì)影，李國立，薛冬樺，徐洪章，葉小全，中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013,29(35)：182-186，纖維素降解率＝已分解纖維素量/總纖維素量，半纖維素降解率＝已分解半纖維素量/總半纖維素量。

結(jié)果如下：連續(xù)運(yùn)行15天后，使用菌劑的處理，經(jīng)過3天的預(yù)處理，玉米秸稈的纖維素降解率達(dá)到12.1％，半纖維素的降解率為16.7％，揮發(fā)性有機(jī)酸的含量達(dá)到16500mg/L；未使用菌劑的玉米秸稈纖維素降解率為6.6％，半纖維素的降解率為12.0％，揮發(fā)性有機(jī)酸的含量達(dá)到10400mg/L。

實(shí)施例3、秸稈降解酸化菌劑應(yīng)用于玉米秸稈和豬糞厭氧發(fā)酵的共酸化預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：北京市海淀區(qū)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站；

實(shí)驗(yàn)材料：玉米秸稈，豬糞，實(shí)施例1制備的秸稈降解酸化菌劑；

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：設(shè)置兩個(gè)酸化池，每個(gè)酸化池體積為1立方米，每個(gè)酸化池連續(xù)運(yùn)行十個(gè)水力停留時(shí)間，同時(shí)保證其他實(shí)驗(yàn)條件相同。

處理1：不加實(shí)施例1制備的秸稈降解酸化菌劑。

處理2：使用實(shí)施例1制備的秸稈降解酸化菌劑。

實(shí)施方法：按每立方米酸化池體積接種實(shí)施例1制備的秸稈降解酸化菌劑30公斤(菌劑添加量為酸化池體積的3％)，其余體積由自來水補(bǔ)充，水力停留時(shí)間為3天，連續(xù)運(yùn)行30天。將玉米秸稈粉碎為1-2cm，每天進(jìn)料玉米秸稈40Kg(以干重計(jì))，豬糞20Kg(以干重計(jì))；。

檢測每天的纖維素、半纖維素和揮發(fā)性有機(jī)酸的含量，并計(jì)算降解率；纖維素降解率＝已分解纖維素量/總纖維素量，半纖維素降解率＝已分解半纖維素量/總半纖維素量

結(jié)果如下：連續(xù)運(yùn)行15天后，使用菌劑的處理，經(jīng)過3天的預(yù)處理，玉米秸稈的纖維素降解率達(dá)到14.3％，半纖維素的降解率為20.1％，揮發(fā)性有機(jī)酸的含量達(dá)到18700mg/L；未使用菌劑的玉米秸稈纖維素降解率為8.7％，半纖維素的降解率為14.0％，揮發(fā)性有機(jī)酸的含量達(dá)到12600mg/L。

實(shí)施例4：秸稈降解酸化菌劑應(yīng)用于水稻秸稈厭氧發(fā)酵的酸化預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：涿州市中國農(nóng)業(yè)大學(xué)科技園產(chǎn)業(yè)沼氣工程平臺；

實(shí)驗(yàn)材料：水稻，實(shí)施例1制備的秸稈降解酸化菌劑；

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：設(shè)置兩個(gè)酸化池，每個(gè)酸化池體積為60立方米，每個(gè)酸化池連續(xù)運(yùn)行十個(gè)水力停留時(shí)間，同時(shí)保證其他實(shí)驗(yàn)條件相同。

處理1：不加實(shí)施例1制備的秸稈降解酸化菌劑。

處理2：使用實(shí)施例1制備的秸稈降解酸化菌劑。

實(shí)施方法：每個(gè)酸化池接種實(shí)施例1制備的秸稈降解酸化菌劑500公斤，其余體積由自來水補(bǔ)充，水力停留時(shí)間為3天，連續(xù)運(yùn)行30天。將水稻秸稈粉碎為1-2cm，每天進(jìn)料水稻秸稈3600Kg(以干重計(jì))。

檢測每天的纖維素、半纖維素和揮發(fā)性有機(jī)酸的含量，并計(jì)算降解率；纖維素降解率＝已分解纖維素量/總纖維素量，半纖維素降解率＝已分解半纖維素量/總半纖維素量。

結(jié)果如下：連續(xù)運(yùn)行20天后，使用菌劑的處理，經(jīng)過3天的預(yù)處理，水稻秸稈的纖維素降解率達(dá)到14.7％，半纖維素的降解率為19.6％，揮發(fā)性有機(jī)酸的含量達(dá)到16700mg/L；未使用菌劑的水稻秸稈纖維素降解率為7.6％，半纖維素的降解率為13.4％，揮發(fā)性有機(jī)酸的含量達(dá)到11200mg/L。