本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及尼日利亞菌素的純化方法。

背景技術(shù)：

尼日利亞菌素是一個多環(huán)醚羧酸(polycyclic ether carboxylic acid)化合物，尼日利亞菌素的分子式為C₄₀H₆₈O₁₁，相對分子質(zhì)量為742。其作用主要是進(jìn)行氫離子和鉀離子的交換。類似頡氨酶素與鉀離子形成復(fù)合體一樣，它的帶負(fù)電荷的羧化物與陽離子相互作用形成尼日利亞菌素-鉀離子復(fù)合體，進(jìn)行氫離子-鉀離子交換。

申請?zhí)?01310486479.X公布了一種尼日利亞菌素的純化方法，具體方法是將發(fā)酵液離心，收集上清液；用乙酸乙酯萃取上清液，減壓濃縮，干燥得乙酸乙酯萃取物，再溶于乙酸乙酯，再加入到硅膠柱中進(jìn)行洗脫，收集洗脫液進(jìn)行薄層層析分析，合并洗脫液，真空蒸干，產(chǎn)物進(jìn)行抑藻活性的測定，獲得可抑藻的活性組分，然后高效液相色譜洗脫，收集洗脫液，獲得尼日利亞菌素。

該純化方法操作繁雜，且用了高效液相色譜洗脫，價格昂貴，不利于工業(yè)生產(chǎn)。因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種生產(chǎn)成本低廉、操作簡單且適合于工業(yè)化生產(chǎn)的尼日利亞菌素的純化方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種生產(chǎn)成本低廉、操作簡單且適合于工業(yè)化生產(chǎn)的尼日利亞菌素的純化方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種尼日利亞菌素的純化方法，包括以下步驟：

1)胞內(nèi)含尼日利亞菌素的鏈霉菌發(fā)酵液進(jìn)行固液分離過濾，得到菌絲體；

2)菌絲體用酒精浸泡提取，得到浸提液，減壓濃縮浸提液至無酒精為止，得到濃縮后的浸提液，用乙酸丁酯或乙酸乙酯萃取濃縮后的浸提液，取上相萃取液并濃縮至干，得到稠狀濃縮物；

3)用甲醇或者乙醇溶液溶解步驟2)中的稠狀濃縮物，過濾后得濾液；

4)用非極性烷烴溶劑與水共同萃取步驟3)中的濾液，取下相液，濃縮下相液中的烷烴層至干，得尼日利亞菌素粗品；

加入水的目的是提高溶液極性差，有利于水相油相分層，提高萃取效果。加入非極性烷烴溶劑的作用是去除油性雜質(zhì)，提高產(chǎn)品純度。

5)用乙醇溶液溶解步驟4)中的尼日利亞粗品，得到尼日利亞粗品醇溶液；

乙醇和烷烴層混溶的程度比甲醇大，本步驟使用乙醇。

6)用非極性烷烴溶劑與水共同萃取步驟5)中的中尼日利亞粗品醇溶液，取上相液，蒸發(fā)濃縮上相液的烷烴，析出白色固體；

加入水的目的是提高溶液極性差，有利于水相油相分層，提高萃取效果。加入非極性烷烴溶劑的作用是增加混合溶劑的非極性溶解力，從而提高產(chǎn)品純度。

7)抽濾步驟6)中白色固體，并用非極性烷烴浸潤洗滌該白色固體；

8)烘干步驟7)中白色固體，即得到含有尼日利亞菌素固體。

優(yōu)選地，所述尼日利亞菌素的純化方法，步驟2)中酒精與菌絲體重量比為8:1至10:1。

優(yōu)選地，所述尼日利亞菌素的純化方法，步驟2)中濃縮后的浸提液與每次萃取用的乙酸丁酯或乙酸乙酯的體積比為1:1；用乙酸丁酯或乙酸乙酯萃取濃縮后的浸提液2次，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并濃縮至干，得到稠狀濃縮物。

浸泡時間分兩次提取，第一次浸泡2小時，浸泡過程中每隔半個小時攪拌一次，第一次浸泡后固液分離獲得一次酒精浸泡液；然后進(jìn)行第二次浸泡，合并兩次浸提液。

優(yōu)選地，所述尼日利亞菌素的純化方法，步驟3)中甲醇或者乙醇與步驟2)中的稠狀濃縮物的重量比為2:1至5:1。

優(yōu)選地，所述尼日利亞菌素的純化方法，步驟3)用甲醇或者乙醇溶液溶解步驟2)中的稠狀濃縮物后過濾前，還包括用活性炭進(jìn)行脫色處理，活性炭與步驟2)中的稠狀濃縮物的重量比為2:100。

優(yōu)選地，所述尼日利亞菌素的純化方法，非極性烷烴溶劑為正己烷、環(huán)己烷的一種或者多種。

優(yōu)選地，所述尼日利亞菌素的純化方法，步驟4)中每次萃取用的非極性烷烴溶劑與步驟3)中的濾液體積比1:1，水與步驟3)中的濾液體積比0.01:1至0.1:1；萃取次數(shù)為3次。

優(yōu)選地，所述尼日利亞菌素的純化方法，步驟5)中乙醇與步驟4)中尼日利亞菌素粗品重量比為3:1至10:1。

優(yōu)選地，所述尼日利亞菌素的純化方法，步驟6)中非極性烷烴溶劑與步驟5)中尼日利亞粗品醇溶液體積比為1:1至3:1，水與步驟5)中尼日利亞粗品醇溶液體積比0.01:1至0.1:1。

優(yōu)選地，所述尼日利亞菌素的純化方法，步驟8)中烘干溫度為45℃-50℃，烘干時間為3至5小時。

附圖說明

圖1為尼日利亞菌素的結(jié)構(gòu)式。

圖2為經(jīng)過本發(fā)明純化方法后尼日利亞菌素HPLC的色譜圖。

具體實施方式

為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合具體實施方式并配合附圖詳予說明。

圖1為尼日利亞菌素的結(jié)構(gòu)式。

分子式：C₄₀H₆₈O₁₁，相對分子質(zhì)量為：724.9g/mol。

實施例1

本實施例的具體工藝方法如下：

1)將胞內(nèi)含尼日利亞菌素的鏈霉菌發(fā)酵液進(jìn)行固液分離過濾，得到菌絲體；

2)菌絲體用酒精浸泡提取，酒精與菌絲體重量比為8:1，得到浸提液，減壓濃縮浸提液至無酒精為止，得到濃縮后的浸提液，用乙酸丁酯萃取濃縮后的浸提液2次，其中濃縮后的浸提液與每次萃取用的乙酸丁酯的體積比為1:1，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并濃縮至干，得到稠狀濃縮物；

3)用乙醇溶液溶解步驟2)中的稠狀濃縮物，其中乙醇與步驟2)中的稠狀濃縮物的重量比為5:1，過濾后得濾液；在用乙醇溶液溶解步驟2)中的稠狀濃縮物后過濾前，還可以用活性炭進(jìn)行脫色處理，活性炭與步驟2)中的稠狀濃縮物的重量比為2:100；

4)用非極性烷烴溶劑正己烷與水共同萃取步驟3)中的濾液，其中每次萃取用的非極性烷烴溶劑正己烷與步驟3)中的濾液體積比1:1，水與步驟3)中的濾液體積比0.01:1，萃取次數(shù)為3次；每次都取下相液，合并下相萃取液并濃縮下相層至干，得尼日利亞菌素粗品；

5)用乙醇溶液溶解步驟4)中的尼日利亞粗品，其中乙醇與步驟4)中尼日利亞菌素粗品重量比為10:1，得到尼日利亞粗品醇溶液；

6)用非極性烷烴溶劑正己烷與水共同萃取步驟5)中的中尼日利亞粗品醇溶液，其中非極性烷烴溶劑正己烷與步驟5)中尼日利亞粗品醇溶液體積比為1:1，水與步驟5)中尼日利亞粗品醇溶液體積比0.01:1，取上相液，蒸發(fā)濃縮上相液的烷烴，析出白色固體；

7)抽濾步驟6)中白色固體，并用正己烷浸潤洗滌該白色固體；

8)烘干步驟7)中白色固體，其中烘干溫度為50℃，烘干時間為3小時，即得到含有尼日利亞菌素固體。

實施例2

本實施例的具體工藝方法如下：

1)將胞內(nèi)含尼日利亞菌素的鏈霉菌發(fā)酵液進(jìn)行固液分離過濾，得到菌絲體；

2)菌絲體用酒精浸泡提取，酒精與菌絲體重量比為10:1，得到浸提液，減壓濃縮浸提液至無酒精為止，得到濃縮后的浸提液，用乙酸乙酯萃取濃縮后的浸提液2次，其中濃縮后的浸提液與每次萃取用的乙酸乙酯的體積比為1:1，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并濃縮至干，得到稠狀濃縮物；

3)用甲醇溶液溶解步驟2)中的稠狀濃縮物，其中甲醇與步驟2)中的稠狀濃縮物的重量比為2:1，過濾后得濾液；在用甲醇溶液溶解步驟2)中的稠狀濃縮物后過濾前，還可以用活性炭進(jìn)行脫色處理，活性炭與步驟2)中的稠狀濃縮物的重量比為2:100；

4)用非極性烷烴溶劑環(huán)己烷與水共同萃取步驟3)中的濾液，其中每次萃取用的非極性烷烴溶劑環(huán)己烷與步驟3)中的濾液體積比1:1，水與步驟3)中的濾液體積比0.1:1，萃取次數(shù)為3次；每次都取下相液，合并下相萃取液并濃縮下相層至干，得尼日利亞菌素粗品；

5)用乙醇溶液溶解步驟4)中的尼日利亞粗品，其中乙醇與步驟4)中尼日利亞菌素粗品重量比為3:1，得到尼日利亞粗品醇溶液；

6)用非極性烷烴溶劑環(huán)己烷與水共同萃取步驟5)中的中尼日利亞粗品醇溶液，其中非極性烷烴溶劑環(huán)己烷與步驟5)中尼日利亞粗品醇溶液體積比為3:1，水與步驟5)中尼日利亞粗品醇溶液體積比0.1:1，取上相液，蒸發(fā)濃縮上相液的烷烴，析出白色固體；

7)抽濾步驟6)中白色固體，并用正己烷浸潤洗滌該白色固體；

8)烘干步驟7)中白色固體，其中烘干溫度為45℃，烘干時間為5小時，即得到含有尼日利亞菌素固體。

實施例3

本實施例的具體工藝方法如下：

1)將胞內(nèi)含尼日利亞菌素的鏈霉菌發(fā)酵液進(jìn)行固液分離過濾，得到菌絲體；

2)菌絲體用酒精浸泡提取，酒精與菌絲體重量比為9:1，得到浸提液，減壓濃縮浸提液至無酒精為止，得到濃縮后的浸提液，用乙酸丁酯萃取濃縮后的浸提液2次，其中濃縮后的浸提液與每次萃取用的乙酸丁酯的體積比為1:1，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并濃縮至干，得到稠狀濃縮物；

3)用乙醇溶液溶解步驟2)中的稠狀濃縮物，其中乙醇與步驟2)中的稠狀濃縮物的重量比為4:1，過濾后得濾液；在用乙醇溶液溶解步驟2)中的稠狀濃縮物后過濾前，還可以用活性炭進(jìn)行脫色處理，活性炭與步驟2)中的稠狀濃縮物的重量比為2:100；

4)用非極性烷烴溶劑為體積比為1:1的正己烷和環(huán)己烷的混合物與水共同萃取步驟3)中的濾液，其中每次萃取用的非極性烷烴溶劑為體積比為1:1的正己烷和環(huán)己烷的混合物與步驟3)中的濾液體積比1:1，水與步驟3)中的濾液體積比0.03:1，萃取次數(shù)為3次；每次都取下相液，合并下相萃取液并濃縮下相層至干，得尼日利亞菌素粗品；

5)用乙醇溶液溶解步驟4)中的尼日利亞粗品，其中乙醇與步驟4)中尼日利亞菌素粗品重量比為8:1，得到尼日利亞粗品醇溶液；

6)用非極性烷烴溶劑為體積比為1:1的正己烷和環(huán)己烷的混合物與水共同萃取步驟5)中的中尼日利亞粗品醇溶液，其中非極性烷烴溶劑為體積比為1:1的正己烷和環(huán)己烷的混合物與步驟5)中尼日利亞粗品醇溶液體積比為1.5:1，水與步驟5)中尼日利亞粗品醇溶液體積比0.03:1，取上相液，蒸發(fā)濃縮上相液的烷烴，析出白色固體；

7)抽濾步驟6)中白色固體，并用正己烷浸潤洗滌該白色固體；

8)烘干步驟7)中白色固體，其中烘干溫度為48℃，烘干時間為3.5小時，即得到含有尼日利亞菌素固體。

實施例4

本實施例的具體工藝方法如下：

1)將胞內(nèi)含尼日利亞菌素的鏈霉菌發(fā)酵液進(jìn)行固液分離過濾，得到菌絲體；

2)菌絲體用酒精浸泡提取，酒精與菌絲體重量比為8.5:1，得到浸提液，減壓濃縮浸提液至無酒精為止，得到濃縮后的浸提液，用乙酸乙酯萃取濃縮后的浸提液2次，其中濃縮后的浸提液與每次萃取用的乙酸乙酯的體積比為1:1，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并濃縮至干，得到稠狀濃縮物；

3)用甲醇溶液溶解步驟2)中的稠狀濃縮物，其中甲醇與步驟2)中的稠狀濃縮物的重量比為3:1，過濾后得濾液；在用甲醇溶液溶解步驟2)中的稠狀濃縮物后過濾前，還可以用活性炭進(jìn)行脫色處理，活性炭與步驟2)中的稠狀濃縮物的重量比為2:100；

4)用非極性烷烴溶劑正己烷與水共同萃取步驟3)中的濾液，其中每次萃取用的非極性烷烴溶劑正己烷與步驟3)中的濾液體積比1:1，水與步驟3)中的濾液體積比0.08:1，萃取次數(shù)為3次；每次都取下相液，合并下相萃取液并濃縮下相層至干，得尼日利亞菌素粗品；

5)用乙醇溶液溶解步驟4)中的尼日利亞粗品，其中乙醇與步驟4)中尼日利亞菌素粗品重量比為5:1，得到尼日利亞粗品醇溶液；

6)用非極性烷烴溶劑正己烷與水共同萃取步驟5)中的中尼日利亞粗品醇溶液，其中非極性烷烴溶劑正己烷與步驟5)中尼日利亞粗品醇溶液體積比為2.5:1，水與步驟5)中尼日利亞粗品醇溶液體積比0.08:1，取上相液，蒸發(fā)濃縮上相液的烷烴，析出白色固體；

7)抽濾步驟6)中白色固體，并用正己烷浸潤洗滌該白色固體；

8)烘干步驟7)中白色固體，其中烘干溫度為46℃，烘干時間為4.5小時，即得到含有尼日利亞菌素固體。

實施例5

本實施例的具體工藝方法如下：

1)將胞內(nèi)含尼日利亞菌素的鏈霉菌發(fā)酵液進(jìn)行固液分離過濾，得到菌絲體；

2)菌絲體用酒精浸泡提取，酒精與菌絲體重量比為9.5:1，得到浸提液，減壓濃縮浸提液至無酒精為止，得到濃縮后的浸提液，用乙酸丁酯萃取濃縮后的浸提液2次，其中濃縮后的浸提液與每次萃取用的乙酸丁酯的體積比為1:1，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并濃縮至干，得到稠狀濃縮物；

3)用乙醇溶液溶解步驟2)中的稠狀濃縮物，其中乙醇與步驟2)中的稠狀濃縮物的重量比為3.5:1，過濾后得濾液；在用乙醇溶液溶解步驟2)中的稠狀濃縮物后過濾前，還可以用活性炭進(jìn)行脫色處理，活性炭與步驟2)中的稠狀濃縮物的重量比為2:100；

4)用非極性烷烴溶劑環(huán)己烷與水共同萃取步驟3)中的濾液，其中每次萃取用的非極性烷烴溶劑環(huán)己烷與步驟3)中的濾液體積比1:1，水與步驟3)中的濾液體積比0.05:1，萃取次數(shù)為3次；每次都取下相液，合并下相萃取液并濃縮下相層至干，得尼日利亞菌素粗品；

5)用乙醇溶液溶解步驟4)中的尼日利亞粗品，其中乙醇與步驟4)中尼日利亞菌素粗品重量比為6.5:1，得到尼日利亞粗品醇溶液；

6)用非極性烷烴溶劑環(huán)己烷與水共同萃取步驟5)中的中尼日利亞粗品醇溶液，其中非極性烷烴溶劑環(huán)己烷與步驟5)中尼日利亞粗品醇溶液體積比為2:1，水與步驟5)中尼日利亞粗品醇溶液體積比0.05:1，取上相液，蒸發(fā)濃縮上相液的烷烴，析出白色固體；

7)抽濾步驟6)中白色固體，并用正己烷浸潤洗滌該白色固體；

8)烘干步驟7)中白色固體，其中烘干溫度為47℃，烘干時間為4小時，即得到含有尼日利亞菌素固體。

純度檢測方法：高效液相色譜柱后衍生測定，色譜柱Kromasil ODS C18，5μm，250mm*4.6mm；以V(甲醇)：V(乙酸)：V(水)＝94:3:3為流動相，香草醛為衍生劑進(jìn)行高效液相色譜柱后衍生分析，檢測波長520nm；流動相流速0.8mL/min；衍生液流速0.4mL/min；反應(yīng)溫度95℃；柱溫30℃；外標(biāo)法定量。衍生液配置：量取5mL H2SO4，緩慢加入到250mL甲醇中，置冰水浴中緩慢加入20g香草醛，混勻，脫氣5min后避光保存，臨用現(xiàn)配。

在上面測定參數(shù)下，用本方法純化前后，測得實施例5得到的尼日利亞菌素HPLC的色譜圖，見圖2。

通過圖2，可以看出尼日利亞菌素峰面積較大，尼日利亞菌素純度可以達(dá)到95％，若按本技術(shù)方案進(jìn)行重結(jié)晶，產(chǎn)品純度可以繼續(xù)提高。

以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。