本發(fā)明涉及表位肽技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種特異性腫瘤抗原survivin的CTL識(shí)別表位肽及其應(yīng)用，還涉及一種腫瘤抗原survivin特異性DC細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用，以及一種腫瘤抗原survivin特異性DC-CIK細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

Survivin屬于細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apotosis family of protein,IAPs)成員之一，可以通過促進(jìn)有絲分裂刺激細(xì)胞增生，抑制細(xì)胞凋亡。在成人中除子宮內(nèi)膜組織、胎盤和胸腺組織中存在較低的表達(dá)，其他組織均檢測(cè)不到survivin的表達(dá)。研究表明，在全基因組轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析中，發(fā)現(xiàn)survivin是腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)最為普遍的基因，在乳腺癌、胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌、黑色素瘤等中均有表達(dá)。

近年來隨著社會(huì)的發(fā)展和人們生活質(zhì)量的提高，胃癌的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)，并且男性多于女性，成為第二大癌癥死因，盡管治療方法已經(jīng)取得較大的進(jìn)步，但是經(jīng)常規(guī)治療手段如手術(shù)、化療、放療等的患者的預(yù)后和生存率仍然不佳。

近20年來，腫瘤免疫學(xué)和分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展為腫瘤的治療提供了新的有效的治療策略和手段，尤其在改善患者預(yù)后和生存率方面有較大的改善，其中免疫細(xì)胞治療尤為突出。CTL細(xì)胞是一種同時(shí)具有T淋巴細(xì)胞抗腫瘤活性的細(xì)胞群，具有體外高度擴(kuò)增，殺瘤活性高，特異性強(qiáng)，對(duì)正常組織毒性低的特點(diǎn)。DC細(xì)胞通過將抗原合適的CTL表位遞呈給T細(xì)胞，能夠激活適應(yīng)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，特異性CTL細(xì)胞回輸給患者可以對(duì)腫瘤進(jìn)行免疫治療。然而，選擇活性較好的survivin抗原CTL表位，并且能夠在體外刺激產(chǎn)生應(yīng)答活性較好的CTL細(xì)胞的多肽仍需進(jìn)一步研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明目的在于提供一種特異性腫瘤抗原survivin的CTL識(shí)別表位肽。

本發(fā)明目的還在于提供上述特異性腫瘤抗原survivin的CTL識(shí)別表位肽的應(yīng)用。

本發(fā)明目的還在于提供一種腫瘤抗原survivin特異性DC細(xì)胞的制備方法。

本發(fā)明目的還在于提供一種腫瘤抗原survivin特異性DC-CIK細(xì)胞的制備方法。

本發(fā)明目的還在于提供上述腫瘤抗原survivin特異性DC細(xì)胞和DC-CIK細(xì)胞的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提出的一種特異性腫瘤抗原survivin的CTL識(shí)別表位肽，所述CTL識(shí)別表位肽為十五肽，其氨基酸序列如下：

Gly-Gly-Arg-Gly-Gly-Arg-Ile-Thr-Arg-Glu-Glu-His-Lys-Lys-His，分子量為1717.93。

上述特異性腫瘤抗原survivin的CTL識(shí)別表位肽采用固相合成法進(jìn)行合成?；玖鞒倘缦拢菏紫葘⒁粋€(gè)氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹脂上，然后脫掉氨基的保護(hù)基，第一個(gè)氨基酸即連接至固相載體上；其次將第二個(gè)氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸的羧基縮合劑活化，活化后的第二個(gè)氨基酸羧基再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，此時(shí)在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽。重復(fù)上述的肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長，直至達(dá)到所需要的肽鏈長度，最后切割得到目的肽，再經(jīng)HPLC純化，其純度大于90％。

本發(fā)明還提出的上述特異性腫瘤抗原survivin的CTL識(shí)別表位肽在制備具有survivin表達(dá)的腫瘤治療性多肽疫苗的應(yīng)用。

優(yōu)選地，上述特異性腫瘤抗原survivin的CTL識(shí)別表位肽在制備胃癌治療性多肽疫苗中的應(yīng)用，尤其對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901具有殺傷力。

本發(fā)明還提出的一種腫瘤抗原survivin特異性DC細(xì)胞的制備方法，采用上述特異性腫瘤抗原survivin的CTL識(shí)別表位肽加入DC細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)得到。

本發(fā)明還提出的上述腫瘤抗原survivin特異性DC細(xì)胞的制備方法得到的特異性DC細(xì)胞在制備治療胃癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提出的一種腫瘤抗原survivin特異性DC-CIK細(xì)胞的制備方法，采用上述特異性腫瘤抗原survivin的CTL識(shí)別表位肽進(jìn)行誘導(dǎo)得到。

本發(fā)明還提出的上述腫瘤抗原survivin特異性DC-CIK細(xì)胞的制備方法得到的特異性DC-CIK細(xì)胞在制備治療胃癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明巧妙利用survivin在多種常見腫瘤如胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、肝癌等均存在生存素(survivin)異常表達(dá)，但在正常成人組織不表達(dá)或呈低表達(dá)，從而采用理論和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法篩選得到腫瘤相關(guān)抗原的表位肽，所得表位肽未見文獻(xiàn)報(bào)道，為研制基于抗原survivin的腫瘤疫苗或腫瘤特異性CTL細(xì)胞的制備提供理論基礎(chǔ)，并為后續(xù)多價(jià)的抗原肽疫苗構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提出的一種特異性腫瘤抗原survivin的CTL識(shí)別表位肽的質(zhì)譜分析圖。

圖2為ELISAPOT檢測(cè)survivin表位肽誘導(dǎo)得到的特異性CTL分泌INF-γ的能力。

圖3為本發(fā)明所得表位肽誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的殺傷作用。

圖4為ELISA檢測(cè)survivin表位肽誘導(dǎo)得到的特異性CTL分泌IL-2的能力。

具體實(shí)施方式

下面，通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1：合成表位肽

采用理論與實(shí)踐相結(jié)合的方法，根據(jù)抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu)，綜合運(yùn)用免疫信息學(xué)手段，運(yùn)用SYFPEITHI、BIMAS、NetCTL、WAPP和EpiJen綜合對(duì)survivin的抗原CTL表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，選取評(píng)分前20的多肽序列進(jìn)行試驗(yàn)篩選，依次命名為P1、P2、P3……P20。

基本流程如下：首先將一個(gè)氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹脂上，然后脫掉氨基的保護(hù)基，第一個(gè)氨基酸即連接至固相載體上；其次將第二個(gè)氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸的羧基縮合劑活化，活化后的第二個(gè)氨基酸羧基再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，此時(shí)在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽。重復(fù)上述的肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長，直至達(dá)到所需要的肽鏈長度，最后切割得到目的表位肽粗品。將目的表位肽粗品經(jīng)HPLC純化得到目的表位肽精肽，其純度大于90％，質(zhì)譜分析證實(shí)其分子量符合理論值。

本發(fā)明提出的一種特異性腫瘤抗原survivin的CTL識(shí)別表位肽采用Fmoc固相合成法進(jìn)行合成，所述CTL識(shí)別表位肽為十五肽，編號(hào)為P12，其氨基酸序列如下：Gly-Gly-Arg-Gly-Gly-Arg-Ile-Thr-Arg-Glu-Glu-His-Lys-Lys-His。對(duì)P12進(jìn)行質(zhì)譜分析，其質(zhì)譜分析結(jié)果如圖1所示，可以證實(shí)其分子量為1717.93g/mol，符合理論值。

實(shí)施例2：多肽功能檢測(cè)

上述所得P12和其余19個(gè)表位肽可用于制備具有survivin表達(dá)的腫瘤治療性多肽疫苗，其應(yīng)用實(shí)驗(yàn)如下：

1、上述CTL識(shí)別表位肽誘導(dǎo)特異性CTL細(xì)胞、IFN-γ分泌及對(duì)腫瘤靶細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)：抽取患者的外周血經(jīng)密度梯度離心分離，獲得PBMCs，添加細(xì)胞因子培養(yǎng)DC細(xì)胞和CTL細(xì)胞，進(jìn)一步采用DC細(xì)胞負(fù)載本發(fā)明的survivin表位肽，與CTL共培養(yǎng)刺激特異的CTL擴(kuò)增，進(jìn)一步在體外采用ELISAPOT和LDH實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特異的CTL在特異抗原刺激下INF-γ的分泌及對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的殺傷作用。

具體方法如下：

(I)、PBMC的分離與誘導(dǎo)：

1)將50mL抗凝處理的外周血，2000rpm離心10min；

2)收集上層血漿凍存，用PBS(pH＝7.4)稀釋剩下的血細(xì)胞；

3)將稀釋的血細(xì)胞加入到等體積的淋巴分離液液面上；

4)20℃離心20min，關(guān)閉離心機(jī)剎車；

5)離心后，分為四層，用吸嘴玻璃滴管吸取白膜層(即第二層)；

6)取出的白膜層用PBS洗滌兩遍；

7)將細(xì)胞以2～5×10⁶/mL接種到6孔板內(nèi)，2h后，回收未貼壁的細(xì)胞，用預(yù)包被anti-CD3IgG和anti-CD28IgG的培養(yǎng)板進(jìn)行激活培養(yǎng)；

8)貼壁的細(xì)胞加入GM-CSF和IL-4刺激培養(yǎng)5天誘導(dǎo)成DC細(xì)胞，第三天半換液；

9)第5天，收集DC細(xì)胞，將10μg實(shí)施例1所得目的表位肽精肽加入DC細(xì)胞中，1h后，將DC細(xì)胞與激活的T細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)加入IL2及IL-15；

10)繼續(xù)培養(yǎng)5天后，得到抗原特異的CTL細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞因子分泌及對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)。

(II)、IFN-γELISAPOT實(shí)驗(yàn)：使用Human IFN-gamma ELISAPOT(ELISAPOT檢測(cè)試劑盒，eBioscience公司)檢測(cè)CTL細(xì)胞分泌的IFN-γ。步驟如下：

1)將PBS稀釋好的包被抗體加入ELISAPOT板內(nèi)，50μL/孔，4℃包被過夜；

2)棄去包被液，用PBS洗滌3次，最后一次在滅菌吸水紙上拍干；

3)加入稀釋好的封閉液，200μL/孔，37℃放置1h；

4)棄去封閉液，用PBS洗滌一次，拍干；

5)細(xì)胞接種，將不同多肽誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞按1×10⁵/孔加入到ELISAPOT平板內(nèi)，加入刺激對(duì)應(yīng)的多肽，以PMA和ION刺激孔為陽性對(duì)照，不加多肽的CTL為陰性對(duì)照；

6)37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h；

7)每孔加入預(yù)冷的去離子水，200μL/孔，低滲裂解細(xì)胞；

8)每孔加入洗滌液洗滌5遍，200μL/孔，每次放置1min，最后一次在吸水紙上拍干；

9)加入稀釋好的生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，100μL/孔，4℃孵育過夜；

10)棄去孔內(nèi)液體，加入洗滌液洗滌5遍；

11)加入稀釋好的親和素偶聯(lián)二抗工作液，100μL/孔，37℃孵育1h；

12)洗滌5遍后，加入配置好的AEC顯色液，100μL/孔，室溫避光放置15-30min；

13)ELISAPOT圖像分析儀計(jì)數(shù)。

結(jié)果如圖2所示，P4、P12、P13負(fù)載的DC細(xì)胞均能夠較好誘導(dǎo)出特異的CTL細(xì)胞，分泌較高量的IFN-γ。

(III)、腫瘤細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)：采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放檢測(cè)法，使用CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，Promega公司)進(jìn)行LDH試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞殺傷能力。步驟如下：

1)設(shè)立檢測(cè)培養(yǎng)板(100μL/孔)

a.設(shè)立實(shí)驗(yàn)組：以survivin陽性表達(dá)的胃癌細(xì)胞SGC-7901為靶細(xì)胞，按效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比為5:1、10:1、20:1加入上述特性CTL細(xì)胞

b.設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組

c.設(shè)立靶細(xì)胞自發(fā)釋放組

d.設(shè)立靶細(xì)胞最大釋放組

e.設(shè)立背景對(duì)照組

2)細(xì)胞裂解及收獲上清

a.37℃5％CO₂共培養(yǎng)5h

b.靶細(xì)胞最大釋放組中加入裂解液，45min后，所有的孔，250g/min離心收集上清

3)LDH檢測(cè)

a.轉(zhuǎn)移50μL上清至另一個(gè)96孔板

b.每孔加入50μL稀釋的底物混合物，室溫避光孵育30min

c.每孔添加50μL終止液

d.在490nm下檢測(cè)吸光值OD

細(xì)胞殺傷率計(jì)算公式如下：

殺傷率(％)＝[(OD_{實(shí)驗(yàn)組}-OD_{效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組}-OD_{靶細(xì)胞自發(fā)釋放組})/(OD_{靶細(xì)胞最大釋放組}-OD_{靶細(xì)胞自發(fā)釋放組})]×100％

結(jié)果如圖3所示，圖3為本發(fā)明實(shí)施例1所得P4、P12、P13各自誘導(dǎo)得到的特異性CTL細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901殺傷能力對(duì)比圖；由圖3可知，P12誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901殺傷效果最好。

2、IL-2細(xì)胞因子分泌檢測(cè)：Human IFN-gamma Platinum ELISA(IL-2ELISA檢測(cè)試劑盒，eBioscience公司)檢測(cè)CTL細(xì)胞分泌的IL-2。步驟如下：

1)將P12誘導(dǎo)得到的特異性CTL細(xì)胞去除細(xì)胞因子培養(yǎng)24h后，接種到96孔板內(nèi)；

2)細(xì)胞中加入刺激腫瘤細(xì)胞抗原及對(duì)照293T細(xì)胞刺激24h后，離心去除細(xì)胞，收集細(xì)胞上清；

3)采用ELISA檢測(cè)上清中IL-2的表達(dá)。

結(jié)果如圖4所示，由圖4可知：本發(fā)明的表位肽在腫瘤抗原刺激后，分泌IL-2的能力顯著提高，說明本發(fā)明表位肽刺激誘導(dǎo)得到的CTL細(xì)胞能夠在腫瘤抗原的刺激下分泌IL-2，刺激細(xì)胞的增殖，從而起到更好的殺腫瘤細(xì)胞的效果。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。