本發(fā)明屬于煙草化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從煙草中首次提取得到的苯并異呋喃類(lèi)化合物。同時(shí)，本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法和在抗菌接裝紙中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

煙草是世界上化學(xué)成分最為復(fù)雜的植物，次生代謝產(chǎn)物非常豐富，據(jù)1982年Dube和Green等報(bào)道，煙草中已鑒定出的化學(xué)成分就超過(guò)2549種，到2008年，Rodgman和perfetti的報(bào)道稱，煙草、煙草代用品以及卷煙煙氣中發(fā)現(xiàn)的化合物總數(shù)大約為8700種。目前，人們從煙草中鑒定出來(lái)的單體化學(xué)物質(zhì)就超過(guò)3000多種，而且還有許多成分尚未鑒定出來(lái)。煙草除主要用于卷煙抽吸用途外，還可從中提取多種有利用價(jià)值的化學(xué)成分，從中發(fā)現(xiàn)有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的先導(dǎo)性化合物。

呋喃類(lèi)化合物在很多天然植物中存在，并且具有多種生物活性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該類(lèi)化合物具有抗腫瘤，抗氧化，鈣內(nèi)流阻滯，血管緊張素II受體拮抗，腺苷Al受體拮抗，抗真菌、抗細(xì)菌活性和血小板聚集拮抗等藥理作用。由于苯呋喃類(lèi)化合物具有如此廣譜的藥理活性，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)該類(lèi)化合物進(jìn)行了深入的研究，除從天然產(chǎn)物中尋找該類(lèi)化合物外，還經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)修飾而得到具有更優(yōu)藥理活性的化合物。為了研究這類(lèi)化合物的構(gòu)效關(guān)系，可進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)更多的呋喃類(lèi)化合物，從中尋找有效的先導(dǎo)化合物和活性基團(tuán)。本發(fā)明從云南烤煙煙葉中分離得到了一種新的苯并異呋喃類(lèi)化合物，該化合物至今尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道，值得一提的是該化合物具有顯著的抗菌活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一方面在于提供一種新的苯并異呋喃類(lèi)化合物。該化合物從烤煙煙葉中分離得到，其分子式為C₁₃H₁₄O₃，經(jīng)過(guò)分析化學(xué)鑒定，其具有下述結(jié)構(gòu)：

該化合物為淺黃色膠狀物，本發(fā)明人將其中文名命名為2-羥基-1-異戊烯基-異苯并呋喃-5(3H)-酮，英文名為2-hydroxy-1-prenyl-isobenzofuran-5(3H)-one。

本發(fā)明第二方面提供了上述第一方面所述的苯并異呋喃類(lèi)化合物的制備方法，該方法包括如下步驟：

(1)浸膏提取:以煙草葉片為原料，將其粉碎或切成小段，用第一溶劑浸泡并提取所述煙草3～5次，每次24h～72h，將提取液合并、過(guò)濾并濃縮后得到所述煙草提取物浸膏；其中所述第一溶劑是選自重量百分濃度80％～100％的甲醇或乙醇，或重量百分濃度60％～90％的丙酮，且第一溶劑：煙葉＝2～4:1，重量比；

(2)硅膠柱層析：將上述煙草提取物浸膏用選自純甲醇、純乙醇或純丙酮的第二溶劑溶解后與為煙草提取物浸膏的0.8～1.2重量倍的80～100目硅膠拌樣，將拌樣后的混合物再與為煙草提取物浸膏的2～4重量倍的160～300目硅膠混合后干法裝柱，然后用體積比依次為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的一系列氯仿-丙酮溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集其中用體積比為7:3的氯仿-丙酮溶液洗脫時(shí)得到的洗脫液，稱為第一洗脫液；

(3)超臨界流體色譜分離純化：將上述第一洗脫液通入超臨界流體色譜進(jìn)行分離純化，該超臨界流體色譜采用10mm×150mm，5μm的Silica 2-EP色譜柱，流動(dòng)相二氧化碳/乙醇(85/15，質(zhì)量比)，流動(dòng)相流速為20mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為305nm，第一洗脫液液每次進(jìn)樣200～500μL，收集每次進(jìn)樣后色譜峰保留時(shí)間為11.5min時(shí)所對(duì)應(yīng)的洗脫液，稱為第二洗脫液，將該第二洗脫液脫除溶劑后即得所述苯并異呋喃類(lèi)化合物。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括以下進(jìn)一步提純的步驟：將在所述超臨界流體色譜分離之后得到的所述苯并異呋喃類(lèi)化合物再次溶于甲醇溶液，并以甲醇溶液為流動(dòng)相，通過(guò)凝膠柱進(jìn)行層析分離，以進(jìn)一步分離純化。

本發(fā)明的第三方面提供了所述苯并異呋喃化合物在抗菌接裝紙中的應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明苯并異呋喃類(lèi)化合物的核磁共振碳譜；

圖2為本發(fā)明苯并異呋喃類(lèi)化合物的核磁共振氫譜；

圖3為本發(fā)明苯并異呋喃類(lèi)化合物的主要HMBC相關(guān)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明制備得到的苯并異呋喃類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)通過(guò)以下方法進(jìn)行測(cè)定。為淺黃色膠狀物；HR-ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為241.0832[M+Na]⁺，結(jié)合¹H-和¹³C-NMR譜確定分子式為C₁₃H₁₄O₃，不飽和度為7。其紅外光譜顯示化合物中有羥基(3389cm^-1)、羰基(1715和1650cm^-1)，和芳環(huán)(1610、1566和1467cm^-1)信號(hào)，紫外光譜在305、272和210nm有最大吸收也證實(shí)化合物中存在芳環(huán)結(jié)構(gòu)。從¹H和¹³CNMR譜(數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表-1)信號(hào)可以看出化合物中有一個(gè)1,2,4,5-四取代的苯環(huán)(δ_C 126.0s、159.2s、111.2d、144.7s、116.4s和130.2d；δ_H6.74s和7.78s)、一個(gè)異戊烯基(δ_C 27.2t、124.2d、133.3s、17.6q和25.8q；δ_H 3.27(d)6.8、5.30(t)6.8、1.57s和1.81s)、一個(gè)氧化亞甲基(δ_C 68.9t和δ_H 5.52s)、一個(gè)酯羰基(δ_C168.6s)、1個(gè)酚羥基(δ_H 10.44s)。根據(jù)H₂-1′(δ_H 5.52)和C-2′(δ_C 168.6)、C-3(δ_C 111.2)、C-4(δ_C 144.7)、C-5(δ_C 116.4)，H-3(δ_H 6.74)和C-1(δ_C 111.2)，以及H-6(δ_H 7.78)和C-2′(δ_C 168.6)的HMBC相關(guān)可證實(shí)化合物為異苯并呋喃內(nèi)脂類(lèi)化合物[6]，C-1'和C-2'通過(guò)氧原子連接形成了五元內(nèi)酯環(huán)。化合物的母體骨架得到確認(rèn)后，其他取代基團(tuán)的位置也可通過(guò)HMBC相關(guān)確認(rèn)；根據(jù)H-8(δ_H 5.30)和C-1(δ_C 126.0)，H-7(δ_H 3.27)和C-1(δ_C 126.0)、C-2(δ_C 159.2)、C-6(δ_C 130.2)，以及H-6(δ_H 7.78)和C-7(δ_C 27.2)的HMBC相關(guān)可證實(shí)異戊烯基連接在苯環(huán)的-1位，根據(jù)酚羥基氫(δ_H 10.44)和C-1(δ_C 126.0)、C-2(δ_C 159.2)和C-3(δ_C111.2)的HMBC相關(guān)可證實(shí)酚羥基取代在C-2位。至此化合物的(1)結(jié)構(gòu)得以確定，該化合物命名為2-羥基-1-異戊烯基-異苯并呋喃-5(3H)-酮。

化合物的紅外、紫外和質(zhì)譜數(shù)據(jù)：：為淺黃色膠狀物；UV(MeOH)，λ_max(logε)305(2.60)、272(3.43)、210(3.86)nm；IR(KBr)λ_max 3389、3086、2953、1715、1650、1610、1566、1467、1352、1278、1156、1055、920和775cm^-1；ESIMS(正離子模式)m/z 241[M+Na]⁺；HRESIMS(正離子模式)m/z 241.0832[M+Na]⁺(計(jì)算值241.0841，C₁₃H₁₄NaO₃)。

表-1化合物(1)的核磁共振數(shù)據(jù)(溶劑為C₅D₅N)

本發(fā)明化合物是首次被分離出來(lái)的，通過(guò)上述核磁共振和質(zhì)譜測(cè)定方法確定了為苯并異呋喃類(lèi)化合物，并表征了其具體結(jié)構(gòu)。對(duì)該化合物進(jìn)行了抗菌活性篩選，其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、埃希菌、枯草桿菌、變形桿菌等具有顯著的活性。

該化合物應(yīng)用到卷煙接裝紙中，和對(duì)照相比較，添加過(guò)本化合物的接裝紙檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、溶血性鏈球菌、真菌總數(shù)顯著減少；對(duì)大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)的抑菌率全部達(dá)到92.2％以上，能夠降低或消除卷煙接裝紙及在貯存過(guò)程中細(xì)菌滋生和繁殖的可能性，另外，在卷煙吸食、傳遞過(guò)程中，該抗菌作用也能夠?qū)頍煙熤系慕友b紙被污染的微生物起到抑制作用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明的化合物原料易得，提取方法簡(jiǎn)單，容易分離得到；分子結(jié)構(gòu)也簡(jiǎn)單，容易實(shí)現(xiàn)人工合成。(2)采用了常規(guī)柱層析和高效液相色譜結(jié)合的制備方法，化合物制備操作流程簡(jiǎn)單，所獲得的本發(fā)明化合物純度高，后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)容易實(shí)現(xiàn)。(3)本發(fā)明化合物對(duì)動(dòng)物無(wú)毒，使用安全，展現(xiàn)出良好的抗菌活性，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等的抑菌率全部達(dá)到92.2％以上；應(yīng)用于卷煙接裝紙，能夠?qū)頍熃友b紙被污染的微生物起到抑制作用。卷煙接裝紙直接和口腔接觸，該化合物在卷煙接裝紙中的使用可避免在卷煙在吸食、傳遞過(guò)程中被微生物污染，有效提高了卷煙的衛(wèi)生和安全性。

本發(fā)明所用煙葉原料不受地區(qū)和品種限制，均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，下面以來(lái)源于云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司不同產(chǎn)地的煙葉原料，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

實(shí)施例1

制備苯并異呋喃類(lèi)化合物C₁₃H₁₄O₃，包括浸膏提取、硅膠柱層析、超臨界流體色譜分離，具體采用以下步驟：

(1)浸膏提取:以煙草葉片為原料，將其粉碎或切成小段，用第一溶劑浸泡并提取所述煙草3～5次，每次24h～72h，將提取液合并、過(guò)濾并濃縮后得到所述煙草提取物浸膏；其中所述第一溶劑是選自重量百分濃度80％～100％的甲醇或乙醇，或重量百分濃度60％～90％的丙酮，且第一溶劑：煙葉＝2～4:1，重量比；

(2)硅膠柱層析：將上述煙草提取物浸膏用選自純甲醇、純乙醇或純丙酮的第二溶劑溶解后與為煙草提取物浸膏的0.8～1.2重量倍的80～100目硅膠拌樣，將拌樣后的混合物再與為煙草提取物浸膏的2～4重量倍的160～300目硅膠混合后干法裝柱，然后用體積比依次為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的一系列氯仿-丙酮溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集其中用體積比為7:3的氯仿-丙酮溶液洗脫時(shí)得到的洗脫液，稱為第一洗脫液；

(3)超臨界流體色譜分離純化：將上述第一洗脫液通入超臨界流體色譜進(jìn)行分離純化，該超臨界流體色譜采用10mm×150mm，5μm的Silica 2-EP色譜柱，流動(dòng)相二氧化碳/乙醇(85/15，質(zhì)量比)，流動(dòng)相流速為20mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為305nm，第一洗脫液液每次進(jìn)樣200～500μL，收集每次進(jìn)樣后色譜峰保留時(shí)間為11.5min時(shí)所對(duì)應(yīng)的洗脫液，稱為第二洗脫液，將該第二洗脫液脫除溶劑后即得所述苯并異呋喃類(lèi)化合物。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括以下進(jìn)一步提純的步驟：將在所述超臨界流體色譜分離之后得到的所述苯并異呋喃類(lèi)化合物再次溶于甲醇溶液，并以甲醇溶液為流動(dòng)相，通過(guò)凝膠柱進(jìn)行層析分離，以進(jìn)一步分離純化。

實(shí)施例2

煙草樣品來(lái)源于云南玉溪，品種為玉溪K326。將煙草取樣2.0kg粉碎以95％的甲醇提取5次，每次提取24h，提取液合并，過(guò)濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏105g。浸膏用重量比2.0倍量的純甲醇溶解后用120g的100目粗硅膠拌樣，0.6kg的160目硅膠裝柱進(jìn)行硅膠柱層析，用體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脫，TLC監(jiān)測(cè)合并相同的部分，得到8個(gè)部分，其中體積配比為7:3的氯仿-丙酮洗脫部分用超臨界流體色譜進(jìn)行分離純化，該超臨界流體色譜采用10mm×150mm，5μm的Silica 2-EP色譜柱，流動(dòng)相二氧化碳/乙醇(85/15，質(zhì)量比)，流動(dòng)相流速為20mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為305nm，每次進(jìn)樣200μL，收集每次進(jìn)樣后色譜峰保留時(shí)間為11.5min時(shí)所對(duì)應(yīng)的洗脫液，將洗脫液脫除溶劑后即得所述苯并異呋喃類(lèi)化合物。所得產(chǎn)物再次用純甲醇溶解，再以純甲醇為流動(dòng)相，用Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，即得該新化合物。

實(shí)施例3

煙草樣品來(lái)源于云南大理，品種為云煙200，將煙草取樣3.5kg切碎，以95％的乙醇提取4次，每次提取48h，提取液合并，過(guò)濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏250g。浸膏用重量比2.0倍量的純甲醇溶解后用250g的80目粗硅膠拌樣，1.2kg的200目硅膠裝柱進(jìn)行硅膠柱層析，用體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脫，TLC監(jiān)測(cè)合并相同的部分，得到8個(gè)部分，其中體積配比為7:3的氯仿-丙酮洗脫部分用超臨界流體色譜進(jìn)行分離純化，該超臨界流體色譜采用10mm×150mm，5μm的Silica 2-EP色譜柱，流動(dòng)相二氧化碳/乙醇(85/15，質(zhì)量比)，流動(dòng)相流速為20mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為305nm，每次進(jìn)樣200μL，收集每次進(jìn)樣后色譜峰保留時(shí)間為11.5min時(shí)所對(duì)應(yīng)的洗脫液，將洗脫液脫除溶劑后即得所述苯并異呋喃類(lèi)化合物。所得產(chǎn)物再次用純甲醇溶解，再以純甲醇為流動(dòng)相，用Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，即得該新化合物。

實(shí)施例4

煙草樣品來(lái)源于云南昆明，品種為紅花大金元，將煙草取樣5kg粉碎，以75％的丙酮用超聲提取3次，每次提取72h，提取液合并，過(guò)濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏380g。浸膏用重量比1.6倍量的純甲醇溶解后用400g的90目粗硅膠拌樣，2.4kg的180目硅膠裝柱進(jìn)行硅膠柱層析，用體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脫，TLC監(jiān)測(cè)合并相同的部分，得到8個(gè)部分，其中體積配比為7:3的氯仿-丙酮洗脫部分用超臨界流體色譜進(jìn)行分離純化，該超臨界流體色譜采用10mm×150mm，5μm的Silica 2-EP色譜柱，流動(dòng)相二氧化碳/乙醇(85/15，質(zhì)量比)，流動(dòng)相流速為20mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為305nm，每次進(jìn)樣200μL，收集每次進(jìn)樣后色譜峰保留時(shí)間為11.5min時(shí)所對(duì)應(yīng)的洗脫液，將洗脫液脫除溶劑后即得所述苯并異呋喃類(lèi)化合物。所得產(chǎn)物再次用純甲醇溶解，再以純甲醇為流動(dòng)相，用Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，即得該新化合物。

實(shí)施例5

------化合物結(jié)構(gòu)的鑒定

取實(shí)施例1-4制備的化合物，以上述方法制備得到的苯并異呋喃類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)通過(guò)以下方法進(jìn)行測(cè)定?；衔餅闇\黃色膠狀物；HR-ESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為241.0832[M+Na]⁺，結(jié)合¹H-和¹³C-NMR譜確定分子式為C₁₃H₁₄O₃，不飽和度為7。其紅外光譜顯示化合物中有羥基(3389cm^-1)、羰基(1715和1650cm^-1)，和芳環(huán)(1610、1566和1467cm^-1)信號(hào)，紫外光譜在305、272和210nm有最大吸收也證實(shí)化合物中存在芳環(huán)結(jié)構(gòu)。從¹H和¹³CNMR譜(數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表-1)信號(hào)可以看出化合物中有一個(gè)1,2,4,5-四取代的苯環(huán)(δ_C 126.0s、159.2s、111.2d、144.7s、116.4s和130.2d；δ_H 6.74s和7.78s)、一個(gè)異戊烯基(δ_C 27.2t、124.2d、133.3s、17.6q和25.8q；δ_H 3.27(d)6.8、5.30(t)6.8、1.57s和1.81s)、一個(gè)氧化亞甲基(δ_C 68.9t和δ_H 5.52s)、一個(gè)酯羰基(δ_C 168.6s)、1個(gè)酚羥基(δ_H 10.44s)。根據(jù)H₂-1′(δ_H 5.52)和C-2′(δ_C168.6)、C-3(δ_C 111.2)、C-4(δ_C 144.7)、C-5(δ_C 116.4)，H-3(δ_H 6.74)和C-1(δ_C 111.2)，以及H-6(δ_H 7.78)和C-2′(δ_C 168.6)的HMBC相關(guān)可證實(shí)化合物為異苯并呋喃內(nèi)脂類(lèi)化合物[6]，C-1'和C-2'通過(guò)氧原子連接形成了五元內(nèi)酯環(huán)。化合物的母體骨架得到確認(rèn)后，其他取代基團(tuán)的位置也可通過(guò)HMBC相關(guān)確認(rèn)；根據(jù)H-8(δ_H 5.30)和C-1(δ_C126.0)，H-7(δ_H 3.27)和C-1(δ_C126.0)、C-2(δ_C 159.2)、C-6(δ_C 130.2)，以及H-6(δ_H 7.78)和C-7(δ_C 27.2)的HMBC相關(guān)可證實(shí)異戊烯基連接在苯環(huán)的-1位，根據(jù)酚羥基氫(δ_H 10.44)和C-1(δ_C 126.0)、C-2(δ_C 159.2)和C-3(δ_C 111.2)的HMBC相關(guān)可證實(shí)酚羥基取代在C-2位。至此化合物的(1)結(jié)構(gòu)得以確定，該化合物命名為2-羥基-1-異戊烯基-異苯并呋喃-5(3H)-酮。

實(shí)施例6

取實(shí)施例3制備的化合物，為黃色膠狀物。測(cè)定方法與實(shí)施例5相同，確認(rèn)實(shí)施例3制備的化合物為所述的苯并異呋喃類(lèi)化合物——2-羥基-1-異戊烯基-異苯并呋喃-5(3H)-酮。

實(shí)施例7

取實(shí)施例4制備的化合物，為黃色膠狀物。測(cè)定方法與實(shí)施例5相同，確認(rèn)實(shí)施例4制備的化合物為所述的2-羥基-1-異戊烯基-異苯并呋喃-5(3H)-酮。

實(shí)施例8

取實(shí)施例1-4制備的任苯并異呋喃類(lèi)化合物進(jìn)行抗菌活性試驗(yàn)，試驗(yàn)情況如下：

體外抗菌實(shí)驗(yàn)用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行，首先將受試菌均勻地涂在普通瓊脂培養(yǎng)基(牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、血清、瓊脂)的平板上，再將待測(cè)化合物(苯并呋喃丙素化合物用10mL DMSO溶解，加水稀釋成50μg/mL的溶液)浸泡好的藥片(直徑5mm)放在帶菌的培養(yǎng)基上，放入恒溫箱內(nèi)，于25℃孵育24-72h后觀察抑菌圈大小。結(jié)果表明：本發(fā)明化合物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、埃希菌、枯草桿菌、變形桿菌等具有很強(qiáng)的活性；抑制率超過(guò)92.2％。

實(shí)施例9

對(duì)本發(fā)明化合物進(jìn)行了安全性評(píng)價(jià)，通過(guò)小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)、Ames實(shí)驗(yàn)和TK基因突變實(shí)驗(yàn),證明本發(fā)明化合物對(duì)動(dòng)物無(wú)毒，使用安全。本化合物以50μg/mL的濃度加到卷煙接裝紙上；按中華人民共和國(guó)《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB15979-2002的檢測(cè)方法，取加過(guò)本發(fā)明化合物的卷煙用接裝紙，2.0×3.0mm大小，檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、溶血性鏈球菌、真菌總數(shù)。結(jié)果表明，添加過(guò)本發(fā)明化合物的接裝紙菌落總數(shù)明顯減少，本化合物對(duì)幾種測(cè)試的細(xì)菌都有明顯抑制作用，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等的抑菌率全部達(dá)到92.2％以上。