本發(fā)明涉及一種微生物檢測(cè)方法，特別是一種檢測(cè)煙葉中淀粉降解微生物的方法。

背景技術(shù)：

烤煙是我國(guó)的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一，在我國(guó)煙草的發(fā)展中占有重要地位。由于煙葉在栽培、烘烤和陳化過(guò)程中的原因，目前國(guó)內(nèi)烤煙普遍存在淀粉殘留量較高等問(wèn)題。淀粉是煙葉光合作用的主要產(chǎn)物，淀粉是煙葉物質(zhì)和能量的一種儲(chǔ)存形式，在葉綠體中，光合產(chǎn)物除了滿(mǎn)足細(xì)胞自身代謝活動(dòng)所需的物質(zhì)和能量之外，多余的部分基本上轉(zhuǎn)化為淀粉儲(chǔ)藏起來(lái)，在煙株生命活動(dòng)所需之時(shí)，淀粉又可降解并轉(zhuǎn)化為其它形式的糖類(lèi)供給各種需求。煙葉上、中、下三個(gè)部位的淀粉含量差別較大，煙葉在生長(zhǎng)過(guò)程中，其淀粉含量逐步增加，隨葉片的衰老而顯著減少。成熟煙葉的淀粉含量通常在25％左右，烤后煙葉的淀粉含量在2％-8％，淀粉含量超過(guò)5％時(shí)，則認(rèn)為對(duì)煙葉的品質(zhì)不利，因?yàn)橐缘矸坌问酱嬖诘奶穷?lèi)在煙支燃吸時(shí)會(huì)影響燃燒速度和燃燒完全性，燃燒時(shí)產(chǎn)生糊焦氣味，使煙草香味變壞，所以淀粉含量的多少?zèng)Q定著煙葉的內(nèi)在品質(zhì)和吸食味的好壞，而淀粉轉(zhuǎn)化形成的糖含量的高低，直接影響煙葉中殘留的淀粉量，因此淀粉降解程度是煙葉質(zhì)量?jī)?yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)。

烘烤和陳化過(guò)程是煙葉中大分子生物化合物降解轉(zhuǎn)化為有利于香氣味水平提高的小分子生物化合物的重要過(guò)程。隨著中式卷煙對(duì)原料質(zhì)量要求的提高，有必要對(duì)烘烤和陳化過(guò)程中降解各種大分子生物化合物的酶活性進(jìn)行研究，以便創(chuàng)造有利環(huán)境，促使各種大分子生物化合物的降解。淀粉是煙葉中一種重要的含氮化合物，在烘烤和陳化過(guò)程中會(huì)發(fā)生分解、轉(zhuǎn)化。合理降解煙葉淀粉已成為提高煙葉可用性的關(guān)鍵之一。煙葉中淀粉的降解是在一定溫度、濕度和煙葉水分含量條件下，由相關(guān)淀粉降解細(xì)菌分泌水解酶的水解作用來(lái)完成的。在煙葉烘烤和陳化過(guò)程中，現(xiàn)有的手段包括利用外加淀粉酶降低煙葉中的淀粉含量，或者利用煙葉表面附著的大量微生物，在煙葉上生長(zhǎng)繁殖的過(guò)程中分泌釋放出多種酶對(duì)煙葉陳化過(guò)程中發(fā)生的水解反應(yīng)起到促進(jìn)作用。煙葉表面附著的淀粉降解細(xì)菌，除了通過(guò)自身的生命活動(dòng)作用于煙葉的烘烤和陳化過(guò)程，還通過(guò)其分泌的淀粉酶參與煙葉的生理生化反應(yīng)，促進(jìn)煙葉中淀粉的降解，煙葉表面的淀粉降解細(xì)菌分泌淀粉酶的作用是其烘烤和陳化過(guò)程中的一個(gè)重要影響因素，通過(guò)淀粉酶及相關(guān)化學(xué)物質(zhì)的協(xié)同作用，能誘發(fā)一系列改善煙葉化學(xué)成分協(xié)調(diào)性和評(píng)吸質(zhì)量的生化反應(yīng)，促進(jìn)煙葉中淀粉等生物大分子的生物轉(zhuǎn)化，協(xié)調(diào)煙葉的內(nèi)在成分，促進(jìn)煙葉內(nèi)部有機(jī)物質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化，調(diào)整煙葉中各種化學(xué)成分的比例，提高煙葉中香氣成分的形成和積累，從而提高煙葉的吸食品質(zhì)。

淀粉根據(jù)結(jié)構(gòu)的差異可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。直鏈淀粉是由α-1,4-糖苷鍵連接而成的線(xiàn)性多聚糖，一般占淀粉組成的30％；支鏈淀粉是由α-1,4-糖苷鍵和β-1,6-糖苷鍵連接而成的具有分支的多聚糖，是淀粉的主要組成部分，占70％之多。α-淀粉酶是淀粉水解的起始酶，可隨機(jī)降解直鏈淀粉和支鏈淀粉非末端的α-1,4-糖苷鍵，作用于直鏈淀粉的產(chǎn)物是麥芽糖，作用于支鏈淀粉時(shí)，只能水解外圍碳鏈的α-1,4-糖苷鍵，作用至α-1,6-糖苷鍵時(shí)生成極限糊精。成熟烤煙鮮煙葉含淀粉約40％，烘烤過(guò)程中，煙葉淀粉的降解是在一定溫度、濕度和煙葉含水量條件下，經(jīng)α-淀粉酶催化斷裂α-1,4-或1,6-糖苷鍵、產(chǎn)生還原糖等小分子來(lái)進(jìn)行的。

煙葉原材料對(duì)煙草生產(chǎn)企業(yè)的擴(kuò)張發(fā)展起著重要的作用。由于品種、栽培和調(diào)制等原因，我國(guó)部分煙葉尤其是低次等煙葉中淀粉含量偏高，影響了煙葉化學(xué)成分的協(xié)調(diào)性，降低了卷煙的吸食品質(zhì)。合理降解烤后煙葉淀粉含量已成為提高煙葉可用性的關(guān)鍵技術(shù)之一，現(xiàn)有的研究表明，煙葉表面附著有眾多的微生物，尤以細(xì)菌居多，其類(lèi)型和數(shù)量直接關(guān)系到煙葉的品質(zhì)好壞，煙葉表面附著的淀粉降解細(xì)菌在其生長(zhǎng)過(guò)程中合成多種淀粉酶類(lèi)，正是這些生物酶加快了煙葉中淀粉的降解和轉(zhuǎn)化速度?？緹熀婵局袩熑~淀粉降解程度對(duì)煙葉品質(zhì)有重要的影響，烘烤中烤煙淀粉不降解或降解不完全會(huì)嚴(yán)重影響烤后煙葉的色、香、味，卷煙中淀粉含量過(guò)高會(huì)影響抽吸時(shí)的燃燒速度和燃燒完全性，特別是煙葉中殘留的淀粉在燃吸時(shí)會(huì)產(chǎn)生焦糊味、刺激性和雜氣，且不耐儲(chǔ)存。淀粉降解產(chǎn)生的還原糖含量過(guò)低會(huì)破壞煙氣酸堿平衡、含氮化合物增加，不僅使煙氣粗糙、產(chǎn)生焦糊味，而且燃吸時(shí)會(huì)產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide)、酚類(lèi)(phenols)和苯類(lèi)(benzenes)等有害氣體。所以，烘烤中烤煙淀粉是否充分降解成為評(píng)價(jià)烤煙品質(zhì)的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)，一般認(rèn)為，調(diào)制好的煙葉淀粉含量應(yīng)小于3.0％，目前國(guó)外優(yōu)質(zhì)煙葉淀粉含量為l％-2％，而國(guó)產(chǎn)煙葉為4％-6％，烤后煙葉淀粉殘留量過(guò)高已成為制約國(guó)產(chǎn)煙葉質(zhì)量提高的重要因素之一。

烤煙烘烤中淀粉降解及其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與烤煙香味密切相關(guān)，烘烤后，淀粉降解產(chǎn)生的還原糖在抽吸時(shí)裂解產(chǎn)生酸性產(chǎn)物，對(duì)平衡由煙堿和含氮化合物在抽吸過(guò)程中產(chǎn)生的堿性煙氣有積極作用，其在很大程度上決定著原煙的香味風(fēng)格。在煙葉烘烤和陳化過(guò)程中，由于淀粉酶的催化作用，煙葉中的淀粉被分解、合成和再轉(zhuǎn)化。煙葉中的淀粉降解為水溶性糖，經(jīng)過(guò)酶處理后的煙葉香氣質(zhì)變好，雜氣和刺激性減輕，煙氣甜度增大，余味變好，勁頭有所降低，煙葉總體質(zhì)量得到提高。合理降解烤后煙葉中的淀粉含量已成為提高煙葉質(zhì)量的關(guān)鍵工藝之一。煙葉中淀粉的轉(zhuǎn)化和分解很大一部分依賴(lài)于煙葉表面附著的淀粉降解細(xì)菌分泌的淀粉酶的作用，淀粉酶的作用從煙葉生長(zhǎng)、烘烤，一直到陳化都始終存在。由于淀粉降解細(xì)菌分泌的淀粉酶的作用貫穿于煙葉烘烤和陳化過(guò)程始終，對(duì)煙葉品質(zhì)的影響較大，因此如何更有效利用淀粉降解細(xì)菌分泌的淀粉酶來(lái)降解煙葉中的殘留淀粉，監(jiān)控?zé)熑~生長(zhǎng)、加工過(guò)程中淀粉酶的活性變化規(guī)律，已經(jīng)成為進(jìn)一步提升煙葉質(zhì)量成為煙草行業(yè)研究的新的挑戰(zhàn)。怎樣促進(jìn)煙葉中淀粉的生物轉(zhuǎn)化和控制煙葉中的淀粉的含量對(duì)于烤煙的內(nèi)在品質(zhì)具有重要的作用。

煙草品種、部位、成熟度對(duì)煙葉的淀粉含量及其香氣味有著重要的影響。烤煙不同品種、不同部位、不同成熟度檔次的煙葉淀粉含量變化規(guī)律是煙葉表面附著的淀粉降解菌群活性的關(guān)鍵因素之一?，F(xiàn)有的研究表明煙葉中淀粉酶及淀粉含量在烘烤過(guò)程各個(gè)時(shí)期的活性變化規(guī)律不同，烘烤過(guò)程中煙葉淀粉酶活性分別在烘烤的24h、36h和72h時(shí)出現(xiàn)高峰，采用低溫低濕變黃，慢速升溫定色的烘烤環(huán)境，使煙葉內(nèi)淀粉酶和淀粉磷酸化酶活性較高，有利于煙葉淀粉的降解。煙葉在經(jīng)過(guò)高溫烘烤后雖然細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭受到破壞，但在陳化初期仍然發(fā)現(xiàn)有淀粉酶的活性，說(shuō)明煙葉在烘烤后的陳化過(guò)程中煙葉內(nèi)殘留有部分淀粉酶，且淀粉酶有較好的熱穩(wěn)定性。

至今為止，所有研究煙葉表面附著的淀粉降解細(xì)菌和淀粉酶的手段都是通過(guò)純培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行的，目前促進(jìn)淀粉降解的方式主要是通過(guò)酶制成各種人工酶制劑，利用生長(zhǎng)或產(chǎn)酶等競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的淀粉降解細(xì)菌菌種添加到烘烤和醇化煙葉中，加快淀粉降解進(jìn)程，增加煙葉香氣和改善煙葉品質(zhì)。首先從烤煙葉表面上分離篩選得到的具有較高淀粉酶活性的細(xì)菌菌株，然后通過(guò)發(fā)酵后制備成淀粉酶制劑，施用于初烤煙葉上，對(duì)煙葉中的淀粉進(jìn)行降解，使其轉(zhuǎn)化為對(duì)煙葉質(zhì)量有促進(jìn)作用的單糖和低聚糖，從而改善煙葉的品質(zhì)與工業(yè)可用性。現(xiàn)有的研究表明，對(duì)分離自烤煙葉面的產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌菌株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens A1)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，提取粗酶液，檢測(cè)酶活性并應(yīng)用于初烤煙葉上，結(jié)果表明，用菌株A1所產(chǎn)淀粉酶制劑處理后的煙葉總糖增加率為12.78％，還原糖增加率為12.03％，利用從煙葉表面分離的產(chǎn)酶菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的酶制劑可促進(jìn)初烤煙葉中淀粉降解，提高還原糖含量。煙葉表面存在的淀粉降解細(xì)菌可以通過(guò)自身代謝分泌淀粉酶，促使淀粉含量進(jìn)一步下降，例如煙草青枯病病菌(Pseudomonas solanacearum)，可產(chǎn)生分解淀粉的酶，如α-淀粉酶。然而采用純培養(yǎng)方式獲得的人工淀粉酶制劑存在以下不足：(1)不管是對(duì)煙葉發(fā)酵技術(shù)條件進(jìn)行改善還是添加外在酶制劑，由于各地?zé)熑~內(nèi)在品質(zhì)不同，不能形成完整統(tǒng)一的煙葉發(fā)酵技術(shù)；(2)由于酶的活性受到溫度、pH、抑制劑等因素的影響，而不同種類(lèi)的煙葉化學(xué)成分不完全相同，發(fā)酵條件也不能適合每種酶的作用條件；(3)目前大多采用的是已商品化的商業(yè)用酶，由于酶的催化活性受多方面的調(diào)節(jié)和控制(如溫度、酸堿度、酶和底物的濃度以及抑制劑的存在等)，并且煙葉發(fā)酵與加工工藝的有其自身的特殊要求，因此簡(jiǎn)單的商品酶的使用未必完全能夠適應(yīng)所有煙葉發(fā)酵中酶處理的需要。

煙葉表面附著的淀粉降解菌群是煙葉烘烤和陳化過(guò)程中重要功能菌群之一，由于缺少系統(tǒng)的有關(guān)參與煙葉發(fā)酵的淀粉降解菌群的原位信息，目前對(duì)淀粉降解菌群在煙葉烘烤和陳化過(guò)程中的作用的了解主要通過(guò)純培養(yǎng)研究(即通過(guò)純培養(yǎng)分離菌株)，但是，煙葉發(fā)酵微生物群落中只有少數(shù)(<20％)能夠被純培養(yǎng)，而且通過(guò)純培養(yǎng)研究得到的微生物生理生化信息不一定能反映微生物在復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)原位的作用和功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種檢測(cè)煙葉中淀粉降解微生物的方法，在原位(in situ)狀態(tài)下用來(lái)探測(cè)煙葉表面附著的淀粉降解細(xì)菌和監(jiān)控它們分泌的淀粉酶的活力，即是不需要通過(guò)純培養(yǎng)分離菌株，可應(yīng)用于針對(duì)不同煙葉種類(lèi)及發(fā)酵條件下，監(jiān)控、調(diào)整和促進(jìn)煙葉淀粉降解細(xì)菌的活力，進(jìn)一步探索出一種可以控制煙葉淀粉酶活力的工藝措施。其原理為：帶有熒光的有機(jī)大分子BODIPY與淀粉結(jié)合，使BODIPY中的熒光被包裹在結(jié)合物的內(nèi)部，在熒光顯微鏡下觀(guān)察不到，位于細(xì)胞質(zhì)壁間的α-淀粉酶能水解BODIPY熒光淀粉，釋放出帶有熒光的短片段水解產(chǎn)物，這些水解產(chǎn)物沉積在有相關(guān)酶活力的微生物細(xì)胞壁周?chē)?，在熒光顯微鏡下可觀(guān)察到被熒光標(biāo)記的單個(gè)具有特定α-淀粉酶活性的細(xì)胞。

同時(shí)，為了排除染色過(guò)程中的假陽(yáng)性，區(qū)分具有水解酶活性與沒(méi)有水解酶活性但能吸收水解產(chǎn)物的細(xì)胞(錯(cuò)誤標(biāo)記)，本發(fā)明在培養(yǎng)中加入了各種電子傳遞鏈抑制劑以保證結(jié)果的可靠性。其原理是微生物菌群會(huì)水解或發(fā)酵加入的標(biāo)記化合物(BODIPY標(biāo)記的淀粉)，因此能吸收帶有標(biāo)記的代謝產(chǎn)物的所有細(xì)胞也都會(huì)被標(biāo)記，而加入電子傳遞鏈抑制劑的可以抑制微生物吸收帶有熒光標(biāo)記的淀粉的水解產(chǎn)物，防止由于主動(dòng)吸收帶有熒光標(biāo)記物的水解產(chǎn)物而導(dǎo)致的假陽(yáng)性，保證了所觀(guān)察到的帶有熒光標(biāo)記的微生物全部都是淀粉降解微生物。

為了得到最優(yōu)化的培養(yǎng)時(shí)間，以保證最大限度的觀(guān)察α-淀粉酶的活性和標(biāo)定淀粉降解細(xì)菌，本發(fā)明搜集了不同烘烤時(shí)段的煙葉樣品(3h；9h；24h；36h)，分別測(cè)試了不同的培養(yǎng)時(shí)間，。所觀(guān)察到的細(xì)菌保持同樣的現(xiàn)狀，只是熒光強(qiáng)度有所區(qū)別。經(jīng)過(guò)用軟件Image J分析和對(duì)比圖片，從而得到最優(yōu)化的培養(yǎng)時(shí)間。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)煙葉中淀粉降解微生物的方法，包括以下步驟：

(1)樣品采集：戴無(wú)菌手套并使用一次性的無(wú)菌收集袋隨機(jī)收集烘烤或者陳化過(guò)程中的煙葉樣品，并保存于18-40度恒溫條件下在20min內(nèi)進(jìn)行樣品處理；

(2)樣品處理：用濃度70％酒精消毒剪刀，在無(wú)菌條件下，將煙葉樣品用消毒過(guò)的剪刀剪成若干小塊，并仔細(xì)除去煙葉的莖和葉脈等無(wú)用組織；

(3)稀釋樣品：無(wú)菌條件下，稱(chēng)取新鮮的碎葉樣品，加入到pH4.0-9.0為滅菌1×PBS緩沖液，緩沖液其用量為碎葉樣品質(zhì)量的10-30倍，與碎葉樣品混合均勻；

(4)細(xì)胞分離：將步驟(3)得到的混勻液體分三次分別倒入攪拌機(jī)攪拌打碎，每次1-5分鐘，然后將三次打碎后的液體混合后倒入攪拌機(jī)高速檔勻漿，過(guò)濾，將濾液離心并去除上清液，將去除上清液的沉淀物重新懸浮于裝有pH4.0-9.0為滅菌1×PBS緩沖液的離心管中，得到細(xì)胞懸浮液；

(5)超聲波處理：將離心管放入超聲波儀器中固定，在確保超聲波處理時(shí)離心管不會(huì)移動(dòng)的前提下，用10000-80000Hz的頻率處理50-140分鐘后取出待用；在等待下一步的處理過(guò)程中，將裝有細(xì)胞懸浮液的離心管儲(chǔ)存于4℃的冰箱中；

(6)淀粉降解微生物的標(biāo)定和示蹤：經(jīng)離心處理并去除上清液的細(xì)胞懸浮液中，依次加入6-15mmol/L,pH 5.1-9.0滅菌的1×Tris-HCl緩沖液和滅菌的氟化硼二吡咯類(lèi)熒光染料BODIPY標(biāo)記的綠色熒光淀粉染液，形成混合液體，并立即將混合液體轉(zhuǎn)入到無(wú)菌的寬底血清瓶中，加入滅菌的電子傳遞鏈抑制劑，將蓋子蓋好，用鋁箔包嚴(yán)避光；室溫?fù)u動(dòng)30-120min，速度保持在100-500rpm進(jìn)行培養(yǎng)；無(wú)菌環(huán)境下吸取10-50μL培養(yǎng)得到的反應(yīng)液均勻涂布于明膠涂層載玻片上，并在無(wú)菌環(huán)境中避光風(fēng)干；所述電子傳遞鏈抑制劑為1-10mmol/L疊氮化鈉、1-10mmol/L氟乙酸鈉和1-10mmol/L碘代乙酰胺鈉組成的混合溶液；

(7)顯微鏡觀(guān)察：將干燥好的載玻片置于熒光顯微鏡物鏡臺(tái)上，100×的物鏡下進(jìn)行觀(guān)察和拍照，通過(guò)綠色熒光激發(fā)塊觀(guān)察，淀粉降解細(xì)菌呈現(xiàn)綠色熒光即為淀粉降解細(xì)菌。

優(yōu)選地，步驟(7)所述的明膠涂層載玻片按如下步驟處理：

(1)取7個(gè)載玻片架，將載玻片填滿(mǎn)于載玻片架中；在3.5L蒸餾水中加入4-5滴洗滌劑，放入載玻片架，煮沸10min；取出載玻片架，晾3min；用蒸餾水將洗滌劑沖洗干凈，將載玻片保持直立狀態(tài)晾干；

(2)在3.5L蒸餾水中加入2.5g的十二水硫酸鉀鉻和0.44g的明膠，加熱至60-80℃，待明膠基本溶解后放入載玻片架，恒溫10min；取出載玻片架，將載玻片斜立于試管架邊上干燥即得。

優(yōu)選地，步驟(4)所述將混勻的液體分三次分別倒入家用攪拌機(jī)攪拌打碎，每次3分鐘，然后將三次打碎后的混合液體轉(zhuǎn)入到無(wú)菌BioRad勻漿袋中，在BioRad勻漿器3檔勻漿3min，通過(guò)勻漿袋側(cè)邊的過(guò)濾格過(guò)濾，將濾液收集在無(wú)菌的50ml離心管中，5000g離心8min去除上清液，并將沉淀物放入2ml離心管中，重新懸浮于裝有pH4.0-9.0的滅菌1×PBS緩沖液中。

優(yōu)選地，步驟(4)所述的離心處理具體是4500g-5000g離心5-10min。

優(yōu)選地，步驟(6)所述的離心處理具體是4500g-5000g離心8-12min。

優(yōu)選地，步驟(6)所述的1×Tris-HCl緩沖液的體積與所取的細(xì)胞懸浮液體積相同；所用的BODIPY標(biāo)記的綠色熒光染液的體積與1×Tris-HCl緩沖液體積相同；電子傳遞鏈抑制劑的體積與1×Tris-HCl緩沖液體積相同。

本發(fā)明從煙葉烘烤和陳化過(guò)程中復(fù)雜的混合微生物群落中示蹤和標(biāo)定煙葉淀粉降解菌群，采用分子微生物生態(tài)學(xué)方法和手段即BODIPY淀粉酶(amylase)染色來(lái)標(biāo)定和追蹤原位狀態(tài)下煙葉淀粉降解菌。和以前的純培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明方法可以直接標(biāo)定和監(jiān)控?zé)熑~淀粉降解菌群對(duì)煙葉品質(zhì)以及對(duì)煙葉降解的生化過(guò)程的程度和速率的影響，較大地降低了勞動(dòng)強(qiáng)度，成本較低，操作過(guò)程簡(jiǎn)便，操作人員不需要特殊的培訓(xùn)，對(duì)采樣地點(diǎn)無(wú)特殊的要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤，能迅速提供給診斷人員相關(guān)的數(shù)據(jù)。

采用免培養(yǎng)的分子微生物生態(tài)學(xué)方法和手段即BODIPYα-淀粉酶(α-amylase)染色來(lái)標(biāo)定和追蹤原位狀態(tài)下煙葉表面附著的淀粉降解菌群以及它們的活性，不僅對(duì)于探測(cè)煙葉淀粉降解菌群的活性變化規(guī)律具有重要的意義，還能進(jìn)一步了解煙葉淀粉降解菌群在煙葉烘烤和陳化過(guò)程中的作用和功能，獲取原位狀態(tài)下煙葉淀粉降解菌群的組成和結(jié)構(gòu)的原位信息，了解淀粉降解菌群對(duì)不同品種、不同部位、不同成熟度檔次的煙葉淀粉含量變化規(guī)律的響應(yīng)。通過(guò)將該方法應(yīng)用在煙草發(fā)酵或加工過(guò)程中，可以控制和促進(jìn)煙葉淀粉降解菌群的活性，彌補(bǔ)煙葉因生長(zhǎng)或調(diào)制不當(dāng)造成的不足，從而達(dá)到改善煙葉吸味品質(zhì)的目的，同時(shí)也能大大縮短發(fā)酵過(guò)程，節(jié)約成本，大幅度提升經(jīng)濟(jì)效益。

本發(fā)明的所述方法可以應(yīng)用于烤煙不同品種、不同部位、不同成熟度檔次的煙葉，獲得在原位狀態(tài)下煙葉淀粉降解菌群的信息，還能迅速提供給技術(shù)人員相關(guān)的數(shù)據(jù)，弄清具體的煙葉發(fā)酵增香機(jī)理，可以更好地指導(dǎo)實(shí)踐、探索和完善煙葉處理的工藝措施和條件、拓寬創(chuàng)新煙葉發(fā)酵技術(shù)研究思路、積極開(kāi)展與之相關(guān)的新領(lǐng)域研究。

附圖說(shuō)明

附圖1為檢測(cè)煙葉中淀粉降解微生物的方法流程圖；

附圖2為煙葉表面微生物群落中綠色熒光淀粉染色陽(yáng)性淀粉降解微生物顯微照片示例，圖中A處指明的是在BODIPY DQ starch染色后煙葉表面附著的淀粉降解細(xì)菌，B處指明的是在煙葉被打碎后的植物組織。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書(shū)所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書(shū)中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀(guān)點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、分析化學(xué)技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。

實(shí)施例一：一種檢測(cè)煙葉中淀粉降解微生物的方法，步驟如下：

樣品收集：戴無(wú)菌手套、使用一次性的無(wú)菌收集袋隨機(jī)收集1kg烘烤或者陳化過(guò)程中的煙葉樣品，并保存于37℃恒溫條件下在20min內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品處理；

樣品處理：在實(shí)驗(yàn)室首先用濃度70％酒精消毒剪刀，無(wú)菌條件下，將煙葉樣品用消毒過(guò)的剪刀剪成1-4cm²小塊，并仔細(xì)除去煙葉的莖和葉脈等無(wú)用組織；

稀釋樣品：無(wú)菌條件下，用無(wú)菌的50ml燒杯稱(chēng)取30g新鮮的碎葉樣品，加入300ml樣品處理試劑A，與碎葉樣品混合均勻；

細(xì)胞分離：將混勻的液體分三次分別倒入飛利浦(PHILIPS)家用攪拌機(jī)攪拌打碎，每次3分鐘，然后將三次打碎后的混合液體轉(zhuǎn)入到無(wú)菌BioRad勻漿袋中，在BioRad勻漿器3檔勻漿3min，通過(guò)勻漿袋側(cè)邊的過(guò)濾格過(guò)濾，將濾液收集在無(wú)菌的50ml離心管中，5000g離心8min；去除上清液，并將沉淀物放入2ml離心管中，重新懸浮于2ml樣品處理試劑A中；

超聲波處理：將裝有混合液體的離心管固定，然后放入超聲波儀器中，在確保在超聲波處理時(shí)離心管不會(huì)移動(dòng)的前提下，用53000Hz的頻率處理60分鐘后取出待用。在等待下一步的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可將細(xì)胞懸浮液儲(chǔ)存于4℃的冰箱中；

淀粉降解微生物的標(biāo)定和示蹤：取400μL細(xì)胞懸浮液(從上一步中獲得)轉(zhuǎn)入到無(wú)菌的2mL eppendof離心管中，離心(4500g)10分鐘，去除上清液，加入400μL標(biāo)定示蹤試劑B1、200μL標(biāo)定示蹤試劑B2，并立即將混合液體轉(zhuǎn)入到無(wú)菌的10ml寬底血清瓶中，再加入電子傳遞鏈抑制劑C，將蓋子蓋好，并迅速用鋁箔包嚴(yán)避光；室溫?fù)u動(dòng)45min，速度保持在220rpm；無(wú)菌環(huán)境下吸取10μL反應(yīng)液均勻涂布于明膠涂層載玻片上，并在無(wú)菌環(huán)境中避光風(fēng)干；

顯微鏡觀(guān)察：將干燥好的載玻片置于熒光顯微鏡(萊卡DM6000B，配備萊卡DFC500數(shù)字照相機(jī))物鏡臺(tái)上，100×的物鏡下進(jìn)行觀(guān)察和拍照通過(guò)綠色熒光激發(fā)塊觀(guān)察，淀粉降解細(xì)菌呈現(xiàn)綠色熒光。

其中，所述明膠涂片按以下步驟進(jìn)行處理：

取7個(gè)載玻片架，將載玻片填滿(mǎn)于載玻片架中；在3.5L蒸餾水中加入4-5滴洗滌劑，放入載玻片架，煮沸10min；取出載玻片架，晾3min；用蒸餾水將洗滌劑沖洗干凈，將載玻片保持直立狀態(tài)晾干；

在3.5L蒸餾水中加入2.5g的十二水硫酸鉀鉻和0.44g的明膠，加熱至70℃左右，待明膠基本溶解后放入載玻片架，恒溫10min；取出載玻片架，將載玻片斜立于試管架邊上干燥即得。

其中，所述樣品處理試劑A為滅菌1×PBS緩沖液，pH＝6.0。

其中，所述標(biāo)定示蹤試劑B1、B2分別為滅菌Tris-HCl緩沖液(10mmol/L，pH 7.8)和滅菌BODIPY(氟化硼二吡咯類(lèi)熒光染料，boron-dipyrromethene)標(biāo)記的綠色熒光淀粉染液。

其中，所述電子傳遞鏈抑制劑C為總量為0.6ml的滅菌3mmol/L疊氮化鈉、2mmol/L氟乙酸鈉、4mmol/L碘代乙酰胺鈉混合溶液。

實(shí)施例二：一種檢測(cè)煙葉中淀粉降解微生物的方法，步驟如下：

樣品收集：戴無(wú)菌手套、使用一次性的無(wú)菌收集袋隨機(jī)收集1kg烘烤或者陳化過(guò)程中的煙葉樣品，并保存于30℃恒溫條件下在20min內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品處理；

樣品處理：在實(shí)驗(yàn)室首先用濃度70％酒精消毒剪刀，無(wú)菌條件下，將煙葉樣品用消毒過(guò)的剪刀剪成1-4cm²小塊，并仔細(xì)除去煙葉的莖和葉脈等無(wú)用組織；

稀釋樣品：無(wú)菌條件下，用無(wú)菌的50ml燒杯稱(chēng)取30g新鮮的碎葉樣品，加入600ml樣品處理試劑A，與碎葉樣品混合均勻；

細(xì)胞分離：將混勻的液體分三次分別倒入飛利浦(PHILIPS)家用攪拌機(jī)攪拌打碎，每次4分鐘，然后將三次打碎后的混合液體轉(zhuǎn)入到無(wú)菌BioRad勻漿袋中，在BioRad勻漿器3檔勻漿3min，通過(guò)勻漿袋側(cè)邊的過(guò)濾格過(guò)濾，將濾液收集在無(wú)菌的50ml離心管中，4500g離心10min；去除上清液，并將沉淀物放入2ml離心管中，重新懸浮于2ml樣品處理試劑A中；

超聲波處理：將裝有混合液體的離心管固定，然后放入超聲波儀器中，在確保在超聲波處理時(shí)離心管不會(huì)移動(dòng)的前提下，用73000Hz的頻率處理50分鐘后取出待用。在等待下一步的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可將細(xì)胞懸浮液儲(chǔ)存于4℃的冰箱中；

淀粉降解微生物的標(biāo)定和示蹤：取400μL細(xì)胞懸浮液(從上一步中獲得)轉(zhuǎn)入到無(wú)菌的2mL eppendof離心管中，離心(5000g)8分鐘，去除上清液，加入400μL標(biāo)定示蹤試劑B1、200μL標(biāo)定示蹤試劑B2，并立即將混合液體轉(zhuǎn)入到無(wú)菌的10ml寬底血清瓶中，再加入電子傳遞鏈抑制劑C，將蓋子蓋好，并迅速用鋁箔包嚴(yán)避光；室溫?fù)u動(dòng)60min，速度保持在280rpm；無(wú)菌環(huán)境下吸取10μL反應(yīng)液均勻涂布于明膠涂層載玻片上，并在無(wú)菌環(huán)境中避光風(fēng)干；

顯微鏡觀(guān)察：將干燥好的載玻片置于熒光顯微鏡(萊卡DM6000B，配備萊卡DFC500數(shù)字照相機(jī))物鏡臺(tái)上，100×的物鏡下進(jìn)行觀(guān)察和拍照通過(guò)綠色熒光激發(fā)塊觀(guān)察，淀粉降解細(xì)菌呈現(xiàn)綠色熒光。

其中，所述明膠涂片按以下步驟進(jìn)行處理：

取7個(gè)載玻片架，將載玻片填滿(mǎn)于載玻片架中；在3.5L蒸餾水中加入4-5滴洗滌劑，放入載玻片架，煮沸10min；取出載玻片架，晾3min；用蒸餾水將洗滌劑沖洗干凈，將載玻片保持直立狀態(tài)晾干；

在3.5L蒸餾水中加入2.5g的十二水硫酸鉀鉻和0.44g的明膠，加熱至60℃左右，待明膠基本溶解后放入載玻片架，恒溫10min；取出載玻片架，將載玻片斜立于試管架邊上干燥即得。

其中，所述樣品處理試劑A為滅菌1×PBS緩沖液，pH＝9.0。

其中，所述標(biāo)定示蹤試劑B1、B2分別為滅菌Tris-HCl緩沖液(10mmol/L，pH 7.8)和滅菌BODIPY(氟化硼二吡咯類(lèi)熒光染料，boron-dipyrromethene)標(biāo)記的綠色熒光淀粉染液。

其中，所述電子傳遞鏈抑制劑C為總量為0.6ml的滅菌3mmol/L疊氮化鈉、2mmol/L氟乙酸鈉、4mmol/L碘代乙酰胺鈉混合溶液。

實(shí)施例三：一種檢測(cè)煙葉中淀粉降解微生物的方法，步驟如下：

樣品收集：戴無(wú)菌手套、使用一次性的無(wú)菌收集袋隨機(jī)收集1kg烘烤或者陳化過(guò)程中的煙葉樣品，并保存于25℃恒溫條件下在20min內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品處理；

樣品處理：在實(shí)驗(yàn)室首先用濃度70％酒精消毒剪刀，無(wú)菌條件下，將煙葉樣品用消毒過(guò)的剪刀剪成1-4cm²小塊，并仔細(xì)除去煙葉的莖和葉脈等無(wú)用組織；

稀釋樣品：無(wú)菌條件下，用無(wú)菌的50ml燒杯稱(chēng)取50g新鮮的碎葉樣品，加入1000ml樣品處理試劑A，與碎葉樣品混合均勻；

細(xì)胞分離：將混勻的液體分三次分別倒入飛利浦(PHILIPS)家用攪拌機(jī)攪拌打碎，每次5分鐘，然后將三次打碎后的混合液體轉(zhuǎn)入到無(wú)菌BioRad勻漿袋中，在BioRad勻漿器3檔勻漿5min，通過(guò)勻漿袋側(cè)邊的過(guò)濾格過(guò)濾，將濾液收集在無(wú)菌的50ml離心管中，5000g離心10min；去除上清液，并將沉淀物放入2ml離心管中，重新懸浮于2ml樣品處理試劑A中；

超聲波處理：將裝有混合液體的離心管固定，然后放入超聲波儀器中，在確保在超聲波處理時(shí)離心管不會(huì)移動(dòng)的前提下，用80000Hz的頻率處理120分鐘后取出待用。在等待下一步的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可將細(xì)胞懸浮液儲(chǔ)存于4℃的冰箱中；

淀粉降解微生物的標(biāo)定和示蹤：取400μL細(xì)胞懸浮液(從上一步中獲得)轉(zhuǎn)入到無(wú)菌的2mL eppendof離心管中，離心(5000g)12分鐘，去除上清液，加入400μL標(biāo)定示蹤試劑B1、200μL標(biāo)定示蹤試劑B2，并立即將混合液體轉(zhuǎn)入到無(wú)菌的10ml寬底血清瓶中，再加入電子傳遞鏈抑制劑C，將蓋子蓋好，并迅速用鋁箔包嚴(yán)避光；室溫?fù)u動(dòng)90min，速度保持在300rpm；無(wú)菌環(huán)境下吸取10μL反應(yīng)液均勻涂布于明膠涂層載玻片上，并在無(wú)菌環(huán)境中避光風(fēng)干；

顯微鏡觀(guān)察：將干燥好的載玻片置于熒光顯微鏡(萊卡DM6000B，配備萊卡DFC500數(shù)字照相機(jī))物鏡臺(tái)上，100×的物鏡下進(jìn)行觀(guān)察和拍照通過(guò)綠色熒光激發(fā)塊觀(guān)察，淀粉降解細(xì)菌呈現(xiàn)綠色熒光。

其中，所述明膠涂片按以下步驟進(jìn)行處理：

取7個(gè)載玻片架，將載玻片填滿(mǎn)于載玻片架中；在3.5L蒸餾水中加入4-5滴洗滌劑，放入載玻片架，煮沸10min；取出載玻片架，晾3min；用蒸餾水將洗滌劑沖洗干凈，將載玻片保持直立狀態(tài)晾干；

在3.5L蒸餾水中加入2.5g的十二水硫酸鉀鉻和0.44g的明膠，加熱至80℃左右，待明膠基本溶解后放入載玻片架，恒溫10min；取出載玻片架，將載玻片斜立于試管架邊上干燥即得。

其中，所述樣品處理試劑A為滅菌1×PBS緩沖液，pH＝5.0。

其中，所述標(biāo)定示蹤試劑B1、B2分別為滅菌Tris-HCl緩沖液(10mmol/L，pH 7.8)和滅菌BODIPY(氟化硼二吡咯類(lèi)熒光染料，boron-dipyrromethene)標(biāo)記的綠色熒光淀粉染液。

其中，所述電子傳遞鏈抑制劑C為總量為0.6ml的滅菌3mmol/L疊氮化鈉、2mmol/L氟乙酸鈉、4mmol/L碘代乙酰胺鈉混合溶液。

以上僅是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例，對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍不構(gòu)成任何限制。凡采用等同變換或者等效替換而形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明權(quán)利保護(hù)范圍之內(nèi)。