本發(fā)明屬于農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)染體系技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)觀音蓮高效轉(zhuǎn)染體系的方法。

背景技術(shù)：

觀音蓮(Sempervivum tectorum)，景天科長生草屬多肉植物，也叫做長生草、觀音座蓮、佛座蓮。原產(chǎn)于西班牙、法國、意大利等歐洲國家的山區(qū)，屬于高山多肉植物。是一種以觀葉為主的小型多肉植物，也是銷量比較大的多肉植物之一，中國各地都很普及。是多肉植物中最常見的品種之一堪稱普貨之王。觀音蓮肉如其名，葉片蓮座狀環(huán)生，其株形端莊，猶如一朵盛開的蓮花。葉片扁平細(xì)長，葉端漸尖，葉緣有小絨毛，充分光照下，葉端形成非常漂亮咖啡色或紫紅色；若光照不充足，則葉端只為深綠色。其品種很多，葉盤直徑從3-15厘米都有，發(fā)育良好的植株在大蓮座下面會著生一圈小蓮座，此外每年的春末還會從葉叢下部抽出類似吊蘭的紅色走莖，走莖前端長有蓮座狀小葉叢。長生草的小花呈星狀，粉紅色。觀音蓮葉色富于變化，紫紅色的葉尖極為別致，適合做中小型盆栽或組合盆栽，用不同造型的花盆栽種，其觀賞效果也相差很大，用卡通型的花盆栽種，活潑可愛，深受孩子們的歡迎；用紫砂盆或青花瓷器盆種植，端莊大方，頗受中老年人的青睞；而栽于木質(zhì)的小花盆，時尚自然，很受年輕人的喜愛。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)目前廣泛應(yīng)用于植物基因工程研究。根癌農(nóng)桿菌中含Ti質(zhì)粒，該質(zhì)粒的部分DNA片段可整合到宿主細(xì)胞中，從而整合到植物的基因組中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法同其他方法相比具有以下優(yōu)點：轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化效果好，可轉(zhuǎn)移大片段DNA；轉(zhuǎn)移的外援基因成為單拷貝；遺傳穩(wěn)定，并且多數(shù)符合孟德爾遺傳定律；價格低廉。

目前在觀音蓮生產(chǎn)中還沒有使用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化的報道，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)觀音蓮轉(zhuǎn)化，可以使觀音蓮快速獲得目的性狀，而且可以突破觀音蓮自身遺傳屏障，獲得難以通過傳統(tǒng)育種方式生產(chǎn)的新品種。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)觀音蓮高效轉(zhuǎn)染體系的方法，本發(fā)明使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)觀音蓮轉(zhuǎn)化，打通觀音蓮農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)染體系，這是通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染體系培育新型觀音蓮最為重要的一步。建立觀音蓮農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)染體系意味著能夠突破觀音蓮自身遺傳屏障，獲得難以通過傳統(tǒng)育種方式生產(chǎn)的新品種。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)觀音蓮高效轉(zhuǎn)染體系的方法，所述方法包括以下步驟：

侵染和共培養(yǎng)階段：將觀音蓮無菌苗葉片切成小塊放入三角瓶中，加入菌液，瓶口密封，真空條件下侵染，侵染后倒去菌液，將葉片晾干，轉(zhuǎn)接到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)；

所述侵染條件如下：真空度為0.2～1.0Kpa，侵染時間為12～48h；所述共培養(yǎng)條件如下：所述共培養(yǎng)為暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20～28℃，培養(yǎng)時間為3～7天。

所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為：SH基礎(chǔ)配方+2,4-D 0.20～0.30mg·L^-1+NAA1.0～5.0mg·L^-1+6-BA1.0～5.0mg·L^-1+KT 0.1～1.0mg·L^-1+GA3 0.1～1.0mg·L^-1+蔗糖10～30g·L^-1+葡萄糖5～15g·L^-1+瓊脂5.0～10.0g·L^-1+AS 100～200μmol·L^-1，pH5.2～6.0，118～125℃滅菌20～30min；

SH基礎(chǔ)配方：硝酸鉀2～5.0g·L^-1，硫酸鎂0.1～0.4g·L^-1，磷酸二氫銨0.3～0.6g·L^-1，氯化鈣150～300mg·L^-1，甘氨酸2～4mg·L^-1，肌醇100～200mg·L^-1，鹽酸硫胺素0.4～0.8mg·L^-1，鹽酸吡哆素0.5～1.0mg·L^-1，煙酸0.5～1.0mg·L^-1，乙二胺四乙酸鐵納10～40mg·L^-1，六水氯化鈷0.1～0.2mg·L^-1，五水硫酸銅0.2～0.4mg·L^-1，硼酸5～10mg·L^-1，碘化鉀1～2mg·L^-1，一水硫酸錳10～20mg·L^-1，二水鉬酸鈉0.1～0.2mg·L^-1，七水硫酸鋅1～2mg·L^-1。

篩選階段：將共培養(yǎng)獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行兩次篩選培養(yǎng)得到幼芽；

進(jìn)一步地，共培養(yǎng)獲得的愈傷組織在延遲篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行延遲篩選培養(yǎng)，培養(yǎng)10～15天后，更換篩選培基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，培養(yǎng)20～30天得到幼芽；

所述延遲篩選培養(yǎng)基成分如下：SH基礎(chǔ)配方+2.4-D 0.2～0.3mg·L^-1+NAA1.0～5.0mg·L^-1+6-BA 1.0～5.0mg·L^-1+KT 0.1～1.0mg·L^-1+GA₃ 0.1～1.0mg·L^-1+蔗糖10～50g·L^-1+瓊脂5～10g·L^-1+cef 100～500mg·L^-1+carb 100～500mg·L^-1，pH5.2～6.0，118～125℃高壓滅菌20～30min；

篩選培養(yǎng)基成分如下：SH基礎(chǔ)配方+2,4-D 0.2～3.0mg·L^-1+NAA 1.0～5.0mg·L^-1+6-BA 1.0～5.0mg·L^-1+KT 0.1～1.0mg·L^-1+GA3 0.1～1.0mg·L^-1+蔗糖10～50g·L^-1+瓊脂5～10g·L^-1+cef 100～500mg·L^-1+carb 100～500mg·L^-1+Hyg 5～20mg·L^-1，pH 5.2～6.0，118～125℃高壓滅菌20～30min；

所述延遲篩選培養(yǎng)與篩選培養(yǎng)條件如下：22～28℃光照培養(yǎng)，每天光照12～16h，光照強(qiáng)度1500～2500lx。

抗性苗培養(yǎng)階段：將獲得的幼芽轉(zhuǎn)接到抗性苗培養(yǎng)基培養(yǎng)得到抗性苗；

進(jìn)一步地，幼芽在抗性苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～25天后更換一次抗性苗培養(yǎng)基加速抗性苗生長；

所述抗性苗培養(yǎng)基成分如下：SH基礎(chǔ)配方+蔗糖10～50g·L^-1+瓊脂5～10g·L^-1+cef 100～500mg·L^-1+carb 100～500mg·L^-1，pH 5.2～6.0，118～125℃高壓滅菌20～30min。

抗性苗培養(yǎng)條件如下：22～28℃光照培養(yǎng)7～8周，光照強(qiáng)度為1500～2500lx，光照時間為12～16h/天。

陽性苗檢測階段：取獲得的抗性苗的葉片，提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，得到農(nóng)桿菌成功侵染觀音蓮的陽性苗，建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)觀音蓮高效轉(zhuǎn)染體系。

無菌苗獲得階段將觀音蓮腋芽消毒滅菌后將葉片撕下切為兩段接種于誘導(dǎo)直接分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得愈傷組織，更換一次誘導(dǎo)直接分化培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得小芽，將小芽移至基礎(chǔ)培養(yǎng)基獲得無菌苗；

所述觀音蓮腋芽消毒殺菌過程如下：剪取大棚種植的觀音蓮植株上的腋芽，使用無菌水沖洗5～12次，75％酒精浸泡1～3min，無菌水洗5～12次，在0.1～0.5％升汞中浸泡5～15min，無菌水洗5～15次，無菌濾紙上晾干；

進(jìn)一步地，可以根據(jù)需要進(jìn)行擴(kuò)繁，無菌苗擴(kuò)繁階段：將無菌苗獲得階段萌發(fā)長到3～5cm的無菌苗的葉片切為兩段接種到誘導(dǎo)直接分化培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得愈傷組織后更換一次誘導(dǎo)直接分化培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得小芽，將小芽移至基礎(chǔ)培養(yǎng)基擴(kuò)繁得到無菌苗；

所述誘導(dǎo)直接分化培養(yǎng)基的成分如下：SH基礎(chǔ)配方+2,4-D 0.10～1mg·L^-1+NAA 0.5～5.0mg·L^-1+6-BA 0.5～5.0mg·L^-1+KT 0.1～1.0mg·L^-1+GA3 0.1～1.0mg·L^-1+蔗糖10.0～50.0g·L^-1+瓊脂5.0～10.0g·L^-1，pH 5.2～6.0，118～125℃高壓滅菌20～30min。

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，具體成分如下：硝酸鉀1.0～5.0g·L^-1，硝酸銨2.5～5.0g·L^-1，硫酸鎂0.195～0.4g·L^-1，磷酸二氫鉀0.1～0.3g·L^-1，氯化鈣150～500mg·L^-1，甘氨酸2～4mg·L^-1，肌醇100～200mg·L^-1，鹽酸硫胺素0.1～0.4mg·L^-1，鹽酸吡哆素0.5～1.0mg·L^-1，煙酸0.5～1.0mg·L^-1，乙二胺四乙酸納19.8～40mg·L^-1，七水硫酸亞鐵27.8～40mg·L^-1，六水氯化鈷0.025～0.1mg·L^-1，五水硫酸銅0.025～0.1mg·L^-1，硼酸5～10mg·L^-1，碘化鉀0.5～2mg·L^-1，四水硫酸錳22.3～30mg·L^-1，二水鉬酸鈉0.25～0.3mg·L^-1，七水硫酸鋅8～10mg·L^-1。

所述無菌苗獲得階段培養(yǎng)條件為：22～28℃光照培養(yǎng)，每天光照12～16h，光照強(qiáng)度1500～2500lx，培養(yǎng)25～30天獲得愈傷組織，更換培養(yǎng)基后培養(yǎng)25～30天獲得小芽；

農(nóng)桿菌菌液制備：將農(nóng)桿菌加入到添加有40～65mg/L卡那霉素和40～70mg/L利福平的YM培養(yǎng)基中，2000～4000r/min，4～8℃離心10～20min，棄上清，下層加入重懸液使OD值達(dá)到0.4～0.8，最后向菌液中加入AS，終濃度為100～200μmol·L^-1，混勻備用；

所述YM培養(yǎng)基成分如下：蛋白胨5-20g/L，酵母提取物5-10g/L，氯化鈉5-20g/L，農(nóng)桿菌在YM培養(yǎng)基中培養(yǎng)條件如下：26～32℃培養(yǎng)12～24h；

所述重懸液成分如下為：SH基礎(chǔ)配方+瓊脂5.8～8g·L^-1+蔗糖30～60g·L^-1，pH5.2～5.8，118～125℃高溫滅菌20～30min。

農(nóng)桿菌植物轉(zhuǎn)化雖然比較常見，但一般都針對水稻等谷物植物；由于觀音蓮的基因屏障作用較強(qiáng)，農(nóng)桿菌很難侵染到觀音蓮基因中，因此其他植物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法對觀音蓮的借鑒意義很小。

以觀音蓮為模型的研究平臺，建立觀音蓮的組織培養(yǎng)體系以及轉(zhuǎn)基因體系的重點在于共培養(yǎng)、篩選和抗性苗培養(yǎng)等過程。而共培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、以及抗性苗培養(yǎng)基中加入的激素種類及組合、激素添加量以及培養(yǎng)時間，都有不可預(yù)知、不可控的結(jié)果。根據(jù)研究，發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明提供的侵染條件下容易打破其基因屏障，農(nóng)桿菌能夠成功介導(dǎo)觀音蓮，且本發(fā)明采用的激素配方以及培養(yǎng)時間比較適合侵染后的觀音蓮共培養(yǎng)、篩選等，愈傷組織形成頻率較高。

本發(fā)明通過對共培養(yǎng)、篩選和抗性苗培養(yǎng)步驟的不斷探索，摸索出最佳培養(yǎng)條件，成功打通觀音蓮農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)染體系，可以滿足觀音蓮育種需求，適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)和商業(yè)育種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明中建立了高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)觀音蓮轉(zhuǎn)化的方法，可以滿足觀音蓮育種需求，適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)和商業(yè)育種。

附圖說明

圖1為實施例1觀音蓮潮霉素轉(zhuǎn)化陽性苗PCR擴(kuò)增后的凝膠電泳圖；

圖2為實施例2觀音蓮潮霉素轉(zhuǎn)化陽性苗PCR擴(kuò)增后的凝膠電泳圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)說明。

中英文對照

SH：SH培養(yǎng)基；

MS：MS培養(yǎng)基；

6-BA：6-芐氨基腺嘌呤；

NAA：a-萘乙酸

AS：乙酰丁香酮；

Hyg：潮霉素；

Cef：頭孢霉素；

Carb：羧芐青霉素；

2,4-D：2,4-二氯苯氧乙酸；

GA3：赤霉素

KT：激動素(6-糖基氨基嘌呤)

實施例1：觀音蓮誘導(dǎo)愈傷及農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)染

步驟1獲得無菌苗階段：將觀音蓮腋芽置于無菌水中沖洗6次，倒去無菌水，加入75％乙醇，搖晃60s，倒出乙醇，無菌水清洗6次，倒出無菌水，加入0.1％升汞，浸泡6min，倒出升汞并回收，無菌水清洗腋芽6次，把腋芽放在濾紙上吹干。將觀音蓮腋芽葉片撕下切為兩段接種于誘導(dǎo)直接分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得愈傷組織，更換一次誘導(dǎo)直接分化培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得小芽，將小芽移至基礎(chǔ)培養(yǎng)基獲得無菌苗；培養(yǎng)條件為：22～26℃光照培養(yǎng)，每天光照12h，光照強(qiáng)度1500～2000lx，培養(yǎng)時間為培養(yǎng)30天獲得愈傷組織，更換培養(yǎng)基后培養(yǎng)25天獲得小芽。

所述誘導(dǎo)直接分化培養(yǎng)基的成分如下SH基礎(chǔ)配方+2.4-D 0.25mg·L^-1+NAA2.0mg·L^-1+6-BA 2.0mg·L^-1+KT 0.5mg·L^-1+GA₃ 0.5mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂8g·L^-1，pH 5.8，118℃高壓滅菌20min；

SH基礎(chǔ)配方：硝酸鉀2g·L^-1，硫酸鎂0.1·L^-1，磷酸二氫銨0.3g·L^-1，氯化鈣150mg·L^-1，甘氨酸2mg·L^-1，肌醇100mg·L^-1，鹽酸硫胺素0.4mg·L^-1，鹽酸吡哆素0.5mg·L^-1，煙酸0.5mg·L^-1，乙二胺四乙酸鐵納10mg·L^-1，六水氯化鈷0.1mg·L^-1，五水硫酸銅0.2mg·L^-1，硼酸5mg·L^-1，碘化鉀1mg·L^-1，一水硫酸錳10mg·L^-1，二水鉬酸鈉0.1mg·L^-1，七水硫酸鋅1mg·L^-1；以下步驟也采用該配方。

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，具體成分如下：硝酸鉀1.9g·L^-1，硝酸銨1.65g·L^-1，硫酸鎂0.37g·L^-1，磷酸二氫鉀0.17g·L^-1，氯化鈣440mg·L^-1，甘氨酸2mg·L^-1，肌醇100mg·L^-1，鹽酸硫胺素0.4mg·L^-1，鹽酸吡哆素0.5mg·L^-1，煙酸0.5mg·L^-1，乙二胺四乙酸納37.25mg·L^-1，七水硫酸亞鐵27.85mg·L^-1，六水氯化鈷0.025mg·L^-1，五水硫酸銅0.025mg·L^-1，硼酸6.2mg·L^-1，碘化鉀0.83mg·L^-1，四水硫酸錳22.3mg·L^-1，二水鉬酸鈉0.25mg·L^-1，七水硫酸鋅8.6mg·L^-1；以下步驟也采用該配方。

步驟2無菌苗擴(kuò)繁階段：將步驟(1)中萌發(fā)長到3～5cm的無菌苗的葉片切為兩段接種到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得愈傷組織后更換一次誘導(dǎo)直接分化培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得小芽，將小芽移至基礎(chǔ)培養(yǎng)基獲得無菌苗；

所述誘導(dǎo)直接分化培養(yǎng)基的成分如下：SH基礎(chǔ)配方+2.4-D 0.25mg·L^-1+NAA 2.0mg·L^-1+6-BA 2.0mg·L^-1+KT 0.5mg·L^-1+GA₃ 0.5mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂8g·L^-1，pH 5.8，118℃高壓滅菌20min；

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，成分同步驟1。

步驟3農(nóng)桿菌準(zhǔn)備階段：將導(dǎo)入植物雙元載體PCAMBIA1300的農(nóng)桿菌加入到添加有40mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的抗生素的YM培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速100r/min，28℃培養(yǎng)12h，之后把菌液放入離心機(jī)，2000r/min，4℃離心10min，倒掉上清液，加入重懸液使OD值達(dá)到0.4；重懸液為SH基礎(chǔ)配方+蔗糖30g·L^-1，pH5.2，120℃高溫滅菌20min。最后向菌液中加入100μmol·L^-1AS，混勻備用；

YM培養(yǎng)基成分：蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L。

所述重懸液成分如下為：SH基礎(chǔ)配方+瓊脂5.8～8g·L^-1+蔗糖30～60g·L^-1，pH5.2～5.8，118～125℃高溫滅菌20～30min。

步驟4侵染和共培養(yǎng)階段：將步驟2中獲得的無菌苗葉片切成5mm²左右的葉片塊，放入100mL三角瓶中約600～800塊葉片塊，向三角瓶中倒入適量步驟3獲得的菌液，套上封口膜并用橡筋勒緊，抽真空到0.5kPa，保持1.5h，倒去菌液，將葉片晾干，轉(zhuǎn)接到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(SH基礎(chǔ)配方(同步驟1)+2,4-D 0.2mg·L^-1+NAA 2.0mg·L^-1+6-BA 2mg·L^-1+KT 0.5mg·L^-1+GA₃ 0.5mg·L^-1+蔗糖15g·L^-1+葡萄糖10g·L^-1+瓊脂5.8g·L^-1+AS 100μmol·L^-1，pH 5.2，118℃滅菌25min，22～26℃暗培養(yǎng)。

步驟5篩選階段：在共培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3天后，將步驟4中獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)接到延遲篩選培養(yǎng)基(SH基礎(chǔ)配方(同步驟1)+2.4-D 0.25mg·L^-1+NAA2.0mg·L^-1+6-BA 2.0mg·L^-1+KT 0.5mg·L^-1+GA₃ 0.5mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂8g·L^-1+cef 250mg·L^-1+carb 250mg·L^-1，pH 5.8，120℃高壓滅菌20min)，22～26℃光照培養(yǎng)，每天光照12h，光照強(qiáng)度1500～2000lx。延遲篩選培養(yǎng)10天后，更換篩選培養(yǎng)基(SH+2.4-D 0.25mg·L^-1+NAA 2.0mg·L^-1+6-BA 2.0mg·L^-1+KT 0.5mg·L^-1+GA₃ 0.5mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+瓊脂8g·L^-1+cef 250mg·L^-1+carb 250mg·L^-1+Hyg 5mg·L^-1，pH 5.8，120℃高壓滅菌20min)，篩選培養(yǎng)條件如下：22～26℃光照培養(yǎng)，每天光照12h，光照強(qiáng)度1500～2000lx；

步驟6生根階段：將步驟(5)獲得的幼芽轉(zhuǎn)接到抗性苗培養(yǎng)基培養(yǎng)20天得到抗性苗，更換一次抗性苗培養(yǎng)基加速抗性苗生長；培養(yǎng)條件為22～25℃光照培養(yǎng)8周，光照強(qiáng)度為1800～2000lx，光照時間為12h/天。

所述抗性苗培養(yǎng)基成分如下：SH基礎(chǔ)配方+蔗糖30g·L^-1+瓊脂8g·L^-1+cef250mg·L^-1+carb 250mg·L^-1，pH 5.8，120℃高壓滅菌20min。

步驟7陽性檢測階段：在抗性苗培養(yǎng)基培養(yǎng)約7周后，將步驟6獲得的抗性苗取葉片，提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，確定是否存在陽性條帶，確定陽性苗。

PCR擴(kuò)增條件：

其中2c-3c-4c循環(huán)30次。

電泳條件：電壓100v，電流100mA

本發(fā)明檢測的抗性植株對于潮霉素具有一定的抗性，證明導(dǎo)入的潮霉素抗性基因已經(jīng)表達(dá)。

凝膠電泳圖參考圖1，9號，26號，43號泳道為標(biāo)記DNA(DL2000marker)；51號泳道是陰性對照，50號泳道是潮霉素基因PCR陽性對照；1號，2號，3號，5號，6號，10號，11號，12號，13號，14號，15號，16號，20號，21號，22號，23號，24號，25號，27號，28號，30號，32號，33號，34號，35號，36號，37號，39號，40號，41號，42號，45號，46號，47號，48號，49號，共計36個泳道獲得與陽性對照相同的電泳條帶，證明為陽性植株。

實施例1中愈傷組織形成頻率為70％，愈傷組織分化率在89.7％，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)14.3％，如表1、表2和表3所示。

表1

表2

表3

實施例2：觀音蓮誘導(dǎo)愈傷及農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)染

步驟1獲得無菌苗階段：將觀音蓮腋芽置于無菌水中沖洗10次，倒去無菌水，加入75％乙醇，搖晃300s，倒出乙醇，無菌水清洗10次，倒出無菌水，加入0.5％升汞，浸泡15min，倒出升汞并回收，無菌水清洗腋芽10次，把腋芽放在濾紙上吹干。將觀音蓮腋芽葉片撕下切為兩段接種于誘導(dǎo)直接分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得愈傷組織，更換一次誘導(dǎo)直接分化培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得小芽，將小芽移至基礎(chǔ)培養(yǎng)基獲得無菌苗；培養(yǎng)條件為：26～28℃光照培養(yǎng)，每天光照15h，光照強(qiáng)度2000～2500lx，培養(yǎng)時間為培養(yǎng)30天獲得愈傷組織，更換培養(yǎng)基后培養(yǎng)25～30天獲得小芽。

所述誘導(dǎo)直接分化培養(yǎng)基的成分如下SH基礎(chǔ)配方+2.4-D 0.3mg·L^-1+NAA2.5mg·L^-1+6-BA2.5mg·L^-1+KT 1mg·L^-1+GA₃ 1mg·L^-1+蔗糖50g·L^-1+瓊脂5.8g·L^-1，pH 5.2，120℃高壓滅菌25min；

SH基礎(chǔ)配方：硝酸鉀4.0g·L^-1，硫酸鎂0.3g·L^-1，磷酸二氫銨0.5g·L^-1，氯化鈣250mg·L^-1，甘氨酸4mg·L^-1，肌醇180mg·L^-1，鹽酸硫胺素0.75mg·L^-1，鹽酸吡哆素1.0mg·L^-1，煙酸1.0mg·L^-1，乙二胺四乙酸鐵納35mg·L^-1，六水氯化鈷0.2mg·L^-1，五水硫酸銅0.4mg·L^-1，硼酸10mg·L^-1，碘化鉀2mg·L^-1，一水硫酸錳18mg·L^-1，二水鉬酸鈉0.2mg·L^-1，七水硫酸鋅2mg·L^-1；以下步驟也采用該配方。

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，具體成分如下：硝酸鉀2.5g·L^-1，硝酸銨3.5g·L^-1，硫酸鎂0.195g·L^-1，磷酸二氫鉀0.25g·L^-1，氯化鈣500mg·L^-1，甘氨酸3.0mg·L^-1，肌醇150mg·L^-1，鹽酸硫胺素0.3mg·L^-1，鹽酸吡哆素1.0mg·L^-1，煙酸1.0mg·L^-1，乙二胺四乙酸納40.0mg·L^-1，七水硫酸亞鐵30.0mg·L^-1，六水氯化鈷0.05mg·L^-1，五水硫酸銅0.05mg·L^-1，硼酸7.0mg·L^-1，碘化鉀1.0mg·L^-1，四水硫酸錳23mg·L^-1，二水鉬酸鈉0.3mg·L^-1，七水硫酸鋅9mg·L^-1；以下步驟也采用該配方。

步驟2無菌苗擴(kuò)繁階段：將步驟(1)中萌發(fā)長到3～5cm的無菌苗的葉片切為兩段接種到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得愈傷組織后更換一次誘導(dǎo)直接分化培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得小芽，將小芽移至基礎(chǔ)培養(yǎng)基獲得無菌苗；

所述誘導(dǎo)直接分化培養(yǎng)基的成分如下SH基礎(chǔ)配方+2.4-D 0.5mg·L^-1+NAA3.0mg·L^-1+6-BA3.0mg·L^-1+KT 1.0mg·L^-1+GA₃ 1.0mg·L^-1+蔗糖50g·L^-1+瓊脂5.8g·L^-1，pH 5.8，118℃高壓滅菌20min；

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，成分同步驟1。

步驟3農(nóng)桿菌準(zhǔn)備階段：將導(dǎo)入植物雙元載體PCAMBIA1300的農(nóng)桿菌加入到添加有60mg/L卡那霉素和65mg/L利福平的抗生素的YM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速200r/min，28℃培養(yǎng)過夜，之后把菌液放入離心機(jī)，4000r/min，4℃離心15min，倒掉上清液，加入重懸液使OD值達(dá)到0.75；重懸液為SH基礎(chǔ)配方+蔗糖50g·L^-1，pH5.6，125℃高溫滅菌30min。最后向菌液中加入200μmol·L^-1AS，混勻備用；

YM培養(yǎng)基成分：蛋白胨15g/L，酵母提取物10g/L，氯化鈉20g/L；

步驟4侵染和共培養(yǎng)階段：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)70天后，將步驟2中獲得的無菌苗切成7mm²左右的葉片塊，放入100mL三角瓶中約400塊葉片塊，向三角瓶中倒入適量步驟3獲得的菌液，套上封口膜并用橡筋勒緊，抽真空到0.8kPa，保持2h，倒去菌液，將葉片晾干，轉(zhuǎn)接到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(SH基礎(chǔ)配方(同步驟1)+2,4-D 0.3mg·L^-1+NAA3.0mg·L^-1+6-BA3mg·L^-1+KT 1mg·L^-1+GA₃1mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+葡萄糖15g·L^-1+瓊脂8g·L^-1+AS 200μmol·L^-1，pH 5.8，120℃滅菌25min，26～28℃暗培養(yǎng)。

步驟5篩選階段：在共培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3天后，將步驟4中獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)接到延遲篩選培養(yǎng)基(SH基礎(chǔ)配方(同步驟1)+2.4-D 0.3mg·L^-1+NAA3.0mg·L^-1+6-BA3.0mg·L^-1+KT 1.0mg·L^-1+GA₃ 1.0mg·L^-1+蔗糖50g·L^-1+瓊脂5.8g·L^-1+cef 300mg·L^-1+carb 300mg·L^-1，pH 5.2，125℃高壓滅菌25min)，26～28℃光照培養(yǎng)，每天光照15h，光照強(qiáng)度2000～2500lx。延遲篩選培養(yǎng)15天后，更換篩選培養(yǎng)基(SH基礎(chǔ)配方(同步驟1)+2.4-D 0.3mg·L^-1+NAA3.0mg·L^-1+6-BA3.0mg·L^-1+KT 1.0mg·L^-1+GA₃ 1.0mg·L^-1+蔗糖50g·L^-1+瓊脂5.8g·L^-1+cef 300mg·L^-1+carb 300mg·L^-1+Hyg 10mg·L^-1，pH 5.2，125℃高壓滅菌25min)，篩選培養(yǎng)條件如下：26～28℃光照培養(yǎng)，每天光照15h，光照強(qiáng)度2000～2500lx；

步驟6生根階段：將步驟(5)獲得的幼芽轉(zhuǎn)接到抗性苗培養(yǎng)基培養(yǎng)25天得到抗性苗，更換一次抗性苗培養(yǎng)基加速抗性苗生長；培養(yǎng)條件為26～28℃光照培養(yǎng)7周，光照強(qiáng)度為2000～2500lx，光照時間為15h/天。

所述抗性苗培養(yǎng)基成分如下：SH基礎(chǔ)配方+蔗糖50g·L^-1+瓊脂5.8g·L^-1+cef300mg·L^-1+carb 300mg·L^-1，pH 5.2，125℃高壓滅菌25min。

步驟7陽性檢測階段：在抗性苗培養(yǎng)基培養(yǎng)約8周后，將步驟6獲得的抗性苗取葉片，提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，確定是否存在陽性條帶，確定陽性苗。

PCR擴(kuò)增條件：

其中2c-3c-4c循環(huán)30次。

電泳條件：電壓100v，電流100mA

本發(fā)明檢測的抗性植株對于潮霉素具有一定的抗性，證明導(dǎo)入的潮霉素抗性基因已經(jīng)表達(dá)。

凝膠電泳圖參考圖2，9號，26號，43號泳道為DL2000marker；50號泳道為陽性對照；51號泳道為陰性對照；1號，2號，3號，6號，8號，10號，11號，16號，17號，18號，20號，21號，23號，27號，28號，30號，31號，36號，37號，40號，42號，46號，47號，49號泳道為陽性，共計24個泳道獲得與陽性對照相同的電泳條帶，證明為陽性植株。

實施例2中愈傷組織形成頻率為73％，愈傷組織分化率在91.2％，轉(zhuǎn)化效率高達(dá)13.5％，如表4、表5和表6所示。

表4

表5

表6

篩選之后分化所得的陽性苗經(jīng)過如上驗證，證實了本發(fā)明中通過農(nóng)桿菌遺傳介導(dǎo)的方法能將外源基因引入觀音蓮基因組。因此，采用此方法進(jìn)行觀音蓮的誘導(dǎo)愈傷及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)染，可以使觀音蓮快速獲得目的性狀，而且可以突破觀音蓮自身遺傳屏障，獲得難以通過傳統(tǒng)育種方式生產(chǎn)的新品種。

實施例3

分別改變侵染條件、共培養(yǎng)條件，具體結(jié)果如表7、表8所示。

表7

由表7可知：本發(fā)明提供的侵染條件和共培養(yǎng)條件容易打破觀音蓮基因屏障，農(nóng)桿菌成功介導(dǎo)豆瓣綠轉(zhuǎn)化體系，且轉(zhuǎn)化率相對較高。

分別改變農(nóng)桿菌重懸液條件、篩選條件，具體結(jié)果如表8所示。

表8

由表8可知：本發(fā)明提供的農(nóng)桿菌重懸液條件和篩選條件容易比較好，且轉(zhuǎn)化率相對較高。