本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種IL-9的抗原表位肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：IL-9是1988年首次在Th細(xì)胞上清中分泌得到的細(xì)胞因子，主要由新型效應(yīng)Th9細(xì)胞分泌，此外，Th2、Th17等細(xì)胞也能分泌。成熟的IL-9是由144個(gè)氨基酸和一段18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽構(gòu)成的分子量大小為14000的糖蛋白。IL-9參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程，由于不同疾病微環(huán)境的不同，IL-9在不同疾病中起促進(jìn)或者抑制的作用。在自身免疫性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-9參與疾病炎癥進(jìn)展過程；研究發(fā)現(xiàn)在自身免疫性結(jié)腸炎患者病理組織中IL-9mRNA較健康對(duì)照組升高，在小鼠模型中外源性注射Th9細(xì)胞后，小鼠結(jié)腸炎癥加重，而在IL-9基因敲除或使用IL-9抗體中和后，小鼠結(jié)腸炎內(nèi)鏡表現(xiàn)及組織病理變化則明顯減輕。另外在支氣管哮喘病人病理組織中發(fā)現(xiàn)IL-9mRNA及蛋白水平升高，提示IL-9參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展；研究證實(shí)，IL-9轉(zhuǎn)基因小鼠在抗原刺激下可表現(xiàn)出呼吸道高反應(yīng)性，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，IgE水平增高等哮喘急性發(fā)作的特征。而在剔除鼠或引入IL-9抗體后，呼吸道炎癥及呼吸道高反應(yīng)性較前明顯下降。而在幽門螺桿菌感染人體后發(fā)現(xiàn)IL-9和IL-9mRNA在胃黏膜病理組織中明顯較健康對(duì)照組升高，而在敲除IL-9基因的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌在小鼠胃黏膜的定植量和小鼠胃黏膜炎癥程度比正常感染組小鼠高，首次證實(shí)IL-9在幽門螺桿菌誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)中起保護(hù)作用。另外在乙型病毒性肝炎患者血清中發(fā)現(xiàn)IL-9明顯高于健康對(duì)照者，而且在病毒載量小于105時(shí)，IL-9的水平隨病毒負(fù)荷量增高而增高，但是在病毒負(fù)載量大于105時(shí)，IL-9的血清水平反而下降。在活動(dòng)性結(jié)核病人中也發(fā)現(xiàn)IL-9的血清水平明顯高于健康對(duì)照者，提示IL-9參與機(jī)體對(duì)結(jié)核菌的免疫反應(yīng)。綜上所述，IL-9是一種多效應(yīng)的細(xì)胞因子，它參與機(jī)體多種疾病的免疫應(yīng)答過程，而IL-9抗體可能作為多種疾病的診斷和治療。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種IL-9的抗原表位肽。本發(fā)明所提供的IL-9抗原表位肽，其氨基酸序列可為如下任一：(1)序列表中序列1；(2)序列表中序列1的第9-13位(核心表位)；(3)序列表中序列2；(4)序列表中序列2的第1-5位(核心表位)；(5)序列表中序列3；(6)序列表中序列3的第5-10位(核心表位)；(7)序列表中序列3的第6-11位(核心表位)；(8)序列表中序列3的第4-10位(核心表位)；(9)序列表中序列3的第6-13位(核心表位)。相應(yīng)的，本發(fā)明還提供了一種IL-9抗原，具體為將所述IL-9抗原表位肽與載體蛋白偶聯(lián)而成。在本發(fā)明中，所述載體蛋白具體可為匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)或者牛血清白蛋白(BSA)。當(dāng)然，符合實(shí)驗(yàn)要求的其他載體蛋白均可。更加具體的，在本發(fā)明的實(shí)施例中，當(dāng)作為免疫原用于免疫動(dòng)物制備抗體時(shí)，所述載體蛋白具體為匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)；當(dāng)作為包被原用于篩選單克隆細(xì)胞株時(shí)，所述載體蛋白具體為牛血清白蛋白(BSA)。所述IL-9抗原表位肽或所述IL-9抗原在作為免疫原制備抗IL-9的抗體中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，所述應(yīng)用既可為非疾病診斷治療的應(yīng)用，也可為疾病診斷治療的應(yīng)用。以所述IL-9抗原表位肽或所述IL-9抗原作為免疫原制備所得的抗IL-9的抗體當(dāng)然也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述抗體在檢測(cè)IL-9或制備用于檢測(cè)IL-9的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，所述應(yīng)用既可為非疾病診斷治療的應(yīng)用，也可為疾病診斷治療的應(yīng)用。所述IL-9抗原表位肽或所述IL-9抗原或所述抗體在如下(a)或(b)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。(a)制備用于診斷IL-9表達(dá)異常相關(guān)疾病的產(chǎn)品；(b)制備用于治療和/或預(yù)防IL-9表達(dá)異常相關(guān)疾病的產(chǎn)品。本發(fā)明還保護(hù)活性成分為所述IL-9抗原表位肽或所述IL-9抗原或所述抗體的產(chǎn)品；所述產(chǎn)品具有如下功能中至少一種：(A)診斷IL-9表達(dá)異常相關(guān)疾??；(B)治療和/或預(yù)防IL-9表達(dá)異常相關(guān)疾病。其中，所述IL-9表達(dá)異常是指與未患病的健康對(duì)照相比，患者體內(nèi)的IL-9的表達(dá)水平表現(xiàn)出顯著差異。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，所述IL-9表達(dá)異常相關(guān)疾病具體為活動(dòng)性結(jié)核病。另外，編碼所述IL-9抗原表位肽的核酸分子以及含有所述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體或重組細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。在本發(fā)明中，所述IL-9為人源IL-9。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的IL-9抗原表位肽及確定的核心表位可用于制備高效靈敏的抗IL-9的抗體。本發(fā)明對(duì)于IL-9表達(dá)異常相關(guān)疾病的診斷和防治具有重要意義。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、IL-9抗原的制備一、IL-9抗原中表位肽序列的確定1、在NCBI搜索IL-9蛋白的序列信息如下：IL-9蛋白的序列如下：mllamvltsalllcsvagqgcptlagildinflinkmqedpaskchcsanvtsclclgipsdnctrpcfserlsqmtnttmqtryplifsrvkksvevlknnkcpyfsceqpcnqttagnaltflkslleifqkekmrgmrgki.IL-9蛋白序列總體比較特異，沒有與之相似的蛋白序列。2、根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行分析，得到IL-9可能的糖基化位點(diǎn)，避開信號(hào)肽和糖基化位點(diǎn)，選擇如下3個(gè)區(qū)域做為抗原位點(diǎn)：IL9-pep1：DINFLINKMQEDPASKC(序列1)；IL9-pep2：CIFQKEKMRGMRGKI(序列2)；IL9-pep3：SRVKKSVEVLKNNKC(序列3)。其中，IL9-pep2中的第一個(gè)氨基酸“C”并非來自于IL-9蛋白的序列，而是為了用于偶聯(lián)載體而額外添加的。二、IL-9抗原的制備使用多肽合成儀人工合成序列表中序列1-3所示的三條多肽序列(IL9-pep1，IL9-pep2和IL9-pep3)，并將三條多肽分別與匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行偶聯(lián)，得到“表位肽-載體蛋白偶聯(lián)物”。其中，偶聯(lián)KLH的用于免疫小鼠制備抗IL-9抗體時(shí)使用；偶聯(lián)BSA的用于篩選抗血清時(shí)作為ELISA包被原使用。經(jīng)檢測(cè)，偶聯(lián)所得的兩種“表位肽-載體蛋白偶聯(lián)物”的純度大于90％，10mg。實(shí)施例2、針對(duì)實(shí)施例1中IL-9抗原的單克隆抗體的制備及抗原表位鑒定一、針對(duì)實(shí)施例1中IL-9抗原的單克隆抗體的制備及特性鑒定1、動(dòng)物免疫用實(shí)施例1制備的偶聯(lián)了KLH的三條多肽(IL9-pep1，IL9-pep2和IL9-pep3)分別免疫4只SPF級(jí)的BALB/c雌性小鼠。具體免疫策略如下：(1)初次免疫：偶聯(lián)了KLH的多肽的劑量為60μg(偶聯(lián)后的總質(zhì)量)，佐劑為弗氏完全佐劑，佐劑的劑量為200μl，腹部皮下注射免疫。(2)初次免疫14天后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，偶聯(lián)了KLH的多肽的劑量為30μg(偶聯(lián)后的總質(zhì)量)，佐劑為弗氏不完全佐劑；佐劑的劑量為200μl，腹部皮下注射免疫。共進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫，相鄰兩次加強(qiáng)免疫之間的時(shí)間間隔為14天。第三次加強(qiáng)后，用實(shí)施例1制備的偶聯(lián)了BSA的三條多肽(IL9-pep1，IL9-pep2和IL9-pep3)分別作為包被原，間接ELISA檢測(cè)小鼠血清中抗體效價(jià)，選擇效價(jià)為大于最大OD/2的最小OD讀數(shù)所對(duì)應(yīng)的稀釋度為實(shí)驗(yàn)確定效價(jià)。ELISA檢測(cè)小鼠血清中抗體效價(jià)的具體方法如下：1)用包被液(碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6)稀釋包被原，終濃度為2μg/ml，100μl/孔，4℃，過夜；后用洗液(0.05％吐溫溶于PBS)洗滌2次。2)封閉液(2％牛奶溶于PBS)封閉，200μl/孔，37℃孵育2h；后用洗液洗滌1次。3)將待測(cè)的小鼠血清從200倍開始2倍梯度稀釋(稀釋液為PBS)，空白對(duì)照(blank)為PBS，陰性對(duì)照(negative)為未經(jīng)免疫的小鼠血清1000倍稀釋(稀釋液為PBS)；均為100μl/孔，37℃孵育1h；后用洗液洗滌3次。4)加入PBS稀釋20000倍的二抗(山羊抗小鼠IgG/HRP，BPI，產(chǎn)品編號(hào)：AbP71003-D-HRP)，100μl/孔，37℃孵育，1h；取出后用洗液洗滌3次。5)顯色，顯色液100μl/孔，顯色時(shí)間為5-15min。其中，顯色液為“1％A液+10％B液”；A液：1％TMBinDMSO；B液：0.1％H2O2溶于檸檬酸緩沖液。6)每孔加入50μl終止液(2M硫酸)終止。7)雙波長(zhǎng)(450，630)測(cè)吸光值。效價(jià)為1/2最大OD值所對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)。2、細(xì)胞融合1)將狀態(tài)良好的sp2/0細(xì)胞(ATCCNumberCRL-1581)輕柔的從培養(yǎng)瓶壁上吹打下來，吸入到50ml離心管中。2)小鼠摘眼球取血，然后拉頸處死，放入75％的酒精中浸泡5min。3)在平皿中倒入少量無(wú)血清的IMDM，將細(xì)胞篩及注射器內(nèi)芯放入平皿中。用剪刀和鑷子取下小鼠的脾臟，放到細(xì)胞篩上。用注射器的內(nèi)芯輕輕地將脾充分碾碎，將碾好的細(xì)胞吸入到裝sp2/0細(xì)胞的離心管中，離心1500rad/min，5min。4)用剪刀和鑷子取下小鼠的胸腺，碾碎。將碾好的胸腺細(xì)胞到15ml離心管中，再加入1ml的HAT(Sigma；貨號(hào)：H0262-10VL)，放在孵箱中備用。5)將離心好的細(xì)胞，倒掉上清，用無(wú)血清的IMDM將細(xì)胞小心輕柔地吹勻，離心(1500rad/min，5min)。6)將離心好的細(xì)胞上清盡量倒掉。拍打離心管底充分懸浮細(xì)胞，將離心管放入37℃溫水中，在1分鐘內(nèi)緩慢加入1ml的PEG1500(Roche；貨號(hào)：78364)，加完后，在溫水中靜置1min。然后2min內(nèi)緩慢加入2ml的無(wú)血清的IMDM，接著2min內(nèi)緩慢加入8ml無(wú)血清的IMDM。離心1000rad/min，5min。7)倒掉上清，加入10ml的新生牛血清，小心的將細(xì)胞吹勻，倒入前面準(zhǔn)備好的胸腺細(xì)胞。再加入25ml滅過菌的半固體培養(yǎng)基，充分混勻。然后均勻倒入30個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入濕盒中，然后放入孵箱中培養(yǎng)。孵育7-10天。3、ELISA篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞將上述在半固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單克隆挑到鋪有100μlT細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)(培養(yǎng)基為IMDM完全培養(yǎng)基)，4天后取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA篩選單克隆。得到陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，再對(duì)所得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行第2次篩選，得到兩次篩選均陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞株。篩得的陽(yáng)性克隆逐次轉(zhuǎn)入6孔板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。上述ELISA法篩選陽(yáng)性細(xì)胞的步驟具體如下：1)用包被液(碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6)稀釋實(shí)施例1制備的偶聯(lián)了BSA的三條多肽(IL9-pep1，IL9-pep2和IL9-pep3)，終濃度為2μg/ml，100μl/孔，4℃，過夜；后用洗液(0.05％吐溫溶于PBS)洗滌3次。2)封閉液(2％牛奶溶于PBS)封閉，200μl/孔，37℃孵育2h；后用洗液洗滌3次。3)加入一抗(細(xì)胞培養(yǎng)上清)、陰性對(duì)照(SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清)、空白對(duì)照(PBS)、陽(yáng)性對(duì)照(如上獲得的效價(jià)最高的小鼠陽(yáng)性血清，用PBS進(jìn)行1000倍稀釋)，均為100μl/孔，37℃孵箱1h；后用洗液洗滌3次。4)加入PBS稀釋20000倍的二抗(山羊抗小鼠IgG/HRP，BPI，產(chǎn)品編號(hào)：AbP71003-D-HRP)，100μl/孔，37℃孵箱1h；取出后用洗液洗滌3次。5)顯色，顯色液100μl/孔，顯色時(shí)間為5min左右。其中，顯色液為“1％A液+10％B液”；A液：1％TMBinDMSO；B液：0.1％H2O2溶于檸檬酸緩沖液。6)每孔加入50μl終止液(2M硫酸)終止。7)雙波長(zhǎng)(450，630)測(cè)吸光值，肉眼觀察有變色反應(yīng)的即為陽(yáng)性。結(jié)果顯示：經(jīng)過第一次篩選，得到針對(duì)IL-9-pep1的5株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，針對(duì)IL-9-pep2的18株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，針對(duì)IL-9pep3的30株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。將上述所得的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行2次篩選，得到針對(duì)IL-9pep1的2株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，針對(duì)IL-9pep2的15株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，針對(duì)IL-9pep3的21株陽(yáng)性的細(xì)胞株。4、單克隆細(xì)胞亞型鑒定1)用100mMPBS(pH7.4)稀釋包被抗體(此抗體為能夠結(jié)合鼠源IgG、IgA、IgM的抗體，SouthernBiotech產(chǎn)品)至0.5μg/ml，每孔加0.1ml，4℃，過夜。2)PBS-T洗3次，每孔加入200μl封閉液(2％BSA和3％蔗糖溶于PBS)，37℃孵育2h。3)PBS-T洗3次；每孔加入100μl步驟3經(jīng)過兩次篩選所得的雜交瘤上清，37℃孵育1h。4)PBS-T洗3次；用封閉液1：1000(κ,λ)(針對(duì)κ或者λ型的二抗)或1：2000(針對(duì)IgM或是IgA或是IgG1或是IgG3或是IgG2a或是IgG2b的二抗)稀釋的HRP標(biāo)記的抗體(SouthernBiotech產(chǎn)品)0.1ml每孔，分別加入適當(dāng)?shù)目字校?7℃孵育1h。5)PBS-T洗3次；每孔加50μl顯色液，10-20min內(nèi)于雙波長(zhǎng)(450，630)測(cè)吸光值，記錄保存數(shù)據(jù)。其中，顯色液為“0.2mlA液+10μl30％H2O2溶于10mlB液；A液：15mg/mlABTS溶于H2O；B液：檸檬酸緩沖液，pH4.0。結(jié)果顯示：各雜交瘤細(xì)胞株上清液的吸光值(OD)及分泌的單克隆抗體的亞型如表1-表3所示。表中針對(duì)免疫原的OD值是產(chǎn)生的抗體和抗原的親和力情況，一般OD值大于0.15定義為陽(yáng)性。表1針對(duì)IL9-pep1的單克隆細(xì)胞株及其對(duì)應(yīng)的單抗亞型編號(hào)針對(duì)包被原的OD亞類21.506G2b表2針對(duì)IL-9-pep2的單克隆細(xì)胞株及其對(duì)應(yīng)的單抗亞型編號(hào)針對(duì)包被原的OD亞類10.775G2a20.936G2b30.537G140.626G150.649G1100.289G3110.537G1120.456G1140.365G1160.612G1170.422G1表3針對(duì)IL-9-pep3的單克隆細(xì)胞株及其對(duì)應(yīng)的單抗亞型編號(hào)針對(duì)免疫原的OD值亞型20.634G2a40.589G2a60.449G2a70.335G1150.299G1160.376G2a170.514G1180.582G3210.307G3220.358G1240.638G1290.461G1二、IL-9抗原核心表位的鑒定1、多肽合成使用多肽合成儀在纖維膜上合成三條多肽(IL9-pep1，IL9-pep2和IL9-pep3)，并且從第一個(gè)氨基酸開始一次用丙氨酸替換原有氨基酸，具體合成的全部多肽信息如下：IL-9-01-01：ADINFLINKMQEDPASKCAIL-9-01-02：AAINFLINKMQEDPASKCAIL-9-01-03：ADANFLINKMQEDPASKCAIL-9-01-04：ADIAFLINKMQEDPASKCAIL-9-01-05：ADINALINKMQEDPASKCAIL-9-01-06：ADINFAINKMQEDPASKCAIL-9-01-07：ADINFLANKMQEDPASKCAIL-9-01-08：ADINFLIAKMQEDPASKCAIL-9-01-09：ADINFLINAMQEDPASKCAIL-9-01-10：ADINFLINKAQEDPASKCAIL-9-01-11：ADINFLINKMAEDPASKCAIL-9-01-12：ADINFLINKMQADPASKCAIL-9-01-13：ADINFLINKMQEAPASKCAIL-9-01-14：ADINFLINKMQEDAASKCAIL-9-01-16：ADINFLINKMQEDPAAKCAIL-9-01-17：ADINFLINKMQEDPASACAIL-9-01-18：ADINFLINKMQEDPASKAAIL-9-02-01：AAIFQKEKMRGMRGKIAAIL-9-02-02：AAAFQKEKMRGMRGKIAAIL-9-02-03：AAIAQKEKMRGMRGKIAAIL-9-02-04：AAIFAKEKMRGMRGKIAAIL-9-02-05：AAIFQAEKMRGMRGKIAAIL-9-02-06：AAIFQKAKMRGMRGKIAAIL-9-02-07：AAIFQKEAMRGMRGKIAAIL-9-02-08：AAIFQKEKARGMRGKIAAIL-9-02-09：AAIFQKEKMAGMRGKIAAIL-9-02-10：AAIFQKEKMRAMRGKIAAIL-9-02-11：AAIFQKEKMRGARGKIAAIL-9-02-12：AAIFQKEKMRGMAGKIAAIL-9-02-13：AAIFQKEKMRGMRAKIAAIL-9-02-14：AAIFQKEKMRGMRGAIAAIL-9-02-15：AAIFQKEKMRGMRGKAAAIL-9-03-01：ASRVKKSVEVLKNNKCAIL-9-03-02：AARVKKSVEVLKNNKCAIL-9-03-03：ASAVKKSVEVLKNNKCAIL-9-03-04：ASRAKKSVEVLKNNKCAIL-9-03-05：ASRVAKSVEVLKNNKCAIL-9-03-06：ASRVKASVEVLKNNKCAIL-9-03-07：ASRVKKAVEVLKNNKCAIL-9-03-08：ASRVKKSAEVLKNNKCAIL-9-03-09：ASRVKKSVAVLKNNKCAIL-9-03-10：ASRVKKSVEALKNNKCAIL-9-03-11：ASRVKKSVEVAKNNKCAIL-9-03-12：ASRVKKSVEVLANNKCAIL-9-03-13：ASRVKKSVEVLKANKCAIL-9-03-14：ASRVKKSVEVLKNAKCAIL-9-03-15：ASRVKKSVEVLKNNACAIL-9-03-16：ASRVKKSVEVLKNNKAA2、IL-9抗原核心表位的鑒定及相應(yīng)陽(yáng)性單克隆抗體的篩選(1)水化：將步驟1合成好的帶有多肽的纖維膜首先用40ml100％無(wú)水乙醇洗15分鐘，再用40ml75％的無(wú)水乙醇洗15分鐘，然后用40ml50％的無(wú)水乙醇洗15分鐘，最后用1×PBS洗30分鐘。(2)封閉：用封閉液室溫封閉3-4小時(shí)。(3)加步驟一制備得到的對(duì)應(yīng)表1-表3中各雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清液：?jiǎn)慰寺】贵w樣品用封閉液1:100(體積比)稀釋，4℃孵育過夜。(4)洗膜：1×PBS-T洗滌3次，每次10分鐘。(5)加第二抗體：將二抗(辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠抗體，IBP公司產(chǎn)品，)按照1：10000(體積比)比例稀釋，常溫孵育2小時(shí)。(6)洗膜：1×PBS-T洗滌3次，每次10分鐘。(7)曝光：將ECL顯色液中A、B液按1：1(體積比)充分混合。(8)將多肽陣列膜放入盒中，把混合液加于膜上，反應(yīng)2分鐘。(9)將膜上多余混合液用濾紙吸取，把多肽膜放入塑料膜上，在入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯色。(10)顯影：將多肽膜進(jìn)行ECL顯影，曝光，將膠片進(jìn)行掃描，用TotalLabControlCenterv2009軟件進(jìn)行分析。如果核心表位處的氨基酸被替換，那么抗原抗體反應(yīng)脫落或者變?nèi)?，顯色時(shí)發(fā)光變?nèi)趸蛘卟话l(fā)光，所得結(jié)果用軟件分析，灰度值低于野生型(無(wú)替換氨基酸的完整多肽)的50％確定為核心表位所在。3、結(jié)果鑒定為陽(yáng)性的單抗如下：IL9-pep1：DINFLINKMQEDPASKC；共1個(gè)單抗(表1中編號(hào)為2的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗)，第9-13位氨基酸為核心表位。IL9-pep2：CIFQKEKMRGMRGKI；共1個(gè)單抗(表2中編號(hào)為1的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗)，第1-5為氨基酸為核心表位。IL9-pep3：SRVKKSVEVLKNNKC；共8個(gè)單抗，6號(hào)、15號(hào)、17號(hào)單抗核心表位在5-10號(hào)氨基酸；2號(hào)、7號(hào)、18號(hào)單抗核心表位在6-11位氨基酸；4號(hào)單抗核心表位4-10位氨基酸；21號(hào)單抗核心表位6-13號(hào)氨基酸。其中各編號(hào)對(duì)應(yīng)的是表3中的雜交瘤細(xì)胞株的編號(hào)。表1-表3中其余未提及的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗在步驟2的鑒定試驗(yàn)中為陰性結(jié)果。實(shí)施例3、實(shí)施例2篩選的各陽(yáng)性單抗的具體應(yīng)用實(shí)例將實(shí)施例2篩選得到的各雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗(即雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清液)進(jìn)行相應(yīng)的血清學(xué)ELISA檢測(cè)試驗(yàn)，以驗(yàn)證檢測(cè)效果。具體如下：待測(cè)病人血清：10例臨床確診為活動(dòng)性結(jié)核病的患者肝素鈉抗凝血，病人自愿同意參與本實(shí)驗(yàn)相關(guān)研究。已知相對(duì)于健康對(duì)照者而言，活動(dòng)性結(jié)核病的患者血清中IL-9會(huì)表達(dá)上調(diào)。1、包被：收集活動(dòng)性結(jié)核病人肝素鈉抗凝血4ml，12000g離心5min，吸取上層血清100μl包被ELISA板，4℃過夜。同時(shí)設(shè)置健康的正常人血清作為陰性對(duì)照。2、每孔加入供試單抗100μl，37℃孵育1小時(shí)，洗板。3、加入辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(BPI公司產(chǎn)品，貨號(hào)為AbP71003-D-HRP)100μl，37℃孵育30min。4、加入底物TMB100μl，反應(yīng)10-30min5、加入2M硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm處讀板。6)讀數(shù)：以450nm單波長(zhǎng)測(cè)定各待測(cè)孔OD值，以與陰性對(duì)照孔OD值的比值(P/N)大于2.1為限，作為判斷為陽(yáng)性的臨界點(diǎn)。ELISA結(jié)果判定方法：若P/N>2.1，則判別為陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定三次，結(jié)果取均值。結(jié)果顯示：采用實(shí)施例2篩選得到的各雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗(即雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清液)進(jìn)行相應(yīng)的血清學(xué)ELISA檢測(cè)試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。其中，表4為采用表1中編號(hào)為2的針對(duì)IL-9-pep-1的單克隆細(xì)胞株分泌的單抗的血清學(xué)ELISA檢測(cè)結(jié)果。表4IL-9-PEP單抗對(duì)10例活動(dòng)性結(jié)核病的患者血清ELISA檢測(cè)結(jié)果當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3