本發(fā)明涉及一種稻綠核菌的分離方法，尤其是一種產(chǎn)五種稻曲病菌毒素的稻綠核菌的有效分離方法。

背景技術(shù)：

稻曲病是一種水稻真菌病害，由綠核菌屬綠核菌Ustilaginodea virens(Cooke)Takahashi侵染水稻穗部引起。稻曲病發(fā)生較為普遍，在中國(guó)、日本、美國(guó)、印度、菲律賓等多個(gè)國(guó)家均有出現(xiàn)，屬于世界性水稻病害(Fu et al，2015；Ashizawa et al，2010；Hamed et al，2014)。20世紀(jì)80年代前，稻曲病僅零星分布于中晚稻田，為水稻次要病害；但隨著水稻品種、耕作方式、施肥用量及氣候環(huán)境等因素改變，近年來(lái)，稻曲病已由過(guò)去的零星分布轉(zhuǎn)變成為水稻生產(chǎn)中的主要病害之一(王文斌等，2014)。稻曲病不但在水稻穗部形成稻曲球，嚴(yán)重影響谷粒的生長(zhǎng)，降低水稻的產(chǎn)量與品質(zhì)，而且其病原真菌——稻綠核菌Ustilaginodea virens(Cooke)Takahashi所產(chǎn)生的稻曲病菌毒素對(duì)人畜具有毒害作用(楊麗敏等，2012；范允卿等，2012)。目前，已逐漸引起了專(zhuān)家學(xué)者對(duì)稻曲病產(chǎn)生菌以及所產(chǎn)稻曲病菌毒素的廣泛關(guān)注(王偉剛等，2009)。

稻曲病菌屬于一種寄生性較強(qiáng)腐生性較弱的真菌，稻曲球營(yíng)養(yǎng)豐富，而且又暴露于自然環(huán)境中，常伴生大量的腐生細(xì)菌和真菌及其它病原菌，再加上稻綠核菌生長(zhǎng)非常緩慢，故在培養(yǎng)的過(guò)程中極易受到其他病原菌的污染，因此，相對(duì)其他真菌來(lái)說(shuō)，稻綠核菌的分離成功率很低。然而在實(shí)際的分離過(guò)程中，研究人員普遍發(fā)現(xiàn)采用稻曲球內(nèi)層組織分離法可以成功分離到稻曲病菌，但其培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)(培養(yǎng)5d后長(zhǎng)出白色致密菌絲，菌絲生長(zhǎng)較慢，約30d左右，顏色發(fā)生改變?yōu)榈S色、黃色)，分離速度較慢，比較耗時(shí)。但該方法由于選用的是內(nèi)部菌絲，雜菌較少，成功分離的機(jī)率較高。厚垣孢子懸液法，稻曲球經(jīng)無(wú)菌水沖洗即可配制成厚垣孢子懸浮液，由于稻曲球表層伴有大量其他病原菌，它們的生長(zhǎng)速度快于稻曲病菌的生長(zhǎng)速度，極易污染稻曲病菌，而且生長(zhǎng)速度過(guò)快的雜菌覆蓋于少量饅頭狀的稻曲病菌單菌落上，加大分離純化的難度。稻曲球法的缺點(diǎn)是多種病原菌伴生于稻曲球，在培養(yǎng)過(guò)程中亦可迅速生長(zhǎng)而污染目標(biāo)菌。菌核萌發(fā)法較易成功，有研究證明菌核是稻曲病菌高效分離的首選材料，但菌核形成受環(huán)境條件限制，不易收集獲取菌核；而且南方稻區(qū)少見(jiàn)，采用此法分離南方稻曲病菌效果并不理想。孢子振落法，由于稻曲表面不作消毒處理，稻曲表面大量的雜菌易在培養(yǎng)基表面快速生長(zhǎng)，影響厚垣孢子萌發(fā)、生長(zhǎng)及菌落的純化，同厚垣孢子懸浮液法一樣易受其他病菌污染，不易成功獲得稻曲病菌株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種分離精確、無(wú)毒害的產(chǎn)五種稻曲病菌毒素的稻綠核菌的有效分離方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：一種產(chǎn)五種稻曲病菌毒素的稻綠核菌的有效分離方法，其方法如下：

稻曲球樣本的采集：從田間采集的新鮮的單粒黃色、黃綠色或綠色稻曲球；菌株的分離：將采集的稻曲球病粒先用75％酒精浸泡10秒鐘，然后放于酒精燈上均勻自燃5秒鐘，進(jìn)行消毒，用無(wú)菌濾紙吸干其表面的水分，將表層的組織在無(wú)菌操作狀態(tài)下清理干凈，然后用無(wú)菌手術(shù)刀將稻曲球切開(kāi)，夾取中間層，接種到濃度為0.05g/L的氯霉素的無(wú)菌PSA平板培養(yǎng)基上，每皿接種3個(gè)點(diǎn)，每一樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，接種后的培養(yǎng)皿于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；菌株的純化：待菌落長(zhǎng)出后3-5天，用尖頭挑針挑取黃色或白色小菌落，或者挑取邊緣的菌絲移至新鮮配制且已滅菌的PSA平板培養(yǎng)基中，進(jìn)行反復(fù)純化，并進(jìn)行菌株的保存。

本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為：所述的菌株的保存為短期保存，將稻曲病菌移至無(wú)菌PSA斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后，保存于4℃冰箱中，至少3個(gè)月轉(zhuǎn)接1次。

本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為：所述的菌株的保存為長(zhǎng)期保存，用尖頭挑針挑取黃色或白色小菌落或者挑取邊緣的菌絲，接種于新鮮配制的已滅菌的PSA平板上，將滅菌后規(guī)格為1cm×1cm的濾紙片置于接種點(diǎn)周?chē)?.5-1cm，于28℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)7-10天，待菌絲長(zhǎng)滿濾紙片后，用無(wú)菌鑷子輕輕取下濾紙片，放入無(wú)菌硫酸紙袋中并封口，做好標(biāo)記，并放入裝有變色硅膠的容器中，密封后置于-20℃條件下長(zhǎng)期保存。

本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為：所述的培養(yǎng)基為，(1)馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)：馬鈴薯200g，加水1000mL煮沸20～30min，用八層紗布過(guò)濾，加20g瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入20g蔗糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1000mL，分裝試管或者錐形瓶，加塞、包扎，121℃高壓濕熱滅菌20分鐘后取出試管擺斜面或者搖勻，冷卻后貯存?zhèn)溆?；?2)馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PS)：馬鈴薯200g加水1000mL煮沸20～30min，用八層紗布過(guò)濾，濾液加蔗糖20g，定容至1000mL，121℃高壓濕熱滅菌20min后取出冷卻。

利用該方法對(duì)新鮮采集的單粒黃色、黃綠色或綠色稻曲球的分離成功率約為100％；4℃冰箱保存，保存時(shí)間不超過(guò)4個(gè)月或-70℃冰箱保存，保存時(shí)間不超過(guò)1個(gè)月的稻曲球的分離成功率達(dá)90％以上和80％以上。

附圖說(shuō)明

圖1為5種稻曲病菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(4ng/mL)的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖；

圖2為5種稻曲病菌所產(chǎn)毒素含量的測(cè)定結(jié)果(n＝3)(單位：ng/g)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明一種產(chǎn)五種稻曲病菌毒素的稻綠核菌的有效分離方法，1、稻曲球樣本的采集：從田間采集的新鮮的單粒黃色、黃綠色或綠色稻曲球。

2、菌株分離的準(zhǔn)備工作：配制75％酒精；無(wú)菌濾紙和無(wú)菌手術(shù)刀；過(guò)濾滅菌的100g/L氯霉素母液(無(wú)水乙醇配制)。

3、菌株的分離：將采集的稻曲球病粒先用75％酒精浸泡10秒鐘，然后放于酒精燈上自燃約5秒鐘，用無(wú)菌濾紙吸干表面的水分，將表層的組織在無(wú)菌操作狀態(tài)下清理干凈。然后用無(wú)菌手術(shù)刀將稻曲球切開(kāi)，夾取中間層，接種到濃度為0.05g/L氯霉素(抑制細(xì)菌生長(zhǎng))的無(wú)菌PSA平板培養(yǎng)基上，每皿接種3個(gè)點(diǎn)，每一樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，接種后的培養(yǎng)皿于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期觀察菌落生長(zhǎng)情況，做好相關(guān)記錄。該分離方法與以往報(bào)道的方法不同，以往方法在75％酒精浸泡后，大都采用一定濃度的升汞水溶液浸泡消毒(如專(zhuān)利“一種簡(jiǎn)便的稻曲病菌快速分離法”，申請(qǐng)公布號(hào)：CN 101875906 A)，本方法采用表面灼燒的形式進(jìn)行表面消毒，避免了劇毒試劑升汞的使用的同時(shí)，簡(jiǎn)化了操作步驟。稻曲球取樣部位(從內(nèi)到外依次為：白色致密的菌絲、橙黃色的厚垣孢子層、黃色的厚垣孢子層和墨綠色的厚垣孢子層)。

4、菌株的純化：待菌落長(zhǎng)出后(3-5天左右)，用尖頭挑針挑取黃色或白色小菌落或者挑取邊緣的菌絲移至新鮮配制且已滅菌的PSA平板培養(yǎng)基中，進(jìn)行反復(fù)純化。

5、菌株的保存：

(1)短期保存：將稻曲病菌移至無(wú)菌PSA斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后，保存于4℃冰箱中，至少3個(gè)月轉(zhuǎn)接1次。

(2)長(zhǎng)期保存：用尖頭挑針挑取黃色或白色小菌落或者挑取邊緣的菌絲，接種于新鮮配制的已滅菌的PSA平板上，將滅菌后的濾紙片(1cm×1cm)置于接種點(diǎn)周?chē)?.5-1cm，于28℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)7-10天，待菌絲長(zhǎng)滿濾紙片后，用無(wú)菌鑷子輕輕取下濾紙片，放入無(wú)菌硫酸紙袋中并封口，做好標(biāo)記，放入裝有變色硅膠的容器中，密封后置于-20℃條件下長(zhǎng)期保存，取用時(shí)按常規(guī)方法活化即可。

本發(fā)明涉及的分離方法解決了稻曲病菌分離過(guò)程中雜菌干擾的問(wèn)題，操作簡(jiǎn)便易行，分離效率極高，適用于常溫保存或4℃冰箱保存，保存時(shí)間不超過(guò)4個(gè)月或-70℃冰箱保存，保存時(shí)間不超過(guò)1個(gè)月的稻曲球的分離，對(duì)田間即時(shí)采集的新鮮稻曲球(黃色、黃綠色或綠色稻曲球)中稻綠核菌的分離效果最佳，與以往幾種分離方法相比，本發(fā)明的方法建立的有效分離方法分離效果最好，具有試劑種類(lèi)少(只用到75％酒精)、操作簡(jiǎn)捷高效、菌株易純化、不易受污染、培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)較短、分離成功率較高及準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，而且避免了有毒試劑的使用，保證實(shí)驗(yàn)人員的安全，分離到的菌株經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室分離純化的標(biāo)樣進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，該菌株在大米培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生5種稻曲病菌毒素，且含量很高，所用到的大米培養(yǎng)基為，大米于旋風(fēng)研磨儀中粉碎，稱(chēng)取30g米粉于250mL錐形瓶中，于121℃下高溫壓濕熱滅菌20min。在無(wú)菌條件下，分別加入0、15、30mL無(wú)菌水，搖勻后采用孢子懸浮液接種(孢子數(shù)量為1×10⁶個(gè)/瓶)，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，能得到5種稻曲病菌毒素。

參考圖1可知，分離后的稻綠核菌產(chǎn)毒素情況檢測(cè)：

(1)大米培養(yǎng)基：大米于旋風(fēng)研磨儀中粉碎，稱(chēng)取30g米粉于250mL錐形瓶中，于121℃下高溫壓濕熱滅菌20min。在無(wú)菌條件下，分別加入0、15、30mL無(wú)菌水，搖勻后采用孢子懸浮液接種(孢子數(shù)量為1×10⁶個(gè)/瓶)，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

(2)5種毒素的檢測(cè)：取培養(yǎng)15天的大米培養(yǎng)基，按米粉∶水＝1∶5的比例進(jìn)行提取毒素，提取凈化后的毒素利用TSQ Quantum Access Max三重四極桿質(zhì)譜儀(附電噴霧離子源，美國(guó)ThermoFisher公司)進(jìn)行檢測(cè)(以本實(shí)驗(yàn)室純化制備獲得的稻曲病菌毒素純品為標(biāo)準(zhǔn)樣品，圖1)。根據(jù)培養(yǎng)基中毒素含量高低篩選出最適菌株產(chǎn)毒的大米培養(yǎng)基配比以及產(chǎn)毒較高的稻綠核菌菌株。

由圖2可以看出，大米培養(yǎng)基中水分含量對(duì)稻曲病菌產(chǎn)毒效果的影響很大，其中，效果最好的2號(hào)培養(yǎng)基，即30g米粉中加入15mL無(wú)菌水，5種毒素(A-D，F(xiàn))均有檢出，且不管是單一毒素含量還是5種毒素總含量均遠(yuǎn)高于其他兩種培養(yǎng)基配比。利用本實(shí)驗(yàn)室分離純化到的5種稻曲病菌毒素純品進(jìn)行定量分析，5種稻曲病菌均有檢出，且含量較高，總含量為7301.2ng/g。

本實(shí)施例中大米粉培養(yǎng)基：大米粉30g，水15mL。培養(yǎng)基于121℃下高壓濕熱滅菌20min后取出冷卻，貯存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明方法分離到的菌株經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室分離純化的標(biāo)樣進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，該菌株在大米培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生5種稻曲病菌毒素，且含量很高。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為了清楚的說(shuō)明所做的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。