背景技術(shù)：
禽結(jié)核病是由禽結(jié)核分枝桿菌(又稱鳥分枝桿菌，見中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國獸醫(yī)菌種目錄第二版2002，中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社,2002，p83)引起家禽和鳥的一種傳染病。特征是病禽的肝、脾和腸道等組織器官形成肉芽腫和干酪樣鈣化結(jié)節(jié)。本病可侵害人和多種動物。世界動物衛(wèi)生組織將其列為B類動物疫病,而我國定為三類動物疫病。該病特點呈慢性經(jīng)過，漸進性消瘦、貧血、雞冠萎縮、跛行以及產(chǎn)蛋減少或停止。病程持續(xù)2～3個月，有時可達1年。病禽因衰竭或因肝變性破裂而突然死亡。一旦傳入養(yǎng)禽場，則長期存在，很難根除。近年來全國時有不同程度的禽結(jié)核病發(fā)生，發(fā)病率高，危害嚴重，經(jīng)濟損失巨大，迫切需求建立一種簡易的分離培養(yǎng)方法，以便臨床獸醫(yī)及科研工作者及時、準確做好診斷，從而對疫情進行合理有效處置。
在疑似病變組織中成功分離出禽結(jié)核分枝桿菌是診斷禽結(jié)核病的“金標準”。禽結(jié)核分支桿菌通常包括四個亞種，第一亞種是禽結(jié)核分支桿菌血清型1、2、3和基因型IS901+及IS1245+；第二亞種有禽結(jié)核分支桿菌人/豬亞種(hominissuis)血清型4、5、6、8、9、10、11和21及基因型IS901-和IS1245+；第三亞種為禽結(jié)核分支桿菌副結(jié)核亞種；第四亞種為禽結(jié)核分支桿菌silvaticum(農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局/中國動物衛(wèi)生與流行病學中心譯，OIE陸生動物診斷試驗和疫苗手冊，2010)。
當前，我國分離禽結(jié)核分枝桿菌主要采用配氏(Petragnani)固體培養(yǎng)基(中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所編，中國獸醫(yī)微生物菌種目錄，中國農(nóng)業(yè)出版社，2002年，以下簡稱《菌種目錄》；中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程，2000版，中國農(nóng)業(yè)出版社，2001年，以下簡稱《規(guī)程》)。該培養(yǎng)基主要成分為新鮮脫脂牛奶及雞蛋，其質(zhì)量受奶牛及雞蛋來源、新鮮程度、保存時間等因素影響大，造成培養(yǎng)基批次間質(zhì)量穩(wěn)定性差。另外配氏培養(yǎng)基制作中，需采集新鮮牛奶并進行脫脂，而且需制備土豆浸液并分離蛋黃，制作工藝復雜繁瑣。此外，對于新鮮牛奶取材來源困難的實驗室根本無法實現(xiàn)培養(yǎng)基制作。因而嚴重制約及影響了全國范圍對禽結(jié)核病的及時診斷和防控。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的
本發(fā)明技術(shù)方案
1.一種用合成培養(yǎng)基分離培養(yǎng)禽結(jié)核分枝桿菌的方法，其特征是將生產(chǎn)禽型結(jié)核菌素的禽結(jié)核分枝桿菌標準菌株C68201、C68202和C68203凍干菌種用適當生理鹽水稀釋后，接種以脫脂奶粉、蛋黃卵磷脂為合成培養(yǎng)基主要原料的固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)7日，作為制備禽型結(jié)核菌素用一級種子。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種禽結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng)方法，其特征是其中所使用合成培養(yǎng)基的配方(W/V)是：脫脂奶粉20g、PPLO瓊脂粉20g、卵黃卵磷脂10g，天門冬素2.6g、蛋白胨2g、酵母粉2g、甘油36ml、維生素K 0.1g、孔雀石綠0.6g、無水乙醇20ml，去離子水1000ml。其配制方法為：將PPLO瓊脂粉及孔雀石綠用500ml去離水加熱充分溶解后，116℃滅菌15min，降溫至60℃作為A液；將脫脂奶粉、天門冬素、蛋白胨、酵母粉、甘油、維生素K用500ml去離子水，50℃水浴加熱溶解后，0.22μm過濾除菌作為B液；將卵黃卵磷脂以無菌操作的方式在無菌器皿中用20ml的無水乙醇充分溶解后作為C液，然后將A液及B液及C液(V/V為500:500:20)充分混合后，以8ml/管制成固體培養(yǎng)基斜面使用。
本發(fā)明的詳細描述
1.禽結(jié)核菌素生產(chǎn)用菌種
(1)來源C68201/C68202/C68203株禽結(jié)核分枝桿菌，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應。
(2)培養(yǎng)特性及毒力
將C68201/C68202/C68203株禽結(jié)核分枝桿菌凍干菌種各1支，分別用1ml生理鹽水溶解稀釋后，各以0.2ml/支接種以脫脂奶粉、PPLO瓊脂粉和蛋黃卵磷脂為主要合成培養(yǎng)基原材料的固體培養(yǎng)基斜面，37℃培養(yǎng)7日，培養(yǎng)基表面長成淡黃白色奶油狀，菌落粘稠的典型菌落，從斜面刮取10mg活菌肌肉注射或取活菌1mg靜脈注射8周齡SPF雞各5只，臨床觀察4周，均5/5發(fā)病或死亡，適合用于繁殖禽型結(jié)核菌素生產(chǎn)種子用。
2培養(yǎng)基采用本發(fā)明設計的合成培養(yǎng)基
(1)配方(W/V)如下：
脫脂奶粉20g、PPLO瓊脂粉20g、卵黃卵磷脂10g，天門冬素2.6g、蛋白胨2g、酵母粉2g、甘油36ml、孔雀石綠0.6g、微生素K 0.1g、無水乙醇20ml，去離子水至1000ml。
(2)合成培養(yǎng)基配制方法
將PPLO瓊脂粉及孔雀石綠用500ml去離水加熱充分溶解后，116℃滅菌15min，降溫至60℃作為A液；將脫脂奶粉、天門冬素、蛋白胨、酵母粉、甘油、維生素K用500ml去離子水，50℃水浴加熱溶解后，0.22μm過濾除菌作為B液；將卵黃卵磷脂以無菌操作的方式在無菌器皿中用20ml的無水乙醇充分溶解后作為C液，然后將A液及B液及C液(V/V為500:500:20)充分混合后，以8ml/管制成固體培養(yǎng)基斜面?zhèn)溆谩?/p>
(3)合成培養(yǎng)基檢驗
1)性狀呈淡黃色固體。
2)無菌檢驗按中華人民共和國獸藥典(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○○五版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2006,以下稱《中國獸藥典》)規(guī)定的方法進行，應無菌生長。
3)生長試驗
將禽結(jié)核分枝桿菌(C68201/C68202/C68203株，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供)凍干菌種分別用1ml生理鹽水稀釋后，以0.2ml/支接種合成培養(yǎng)基固體斜面，37℃培養(yǎng)7日，菌落為淡黃白色奶油狀，菌落粘稠，挑取菌落可呈拉絲狀。經(jīng)純粹檢查合格后作為一級種子。在2～8℃保存，應不超過45日(《規(guī)程》)。
本發(fā)明涉及微生物資源信息
本發(fā)明中涉及的微生物資源是禽結(jié)核分枝桿菌C68201株、C68202株和C68203株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(請見中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國獸醫(yī)菌種目錄第二版2002，中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社,2002，p83)。
本發(fā)明的積極效果
從疑似禽結(jié)核病組織中進行細菌分離，是診斷禽結(jié)核病的“金標準”。我國分離培養(yǎng)禽結(jié)核分枝桿菌通常采用的是配氏(Petragnani)固體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基主要成分新鮮脫脂牛奶及雞蛋的質(zhì)量受奶牛及雞蛋來源、新鮮程度、保存時間等因素影響大，造成批次間質(zhì)量穩(wěn)定性差。另外本身制作繁瑣，而且對于新鮮牛奶取材來源困難的實驗室難以實施，從而影響禽結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)及臨床禽結(jié)核病的診斷。而本發(fā)明所提供的合成培養(yǎng)基及其制備方法，克服了以上的缺陷，制備成的培養(yǎng)基比配氏培養(yǎng)基顯著減少禽結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)時間(可減少3天以上培養(yǎng)時間)，并且臨床分離效果明顯優(yōu)于配氏培養(yǎng)基。有效解決了新鮮牛奶取材來源難、工藝制作復雜的難題。具有操作簡便、質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)點，適合臨床分離培養(yǎng)禽結(jié)核分枝桿菌，為禽結(jié)核病診斷提供了有力的保障。
實施例
實施例1
——禽結(jié)核分枝桿菌合成培養(yǎng)基的研究
從1％～3％脫脂奶粉、0.5％～1.5％卵黃卵磷脂、、1％～2％PPLO瓊脂粉組合成的配方中，通過接種培養(yǎng)凍干的禽結(jié)核分枝桿菌(C68201/C68202/C68203株)，篩選出2％脫脂奶粉+1％卵黃卵磷脂+2％PPLO瓊脂粉的合成培養(yǎng)基配方。該配方應用結(jié)果，37℃靜置培養(yǎng)7日,禽結(jié)核分枝桿菌(C68201/C68202/C68203株)培養(yǎng)基表面均長成淡黃白色奶油狀，菌落粘稠的典型菌落。從培養(yǎng)斜面刮取10mg活菌肌肉注射或取活菌1mg靜脈注射8周齡SPF雞各5只，臨床觀察4周，均5/5發(fā)病或死亡，與配氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的同種菌結(jié)果基本一致。符合《規(guī)程》中“禽型結(jié)核菌素制造用菌種”的要求。
1材料
1.1培養(yǎng)基原材料
脫脂牛奶(批號232100，購自BD DifcoTM公司)；卵黃卵磷脂(批號214010，購自OXOID公司)；PPLO瓊脂粉(批號：214230，購自BD DifcoTM公司)；胰酪蛋白胨(批號VM732731-644，購自MERCK公司)；酵母浸粉(批號911948，購自OXOID公司)；天門冬素、甘油、孔雀石綠、無水乙醇、葡萄糖、蔗糖、硫代`硫酸鈉、氯化血紅素、維生素K等均為常規(guī)化學試劑，購自北京化學試劑公司。
1.2新鮮牛奶(當日采自北京某奶牛場)、雞蛋、馬鈴薯、馬鈴薯淀粉購自北京某超市，生理鹽水(批號：0619，4.5ml/支，100ml/瓶)，A型試管使用規(guī)格25ml，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所培養(yǎng)基組提供。
1.3菌種
生產(chǎn)禽型結(jié)核菌素的菌種：禽型結(jié)核分枝桿菌(C68201/C68202/C68203株)(2006.8.29凍干，0.3ml/支)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應。
2方法與結(jié)果
2.1禽結(jié)核分枝桿菌種子液制備
參照《規(guī)程》進行，取禽結(jié)核分枝桿菌C68201、C68202及C68203凍干菌種各1支，分別用1ml生理鹽水稀釋后，以0.2ml/支轉(zhuǎn)接按2.2項方法制備的配氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)20日，作為一級種子，然后分別用適量生理鹽水洗下表面菌苔，置于含有滅菌玻璃球管中，用生理鹽水振蕩混勻稀釋成麥氏比濁濃度約106CFU/ml的菌液，作為種子液使用。
2.2配氏(Petragnani)固體培養(yǎng)基
2.2.1成分：新鮮脫脂牛奶450ml，馬鈴薯淀粉18g，天門冬素2.6g(或蛋白胨3g)，去皮馬鈴薯225g，雞蛋15個(除去3個蛋清)
2.2.2配制方法參照《規(guī)程》如下：1)將馬鈴薯去皮擦成絲，加入馬鈴薯淀粉、天門冬素(或蛋白胨)、脫脂牛奶置燒杯中水浴煮沸40～60分鐘，并不時攪拌均勻，使成糊狀。待冷至50℃時加入打碎的雞蛋(蛋殼先洗凈用75％酒精消毒)，混勻后用四層紗布濾過除渣。最后加入甘油和孔雀綠水溶液攪拌均勻，分裝于滅菌的試管中。2)將分裝有培養(yǎng)基的試管置流通蒸汽鍋內(nèi)放成斜面，經(jīng)流通蒸汽間歇滅菌3次，每日1次。第1日65℃滅菌30min，第2、3日，75～80℃滅菌30min。
2.3合成培養(yǎng)基
2.3.1基礎配方篩選
按如下成分進行配制：脫脂奶粉10g或20g或30g、卵黃卵磷脂5g或10g或15g、PPLO瓊脂粉10g或20g、天門冬素2.6g、蛋白胨2g、酵母粉2g、甘油36ml、孔雀石綠0.6g、無水乙醇20ml、去離子水1000ml。然后將脫脂奶粉、卵黃卵磷脂與PPLO瓊脂粉，按不同比例設計成表1所示18個配方，標記為1～18(具體比例及編號見表1)，同時設立配氏培養(yǎng)基對照。
2.3.2配制
按表1所示比例及量將PPLO瓊脂粉及孔雀石綠用500ml去離水加熱充分溶解后，116℃滅菌15min，降溫至60℃作為A液；將脫脂奶粉、天門冬素、蛋白胨、酵母粉、甘油、維生素K用500ml去離子水，50℃水浴加熱溶解后，0.22um過濾除菌作為B液；將卵黃卵磷脂以無菌操作的方式在無菌器皿中用20ml的無水乙醇充分溶解后作為C液，然后將A液及B液及C液(V/V為500:500:20)充分混合后，以8ml/管制成固體培養(yǎng)基斜面?zhèn)溆谩?/p>
2.4種子液接種
將2.1項制備的種子液，用生理鹽水作10000倍稀釋后，按0.2ml/支，分別接種制成的合成培養(yǎng)基及配氏培養(yǎng)基斜面，37℃培養(yǎng)20日。觀察各培養(yǎng)斜面菌落生長結(jié)果。
表1合成培養(yǎng)基基礎配方篩選的菌落計數(shù)結(jié)果(單位：CFU)
注：種子液約106CFU/ml。
從表1結(jié)果看出，配方14其培養(yǎng)3種菌的能力最好，且明顯高于對照配氏培養(yǎng)基。
2.5培養(yǎng)基生長因子的篩選
選取培養(yǎng)菌數(shù)較高的配方14作為合成培養(yǎng)基基礎成分，其中A液及C液均按2.3項方法進行。在B液中分別按表2所示比例及量加入不同劑量的葡萄糖、蔗糖、硫代硫酸鈉、氯化血紅素、維生素K等生長因子。然后會同配方14中基礎B液成分一同用500ml去離子水在50℃水浴加熱溶解后，0.22um過濾除菌作為B液使用，再按2.3項方法配成固體培養(yǎng)基。
表2培養(yǎng)基生長因子篩選的菌落計數(shù)結(jié)果(單位：CFU)
注：接入活菌約106CFU/ml的種子液，配氏對照批號為151103。
從表2結(jié)果看出，維生素K對培養(yǎng)基促生長作用明顯，而其它生長因子促生長作用不明顯。
2.6生長因子不同用量比較試驗
將篩選出的生長因子(維生素K)，按終濃度0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％加入合成培養(yǎng)基中，然后按2.4項方法接入種子液，37℃分別培養(yǎng)20日，觀察結(jié)果見表3。
表3不同用量生長因子比較試驗菌落計數(shù)結(jié)果(單位：CFU)
注：接入活菌約106CFU/ml的種子液
從表3結(jié)果看出，維生素K在0.01％時的合成培養(yǎng)基菌數(shù)最高。
2.7合成培養(yǎng)基與配氏培養(yǎng)基比較試驗
按配方14(添加最適量的維生素K)，制備3批合成培養(yǎng)基(批號分別為201501、201502及201503)，連同3批配氏培養(yǎng)基(批號分別為201511、201512及201513)，各分裝于A型試管(8ml/管)。按0.2ml/支接入稀釋菌種，37℃分別培養(yǎng)20日。分別于培養(yǎng)7日、10日、14日及20日，分別觀察結(jié)果。
表4培養(yǎng)基比較試驗結(jié)果(單位：CFU)
注：3種菌菌種：1為C68201、2為C68202、3為C68203，其種子液均約為106CFU/ml；“/”代表菌落不可見或肉眼無法計數(shù)
從表4結(jié)果看出，在相同培養(yǎng)條件下，3批合成培養(yǎng)基的培養(yǎng)菌數(shù)均較3批配氏培養(yǎng)基的培養(yǎng)菌數(shù)高，而且培養(yǎng)時間縮短，另外批次間比用新鮮脫脂牛奶與蛋黃配制的配氏培養(yǎng)基均一性較好。
2.4培養(yǎng)菌體的毒力試驗
將合成培養(yǎng)斜面基37℃培養(yǎng)7日的菌苔及配氏培養(yǎng)基斜面37℃培養(yǎng)10日的菌苔，各用無菌湯匙刮下后，稱取菌苔重量，然后用適量生理鹽水稀釋并懸浮混勻后。分別肌肉注射8周齡SPF雞5只，1ml/只(每1ml含10mg活菌)，臨床觀察4周，記錄存活情況；分別靜脈注射8周齡SPF雞5只，0.5ml/只(每0.5ml含1mg活菌)，臨床觀察4周，記錄存活情況。結(jié)果見表5。
表5培養(yǎng)菌體毒力檢測結(jié)果
從表5結(jié)果看出，合成培養(yǎng)基培養(yǎng)7日的菌體與配氏培養(yǎng)基培養(yǎng)14日的菌體兩者毒力測定結(jié)果基本一致，均符合《規(guī)程》中生產(chǎn)禽結(jié)核菌素用菌種毒力標準。
4結(jié)論
4.1用培養(yǎng)基配方14加0.01％維生素K組成的合成培養(yǎng)基培養(yǎng)菌數(shù)均高于配氏培養(yǎng)基，而且合成培養(yǎng)基上菌株生長速度優(yōu)于配氏培養(yǎng)基，其培養(yǎng)時間比配氏培養(yǎng)基短，其對SPF雞毒力測定結(jié)果與配氏培養(yǎng)基基本一致，符合《規(guī)程》中“生產(chǎn)禽結(jié)核菌素用菌種毒力標準”的要求。
實施例2
——合成培養(yǎng)基與配氏培養(yǎng)基對其他禽結(jié)核分枝桿菌標準菌株的生長繁殖比較結(jié)果
任選1批制備的合成培養(yǎng)基(201501批)以及配氏培養(yǎng)基(201512批)，購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心保存的22株其他禽結(jié)核分枝桿菌標準菌株凍干菌種各1支，然后各用1ml生理鹽水溶解稀釋后，分別以0.2ml/支接種上述兩種培養(yǎng)基斜面，37℃培養(yǎng)14日，期間7、10及14日觀察分別觀察生長情況。結(jié)果見表6。
表6不同菌種生長情況
注：“+”生長；“-”無生長；
從表6結(jié)果看出，合成培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)10日，均能成功培養(yǎng)出22株菌種，細菌生長速度明顯優(yōu)于配氏培養(yǎng)基。
實施例3
——合成培養(yǎng)基與配氏培養(yǎng)基對臨床病料的分離比較結(jié)果
任選1批合成培養(yǎng)基(201501批)及配氏培養(yǎng)基(201512批)，對5份臨床疑似禽結(jié)核病病料進行分離。在生物安全柜環(huán)境下，用無菌剪刀無菌操作挑取病料內(nèi)部組織約0.1g,將其放入含有不銹鋼球珠的滅菌的1.5ml eppdorf管中，然后分別加入200ul滅菌生理鹽水，用組織勻漿機(參數(shù)設定為：100r/min,振蕩1min，間歇1min，共3min)進行勻漿。最后將組織勻漿液再各用200μl滅菌生理鹽水稀釋后，以200μl/管分別轉(zhuǎn)接合成培養(yǎng)基及配氏培養(yǎng)基各1管，37℃培養(yǎng)14～20日，觀察斜面培養(yǎng)結(jié)果。結(jié)果見表7。
表7不同培養(yǎng)基臨床分離菌情況比較
注：“+”菌落生長且PCR鑒定為陽性；“-”無生長；
從表7結(jié)果看出，合成培養(yǎng)基對臨床疑似樣本分離率達100％，而配氏培養(yǎng)基僅為80％。