本發(fā)明涉及一種(R,S)-2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯的拆分，特別涉及一種米曲霉脂肪酶、編碼基因、載體、工程菌及其應(yīng)用。

(二)

背景技術(shù)：

(R)-2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯((R)-EHPP)是合成芳氧苯氧丙酸酯類除草劑(Aryloxy phenoxy propionate，簡稱APP)的關(guān)鍵手性中間體，APP類除草劑是一類能夠有效防除禾本科雜草的除草劑，也是一類發(fā)展較迅速、不斷開發(fā)出新品種的除草劑，迄今為止已有20個品種商品化，其中噁唑禾草靈、炔草酯、吡氟禾草靈、吡氟氯禾靈是近幾年來同類除草劑市場全球銷售額最高的幾個農(nóng)藥產(chǎn)品，由于手性APP類除草劑具有安全，高效和低毒等特性，近幾年來該類除草劑越來越受到大家的關(guān)注。

脂肪酶(Lipase,EC 3.1.1.3)全稱為三?；视王；饷?Triacylglycerol acylhydrolase)，是目前研究與工業(yè)化應(yīng)用最多的一類水解酶。脂肪酶能催化酯水解、酯合成、醇解、酸解、酯酯交換和氨解反應(yīng)。脂肪酶廣泛存在于自然界的各種生物體，特別是在微生物和動植物組織中。動物脂肪酶主要存在于胰臟等器官組織，比如豬肝酯酶和豬胰脂肪酶，但由于動物脂肪酶活性較低、酶提取純化成本較高和原料來源有限等因素，限制了其在工業(yè)中的應(yīng)用。微生物脂肪酶來源豐富，種類繁多，不受季節(jié)氣候等因素的影響，微生物生長產(chǎn)酶周期較短，而且具有耐有機溶劑、底物專一性強、催化選擇性高和催化活性高等特點，因而微生物來源的脂肪酶有較高的工業(yè)化應(yīng)用價值。目前市場上大部分商品化脂肪酶都通過細(xì)菌、真菌和酵母等微生物培養(yǎng)發(fā)酵獲得。丹麥Novo Nordisk公司、日本Amano公司和美國Genencor公司等主要酶制造商開發(fā)了多種的商品化酶制劑。這些酶制劑公司利用分子改造技術(shù)對微生物脂肪酶進(jìn)行改造，提高酶活力、穩(wěn)定性和立體選擇性等酶學(xué)性質(zhì)，以滿足不同工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用的需求。因而構(gòu)建脂肪酶基因工程菌從而大量生產(chǎn)重組脂肪酶具有十分重要意義。

(三)

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種立體選擇性米曲霉脂肪酶、編碼基因、含有該基因的重組載體、該重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌，及其在生物法拆分外消旋體EHPP中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種米曲霉脂肪酶，所述米曲霉脂肪酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該多肽的片段或多肽變體與前述氨基酸序列同源性在90％以上、且具有相同的酶活性，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。具體的，所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。

本發(fā)明所述蛋白的片段、衍生物或類似物是指基本上保持本發(fā)明所述的蛋白酶相同的生物學(xué)功能或活性的蛋白，可以是下列情形：(Ⅰ)一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；(Ⅱ)一個或多個氨基酸殘基上的某個基團(tuán)被其它基團(tuán)取代；(Ⅲ)成熟蛋白與另一種化合物(比如延長蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(Ⅳ)附加的氨基酸序列融合進(jìn)成熟的蛋白而形成的蛋白序列(如用來純化此蛋白的序列或蛋白原序列)。

所述蛋白可以是重組蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是純天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如：細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的蛋白可以是糖基化的。本發(fā)明的蛋白還可以包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。

本發(fā)明還提供一種所述米曲霉脂肪酶編碼基因，所述編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示。

該脂肪酶基因由如下方法得到：從米曲霉WZ007(Aspergillus oryzae WZ007)中分離純化得到該脂肪酶，N端測序結(jié)果經(jīng)比對獲得相似度最高的同源基因序列，設(shè)計引物1(5’-ATGCATCTTGCTATCAAGTCTC-3’)、引物2(5’-TTAGTTCGCAGCCGCAAC-3’)。利用PCR技術(shù)，以來源于米曲霉WZ007的基因組DNA為模板克隆脂肪酶基因片段。將該片段連接到pEASY-E1載體上獲得克隆載體pEASY-E1-aol并將其轉(zhuǎn)化于大腸桿菌Trans1-T1中。對重組質(zhì)粒測序，并利用軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，該序列含有一個長為765bp的開放閱讀框(SEQ ID NO.2)，利用軟件對該基因序列進(jìn)行分析，推知所述脂肪酶基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述脂肪酶基因源自米曲霉WZ007(Aspergillus oryzaeWZ007)。該菌保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號：CCTCC No:M 206105，保藏日期：2006年10月8日，已在先前申請專利(中國專利CN 101186938)中提交了相關(guān)菌種保藏信息并披露了其遺傳資源來源。關(guān)于米曲霉WZ007野生菌細(xì)胞拆分制備(R)-2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯的技術(shù)，已在中國專利CN 102719512中披露。本發(fā)明在此專利基礎(chǔ)上，進(jìn)行目標(biāo)脂肪酶和基因的挖掘，并在大腸桿菌宿主中高效表達(dá)。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有70％以上同源性、且具有相同的功能，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的氨基酸的功能。

另外，可與SEQ ID NO：2所示多核苷酸序列雜交的多核苷酸(至少具有50％同源性，優(yōu)選具有70％同源性)，也在本發(fā)明保護(hù)范圍之列，特別是在嚴(yán)格條件下可與本發(fā)明所述核苷酸序列雜交的多核苷酸。所述“嚴(yán)格條件”是指：(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加用變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清，0.1％Ficoll，42℃；或(3)僅在兩條序列之間的同源性至少在95％以上，更好是97％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的蛋白與SEQ ID NO：1所示的蛋白有相同的生物學(xué)功能和活性。

本發(fā)明還涉及一種所述米曲霉脂肪酶編碼基因構(gòu)建的重組載體，重組載體轉(zhuǎn)化獲得的重組基因工程菌。

所述米曲霉脂肪酶編碼基因在制備米曲霉脂肪酶中的應(yīng)用，具體的，所述的應(yīng)用為：構(gòu)建含有所述米曲霉脂肪酶編碼基因的重組載體pEASY-E1-aol，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TransB(DE3)中，獲得重組大腸桿菌TransB(DE3)/pEASY-E1-aol。重組大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液經(jīng)離心分離得到含有脂肪酶的菌體細(xì)胞。菌體細(xì)胞在超聲波破碎后，離心去除細(xì)胞碎片，所得的上清液通過Ni-NTA金屬螯合親和層析分離純化得到米曲霉脂肪酶。

本發(fā)明米曲霉脂肪酶活力測定方法為：1.5mL離心管中加入990μL Tris-HCl緩沖液(pH8.0，50mM)、10μL R,S-2-苯氧丙酸乙酯，混合后再加0.01g酶粉，30℃水浴搖床200rpm轉(zhuǎn)速條件下反應(yīng)30min，取200μL酶反應(yīng)液，加入1mL乙酸乙酯萃取，用無水Na₂SO₄除水后，以手性氣相色譜檢測R,S-2-苯氧丙酸乙酯，并以此計算底物對映體過量值e.e._s、轉(zhuǎn)化率c和酶活力。酶活定義：在50mM pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，30℃條件下，每分鐘將1μmol的(S)-2-苯氧丙酸乙酯水成(S)-2-苯氧丙酸所需的酶量。R,S-2-苯氧丙酸乙酯氣相色譜檢測方法：氣相柱：BGB-174手性柱)；載氣為N2(70kPa)；進(jìn)樣口溫度：220℃；空氣流量300mL/min；氫氣流量30mL/min；分流比50:1；進(jìn)樣量1μL；柱箱升溫程序：初始溫度120℃保持2min，5℃/min升溫至200℃，保持2min；FID檢測其溫度：250℃。

此外，本發(fā)明還提供一種所述米曲霉脂肪酶在拆分(R,S)-2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯中的應(yīng)用，具體所述應(yīng)用為：將含米曲霉脂肪酶基因的重組工程菌發(fā)酵培養(yǎng)，獲得濕菌體，將濕菌體冷凍干燥獲得的凍干菌體為酶源，以外消旋2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯為底物，以pH7-8的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，在25-35℃，100-200rpm條件下進(jìn)行拆分反應(yīng)，反應(yīng)完全后，反應(yīng)液分離純化，獲得(R)-2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯。

進(jìn)一步，所述酶源用量以凍干菌體重量計為5-20g/L緩沖液(優(yōu)選10g/L緩沖液)，所述底物終濃度為0.2-0.6mol/L。

進(jìn)一步，所述緩沖液為200mM、pH8PBS緩沖液。

進(jìn)一步，所述酶源按如下方法制備：將含米曲霉脂肪酶基因的重組工程菌接種至含50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，在30℃下培養(yǎng)12h，獲得種子液；再以體積濃度2％接種量接種到新鮮的含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.4～0.6，再加入終濃度為0.2mM的IPTG，28℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)8～10h，然后在4℃下10000rpm離心10min，收集濕菌體；將濕菌體加入少許Tris-HCl緩沖液(50mM,pH 8.0)，在-60℃條件下真空冷凍干燥2天，獲得凍干菌體。

進(jìn)一步，所述分離純化方法為：反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)10000rpm離心10min除去菌體，上清液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并有機相并用無水硫酸鈉除水，旋蒸后獲得(R)-2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供了一種來源于米曲霉WZ007(Aspergillus oryzae WZ007)的脂肪酶基因核苷酸序列；該脂肪酶基因可與表達(dá)載體連接構(gòu)建得到含該基因的胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株中，獲得重組大腸桿菌；該重組大腸桿菌經(jīng)細(xì)胞破碎，分離純化獲得重組脂肪酶；利用重組大腸桿菌或重組脂肪酶為生物催化劑同時催化拆分(R,S)-2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯，可以生成(R)-2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯。結(jié)果表明，重組大腸桿菌能高效催化拆分(R,S)-2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯，且反應(yīng)后產(chǎn)物的光學(xué)純度能達(dá)到99％以上。通過脂肪酶基因工程菌的高效表達(dá)，大大降低了生物催化劑在(R,S)-2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯拆分反應(yīng)的應(yīng)用成本。

(四)附圖說明

圖1為米曲霉WZ007重組脂肪酶對映選擇性水解(R,S)-EHPP及其類似物反應(yīng)示意圖；

圖2為PCR擴(kuò)增脂肪酶基因的瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道1為PCR擴(kuò)增脂肪酶基因，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；

圖3為米曲霉脂肪酶編碼基因重組載體質(zhì)粒pEASY-E1-aol的構(gòu)建示意圖；

圖4為大腸桿菌表達(dá)米曲霉WZ007重組脂肪酶的SDS-PAGE圖；M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌；泳道2為未經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌；

圖5為純化后重組脂肪酶的SDS-PAGE分析圖；M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為純化后重組脂肪酶。

(五)具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實施例1：

從原始菌株米曲霉WZ007細(xì)胞出發(fā)，通過系列大量的分離純化工作后，獲得米曲霉WZ007脂肪酶純酶，蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析獲得其部分氨基酸序列，在氨基酸序列信息基礎(chǔ)上設(shè)計PCR引物1和引物2。用核酸提取試劑盒(購自Takara公司)提取米曲霉(Aspergillus oryzaeWZ007)WZ007的基因組DNA，以該基因組DNA為模板，在引物1(5’-ATGCATCTTGCTATCAAGTCTC-3’)、引物2(5’-TTAGTTCGCAGCCGCAAC-3’)的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系各組分加入量(總體積100μL):

10×DNA Polymerase Buffer 10μL，dNTP mixture 1μL，濃度為50μM的引物1和引物2各0.5μL，基因組DNA 1μL，TransTaq DNA聚合酶2μL，無核酸水85μL。

PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃，3min，然后進(jìn)入溫度循環(huán)94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min，終止溫度為4℃。

取6μL PCR反應(yīng)液用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果表明為單一條帶，擴(kuò)增片段大小約為750b，如圖2所示。用DNA液體快速回收試劑盒(購自Takara公司)純化，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入堿基A。將該片段同T載體(pEASY-E1，該載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pEASY-E1-aol，構(gòu)建示意圖如圖3所示。將該重組質(zhì)?；瘜W(xué)法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌T1感受態(tài)中，涂布于含50μg/ml氨芐青霉素的LB平板上，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定結(jié)果見圖4。由圖3可知，在750b左右的位置具有單一條帶，表明所挑選的菌株均為陽性重組子。獲得的陽性重組子經(jīng)培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，送樣測序，利用軟件分析測序結(jié)果，結(jié)果表明：經(jīng)引物1和引物2擴(kuò)增到的核苷酸序列長度為765bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，該序列編碼一個完整的開放閱讀框(氨基酸序列為SEQ ID NO.1所示)。

實施例2:

根據(jù)實施例1獲得的重組質(zhì)粒用化學(xué)法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans B(DE3)(該感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，獲得含有胞內(nèi)表達(dá)重組質(zhì)粒pEASY-E1-aol的重組大腸桿菌Trans B(DE3)/pEASY-E1-aol。該重組大腸桿菌用含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基30℃下培養(yǎng)12h，再以2％接種量(v/v)接種到新鮮的含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)至菌體濃度OD₆₀₀約0.4～0.6左右，再向LB液體培養(yǎng)基加入終濃度為0.2mM的IPTG，28℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)8～10h，然后在4℃下10000rpm離心10min，收集含有重組脂肪酶的菌體細(xì)胞。加入少許Tris-HCl緩沖液(50mM,pH 8.0)，在-60℃條件下真空冷凍干燥2天，獲得凍干菌體。脂肪酶基因工程菌的凍干菌體的脂肪酶活力(按上述酶活測定方法，R,S-2-苯氧丙酸乙酯水解活性)經(jīng)過測定為363.1U/g，是野生菌米曲霉WZ007菌體細(xì)胞(24.2U/g)的15倍。

本發(fā)明米曲霉脂肪酶活力測定方法為：1.5mL離心管中加入990μL Tris-HCl緩沖液(pH8.0，50mM)、10μL R,S-2-苯氧丙酸乙酯，混合后再加0.01g酶粉，30℃水浴搖床200rpm轉(zhuǎn)速條件下反應(yīng)30min，取200μL酶反應(yīng)液，加入1mL乙酸乙酯萃取，用無水Na₂SO₄除水后，以手性氣相色譜檢測R,S-2-苯氧丙酸乙酯，并以此計算底物對映體過量值e.e._s、轉(zhuǎn)化率c和酶活力。酶活定義：在50mM pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，30℃條件下，每分鐘將1μmol的(S)-2-苯氧丙酸乙酯水成(S)-2-苯氧丙酸所需的酶量。R,S-2-苯氧丙酸乙酯氣相色譜檢測方法：氣相柱：BGB-174手性柱)；載氣為N2(70kPa)；進(jìn)樣口溫度：220℃；空氣流量300mL/min；氫氣流量30mL/min；分流比50:1；進(jìn)樣量1μL；柱箱升溫程序：初始溫度120℃保持2min，5℃/min升溫至200℃，保持2min；FID檢測其溫度：250℃。

所得的重組基因工程菌經(jīng)超聲波破碎(超聲4s，間隔4s，有效超聲時間60min)后，離心去除細(xì)胞碎片，所得的上清液即為粗酶液。重組蛋白的N端帶有6×His-tag純化標(biāo)簽，利用Ni-NTA柱(HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column)純化粗酶液。先用10個柱體積平衡緩沖液(50mM Tris-HCl，500mM NaCl和20mM咪唑，pH 8.0)平衡Ni-NTA柱，接著以1mL/min的速率上樣粗酶液，然后用平衡緩沖液洗脫以除去未吸附的蛋白，再用洗脫緩沖液(50mM Tris-HCl，500mM NaCl和500mM咪唑，pH 8.0)洗脫(2mL/min)，收集目標(biāo)蛋白。酶液在Tris-HCl緩沖液(50mM，pH 8.0)中透析過夜，并進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖5。

該純化后的酶液，凍干后獲得酶粉的酶活力(按上述酶活測定方法，R,S-2-苯氧丙酸乙酯水解活性)為1560U/g，表明該脂肪酶基因在大腸桿菌Trans B(DE3)中成功實現(xiàn)過量表達(dá)。

實施例3：

以實施例2中獲得含有重組脂肪酶的大腸桿菌Trans B(DE3)/pEASY-E1-aol凍干菌體為生物催化劑，催化拆分(R,S)-2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯，從而制備(R)-2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯。在5mL反應(yīng)體系中，取50mg凍干的重組菌體(10g/L)，加入5mL pH8.0的0.2M的磷酸鹽緩沖液，充分振蕩混勻，制成菌懸液，加入底物外消旋EHPP(見表1)，在水浴搖床中30℃、250rpm條件下進(jìn)行水解反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，用4M稀鹽酸調(diào)pH至2，再加入5mL乙酸乙酯萃取，有機層取20μL，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，然后加入1mL的流動相溶解，除水后制成液相檢測樣品，對底物及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行液相色譜分析。CHIRALPAK AD-H手性柱(46cm×25cm,Diacel chemical,Japan)。分析條件包括：流動相：色譜級正己烷/異丙醇＝73/7，流速：0.8ml/min，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10μl；檢測波長為274nm。結(jié)果見表1。

表1結(jié)果表明，重組大腸桿菌能高效拆分(R,S)-2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯。在凍干菌體量都為10g/L添加量，反應(yīng)時間都為2h的情況下，最高0.5mol/L的(R,S)-2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯能反應(yīng)掉，轉(zhuǎn)化率和e.e.S分別為50.1％和99.2％。而0.6mol/L的(R,S)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯在反應(yīng)2h后轉(zhuǎn)化率降為36.7％。并且整個反應(yīng)過程中產(chǎn)物光學(xué)純度都在99％以上。

表1：重組酶凍干菌體催化拆分(R,S)-2-(4-羥基苯氧基)丙酸乙酯