本發(fā)明涉及微生物，進(jìn)一步來說，涉及解淀粉芽孢桿菌，特別涉及用解淀粉芽孢桿菌GUHP86提高豬血蛋白水解度的方法。

背景技術(shù)：

新鮮豬血傳統(tǒng)的利用辦法是蒸煮法，即直接加熱或蒸干豬血制成血塊或者血粉供人畜食用。也有將新鮮豬血蒸汽凝結(jié)后再離心脫水、通過氣流干燥制備豬血血粉的方法。這些方法存在較大的營養(yǎng)缺陷：①不易消化，一是由豬血本身的血球蛋白結(jié)構(gòu)所致，二是蒸煮法的蒸煮、干燥過程會(huì)導(dǎo)致豬血中蛋白質(zhì)、氨基酸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而破壞氨基酸質(zhì)量；②豬血中氨基酸組成不均衡，其中亮氨酸和異亮氨酸比例失調(diào)，影響了血粉的品質(zhì)；③適口性差，豬血本身具有的血腥味和血粉的其他異味所造成的。正因如此，豬血雖然有很高的應(yīng)用價(jià)值，但是人們對(duì)其直接應(yīng)用卻很少，大部分都是被廢棄掉了。

近年來一個(gè)研究熱點(diǎn)是利用微生物產(chǎn)復(fù)合酶的性質(zhì)，將產(chǎn)蛋白酶微生物接種在新鮮豬血中生長、并對(duì)豬血進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵水解豬血中蛋白質(zhì)，可以有效地降解新鮮豬血中的大分子蛋白質(zhì)，有效地分解豬血中蛋白質(zhì)變成小分子肽，大大提高豬血產(chǎn)品中氨基酸含量，豬血液態(tài)發(fā)酵后的初產(chǎn)品中還會(huì)有更多的營養(yǎng)元素如纖維素，植酸等營養(yǎng)成分，使得液態(tài)發(fā)酵豬血產(chǎn)品有更多的利用價(jià)值，也就大大提高豬血的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。而且微生物源的蛋白酶顯示出明顯優(yōu)勢(shì)：微生物繁殖速度快，在合適的條件下半小時(shí)左右就可以繁殖一代；微生物種類繁多，酶的品質(zhì)齊全，不同的生存環(huán)境會(huì)產(chǎn)生不同種類的酶，如嗜溫菌、嗜鹽菌、嗜堿菌、嗜酸菌等。

經(jīng)檢索，在中國專利數(shù)據(jù)庫中涉及豬血蛋白的申請(qǐng)件不多，僅有2009100679543號(hào)《一種利用豬新鮮胰酶生產(chǎn)豬血蛋白肽與血紅素的技術(shù)》、ZL2013104252308號(hào)《一種高性能的豬血蛋白粉制備裝置》和ZL2013104250035號(hào)《一種環(huán)保高效的豬血蛋白粉制備裝置》。這些方案均有一定實(shí)際應(yīng)用，但至今為止，尚無用解淀粉芽孢桿菌提高豬血蛋白水解度的申請(qǐng)件。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供用解淀粉芽孢桿菌GUHP86提高豬血蛋白水解度的方法，通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件來提高解淀粉芽孢桿菌GUHP86對(duì)豬血蛋白的水解度，改善豬血風(fēng)味和提高其營養(yǎng)價(jià)值。

為達(dá)到上述目的，發(fā)明人提供的用解淀粉芽孢桿菌GUHP86提高豬血蛋白水解度的方法包括以下步驟：

⑴制備菌種培養(yǎng)基

按照以下物料配方制備菌種培養(yǎng)基：

取豬血粉15.0g，NaCl 5.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，CaCl₂0.1g，K₂HPO45.0g，pH 7.0，蒸餾水1000mL，混合均勻，于121℃下滅菌20min，得到菌種培養(yǎng)基，備用；

⑵制備發(fā)酵菌種液：

在250mL三角瓶內(nèi)，挑取2環(huán)初篩斜面將解淀粉芽孢桿菌GUHP86接入菌種培養(yǎng)基，裝液量50mL，于30℃下以轉(zhuǎn)速為180r/min搖床培養(yǎng)24h，即得發(fā)酵菌種液，備用；

⑶選取發(fā)酵培養(yǎng)基

選用新鮮豬血作為發(fā)酵培養(yǎng)基；

⑷制備發(fā)酵液

將發(fā)酵菌種液按6％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃下以轉(zhuǎn)速 為180r/min的搖床培養(yǎng)48h，然后在4℃下以轉(zhuǎn)速為10000r/min的離心分離機(jī)離心10min，得到的發(fā)酵上清液即為發(fā)酵液；

⑸催化水解豬血蛋白

將上述發(fā)酵液與新鮮豬血混合發(fā)酵，進(jìn)行催化水解豬血蛋白。

上述解淀粉芽孢桿菌GUHP86(Bacillus amyloliquefaciens GUHP86)已于2016年1月4日保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，該中心地址是:中國武漢·武漢大學(xué)，郵政編碼為430072；簡(jiǎn)稱解淀粉芽孢桿菌GUHP86，保藏編號(hào)為CCTCC NO.M 2016003，該菌株系從中國貴州貴陽生豬屠宰的屠宰場(chǎng)周圍土壤樣本中分離得到。

豬血蛋白水解度的計(jì)算公式如下：

(菌株水解豬血蛋白的含量/發(fā)酵培養(yǎng)基中豬血蛋白的含量)x100％

本發(fā)明的用解淀粉芽孢桿菌GUHP86提高豬血蛋白水解度的方法是一種優(yōu)化的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)方法，與傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵相比，本發(fā)明具有以下有益效果:液態(tài)發(fā)酵時(shí)，菌種與底物便于混合均勻，使其充分接觸，縮短發(fā)酵時(shí)間，提高水解效率。本發(fā)明的方法用于發(fā)酵生產(chǎn)的蛋白酶可高效催化水解豬血蛋白，使其在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，水解度達(dá)到最大，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。采用本發(fā)明優(yōu)化后的培養(yǎng)條件，該解淀粉芽孢桿菌GUHP86對(duì)豬血蛋白的水解度達(dá)28.23％，比優(yōu)化之前提高0.42倍。本發(fā)明適用于解淀粉芽孢桿菌GUHP86液態(tài)發(fā)酵豬血培養(yǎng)。

附圖說明

圖1為不同轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)菌株GUHP86水解豬血蛋白水解度的影響；

圖2為發(fā)酵培養(yǎng)溫度對(duì)菌株GUHP86水解豬血蛋白水解度的影響；

圖3為不同接種量菌株GUHP86水解豬血蛋白水解度的影響；

圖4為發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間菌株GUHP86水解豬血蛋白水解度的影響；

圖5為溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)豬血蛋白水解度的響應(yīng)面圖；

圖6為溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)豬血蛋白水解度的等高線圖；

圖7為溫度和接種量對(duì)豬血蛋白水解度的響應(yīng)面圖；

圖8為溫度和接種量對(duì)豬血蛋白水解度的等高線圖；

圖9為溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)豬血蛋白水解度的響應(yīng)面圖；

圖10為溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)豬血蛋白水解度的等高線圖；

圖11為發(fā)酵時(shí)間和接種量對(duì)豬血蛋白水解度的響應(yīng)面圖；

圖12為發(fā)酵時(shí)間和接種量對(duì)豬血蛋白水解度的等高線圖；

圖13為發(fā)酵時(shí)間及轉(zhuǎn)速對(duì)豬血蛋白水解度的響應(yīng)面圖；

圖14為發(fā)酵時(shí)間及轉(zhuǎn)速對(duì)豬血蛋白水解度的等高線圖；

圖15為接種量和轉(zhuǎn)速對(duì)豬血蛋白水解度的響應(yīng)面圖；

圖16為接種量和轉(zhuǎn)速對(duì)豬血蛋白水解度的等高線圖；

圖17為解淀粉芽孢桿菌GUHP86液態(tài)發(fā)酵豬血培養(yǎng)方法流程圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1本發(fā)明所涉及到的用解淀粉芽孢桿菌GUHP86提高豬血蛋白水解度的方法

從中國貴州貴陽生豬屠宰的屠宰場(chǎng)周圍土壤樣本中分離得到的解淀粉芽孢桿菌GUHP86，于2016年1月5日保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO.M 2016003。

⑴制備菌種培養(yǎng)基

按照以下物料配方制備菌種培養(yǎng)基：

取豬血粉15.0g，NaCl 5.0g，MgSO₄·7H₂O0.2g，CaCl₂0.1g，K₂HPO45.0g，pH 7.0，蒸餾水1000mL，混合均勻，于121℃下滅菌20min，得到菌種培養(yǎng)基，備用；

⑵制備發(fā)酵菌種液：

在250mL三角瓶內(nèi)，挑取2環(huán)初篩斜面將解淀粉芽孢桿菌GUHP86接入菌種培養(yǎng)基，裝液量50mL，于30℃下以轉(zhuǎn)速為180r/min搖床培養(yǎng)24h， 即得發(fā)酵菌種液，備用；

⑶選取發(fā)酵培養(yǎng)基

選用新鮮豬血作為發(fā)酵培養(yǎng)基；

⑷制備發(fā)酵液

將發(fā)酵菌種液按6％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃下以轉(zhuǎn)速為180r/min的搖床培養(yǎng)48h，然后在4℃下以轉(zhuǎn)速為10000r/min的離心分離機(jī)離心10min，得到的發(fā)酵上清液即為發(fā)酵液；

⑸催化水解豬血蛋白

將上述發(fā)酵液與新鮮豬血混合發(fā)酵，進(jìn)行催化水解豬血蛋白。

實(shí)施例2以不同的溫度、時(shí)間、接種量及搖床轉(zhuǎn)速分別考察解淀芽孢桿菌GUHP86水解豬血的條件，在單因素的基礎(chǔ)上，再對(duì)解淀粉芽孢桿菌GUHP86進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定最佳的水解條件，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。以豬血蛋白水解度為指標(biāo)確定菌株水解豬血的作用條件范圍

1單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1發(fā)酵培養(yǎng)溫度對(duì)豬血蛋白水解度的影響

水解時(shí)間48h，接種量6％，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，溫度分別調(diào)至10、20、30、40、50℃。

1.2水解時(shí)間對(duì)豬血蛋白水解度的影響

溫度30℃，接種量6％，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間分別取24h、36h、48h、60h、72h。

1.3接種量對(duì)豬血水解度的影響

溫度30℃，水解時(shí)間48h，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，接種量分別為2％、4％、6％、8％、10％。

1.4搖床轉(zhuǎn)速對(duì)豬血水解度的影響

溫度30℃，水解時(shí)間為48h，接種量為發(fā)酵液的6％，搖床轉(zhuǎn)速分別 為160r/min、170r/min、180r/min、190r/min、200r/min。

單因素結(jié)果見圖1-圖4。

2Box-Benhnken試驗(yàn)

在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)Box-Benhnken試驗(yàn)，優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌GUHP86對(duì)豬血蛋白的培養(yǎng)條件。選取(X₁)、發(fā)酵時(shí)間(X₂)、接種量(X₃)及轉(zhuǎn)速(X₄)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，建立了豬血蛋白水解度的數(shù)學(xué)模型。Box-Benhnken試驗(yàn)結(jié)果見圖5-10。

表1菌株GUHP86水解豬血蛋白響應(yīng)面分析因素和水平

表2菌株GUHP86水解豬血蛋白試驗(yàn)結(jié)果

表3菌株GUHP86水解豬血蛋白試驗(yàn)方差分析

注：“*”：P＜0.05顯著水平；“**”：P＜0.01極顯著水平

通過響應(yīng)面軟件將表2中的結(jié)果即豬血蛋白的水解度經(jīng)方差分析和擬合，就可獲得所有因子的顯著性(見表3)，獲得豬血蛋白水解度響應(yīng)值(Y)對(duì)自變量發(fā)酵液的溫度(X₁)、發(fā)酵時(shí)間(X₂)、接種量(X₃)及轉(zhuǎn)速(X₄)的二次多項(xiàng)回歸模型方程為：

Y＝+22.69+0.39X1+0.84X₂+0.28X₃-0.27X₄+1.39X₁X₂+0.22X₁X₃+0.36X₁X₄+0.30X₂X₃-0.27X₂X₄-0.19X₃X₄-1.98X₁₂+0.27X₂₂+0.58X₃₂-6.67X₄₂。

表3表明新建的模型P＜0.01，即極顯著，表明方程和試驗(yàn)結(jié)果擬合度較好。還能得出，一次項(xiàng)中X₂極顯著，說明發(fā)酵時(shí)間(X₂)對(duì)豬血蛋白水解度的影響為極顯著；方程的一次項(xiàng)X₁X₂為顯著；方程的二次項(xiàng)X₁和X₄為極顯著。

采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件對(duì)模型分析，可以得到所有響應(yīng)面和其對(duì)應(yīng)的等高線圖。通過軟件繼續(xù)對(duì)二次回歸方程進(jìn)行分析以取得最優(yōu)值，即發(fā)酵液的溫度(X₁)為35℃、接種量(X₃)為7％、發(fā)酵時(shí)間(X₂)為60h、搖床轉(zhuǎn)速(X₄)為179.6r/min時(shí)，響應(yīng)值水解度達(dá)到最大值為28.23％, 與優(yōu)化前相比提高0.42倍。發(fā)酵后豬血無血腥味，有發(fā)酵所特有的香味。