本發(fā)明是經(jīng)過分離、篩選、多次純化、生理、生化鑒定得到的一種病原微生物—細(xì)菌,該菌為蘇云金芽胞桿菌以色列亞種(Bacillusthuingiensis subsp israelensis 簡稱Bti)。該菌在實(shí)驗(yàn)室做了大量分離、篩選、純化、生理、生化鑒定、16SDNA序列分析和多種動(dòng)物的慢性、亞急性、急性等安全性試驗(yàn)外,還進(jìn)行搖瓶、小罐、中灌、大罐和10噸灌生產(chǎn)發(fā)酵。除了能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)外,更重要的是,還要篩選出能夠適宜Bti發(fā)酵生長良好所需要的碳源、氮源、磷源培養(yǎng)基有效成分。本公司在長期生產(chǎn)發(fā)酵中,研制了出適宜Bti發(fā)酵生長旺盛、芽孢數(shù)量多、芽孢質(zhì)量好、高質(zhì)量形成晶體蛋白毒素(該Bti菌株在發(fā)酵生長過程中能產(chǎn)生5種以上晶體蛋白毒素)的培養(yǎng)基。蘇云金芽孢桿菌以色列亞種(Bti)是一種重要的兼型病原微生物—細(xì)菌,已知可分為40個(gè)血清種和54個(gè)血清亞種,對蚊幼蟲—孑孓有毒效的菌株有3種,血清型為H-14(以色列亞種)、PG-14(摩氏變種)和73-E10-2(達(dá)姆施塔特變種),應(yīng)用最廣的是蘇云金芽孢桿菌以色列亞種。BtHi-14由Goldbery(1972)和Margelit(1977)在以色列分離出。該菌對蚊幼蟲—孑孓有較高的專一性,在宿主腸道內(nèi),晶體蛋白原毒素在高pH值和適合的酶的作用下,很快轉(zhuǎn)變?yōu)檩^小的有毒亞單位,蚊幼蟲—孑孓吞食晶體蛋白后,引起中腸細(xì)胞破裂得敗血病癥而死亡。我國20世紀(jì)70年代開始對以色列亞種進(jìn)行中試生產(chǎn),生產(chǎn)的殺蚊幼劑在野外污水池、水稻田以濃度1~3mg/L應(yīng)用,24小時(shí)殺滅庫蚊,對伊蚊幼蟲—孑孓防治效果達(dá)90%,對按蚊幼蟲—孑孓也有良好效果。至今該制劑年產(chǎn)數(shù)百萬噸,主要用來殺滅容器積水中的伊蚊幼蟲—孑孓,特別是飲水水缸中的埃及伊蚊幼蟲—孑孓。在我國南、北方有較大面積的應(yīng)用,施藥1~2天后蚊幼蟲—孑孓密度明顯下降,有效率均在93%~95.3%。國內(nèi)研制的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種—187漂浮顆粒劑防治水稻田里的中華按蚊,持效期為16天;巴州點(diǎn)綠農(nóng)林科技有限公司研制的殺蚊幼制劑—孑孓清在野外蘆葦濕地、污水處理廠、水稻田、養(yǎng)殖場污水排放區(qū)域等地施藥1天后,查結(jié)果,殺死淡色庫蚊幼蟲—孑孓98%、殺死中華按蚊幼蟲—孑孓100%、殺死致倦庫蚊幼蟲—孑孓100%、殺死兇小庫蚊幼蟲—孑孓99%、殺死曼蚊幼蟲—孑孓100%、殺死和吶蚊幼蟲—孑孓98%,有的區(qū)域100%。持效期都在45天以上,效果穩(wěn)定。
背景技術(shù):
殺蚊幼制劑-孑孓清使用的細(xì)菌是分離到的一株蘇云金芽孢桿菌以色列亞種;屬革蘭氏陽性長桿菌,在適宜的pH值和營養(yǎng)充足條件下,桿菌在生長發(fā)育過程中,能形成橢圓形孢子。桿菌在生長發(fā)育形成孢子最后階段時(shí),生長成為具有極強(qiáng)殺傷力的蛋白毒素-蛋白晶體。蚊幼蟲—孑孓取食蛋白晶體進(jìn)入消化道后,被堿性腸液破壞成較小單位的δ-內(nèi)毒素,破壞蚊幼蟲—孑孓的胃蛋白酶,使中腸停止蠕動(dòng),中腸上皮細(xì)胞慢慢解離,蚊幼蟲—孑孓開始停止取食。芽孢在蚊幼蟲—孑孓的中腸開始萌發(fā),經(jīng)被破壞的腸壁進(jìn)入血腔后開始大量繁殖,最后致使蚊幼蟲—孑孓全身癱瘓,使蚊幼蟲—孑孓得敗血病癥而死。
殺蚊幼制劑—孑孓清產(chǎn)品功能:殺蚊幼蟲—孑孓廣譜、效果穩(wěn)定、持效期長,對人、畜、禽和有益昆蟲無毒、無害,應(yīng)用安全、使用方便、省工省時(shí)、不污染環(huán)境、運(yùn)輸方便、靶目標(biāo)準(zhǔn)確、性能穩(wěn)定。是殺滅蚊幼蟲—孑孓、有效控制和減少成蚊密度、把成蚊傳播絲蟲病、登革熱、瘧疾、黃熱病、腦炎、盤尾絲蟲病,蟲媒病毒傳染病的傳播等降到最低限度。長期使用,不產(chǎn)生抗性,還能徹底凈化水質(zhì)。
殺蚊幼制劑—孑孓清作用機(jī)理:主要活性成分是半包晶體-蛋白毒素。蚊幼蟲-孑孓取食后,很快能破壞孑孓的胃蛋白酶,被堿性腸液破壞成較小單位的δ-內(nèi)毒素。使中腸停止蠕動(dòng),中腸上皮細(xì)胞慢慢解離,蚊幼蟲—孑孓開始停止取食。芽孢在蚊幼蟲—孑孓中腸萌發(fā),經(jīng)被破壞的腸壁進(jìn)入血腔后開始大量繁殖,致使蚊幼蟲—孑孓全身癱瘓,使蚊幼蟲—孑孓,無能力再取食而得敗血病癥死亡。
殺蚊幼制劑—孑孓清用量:水域區(qū)為1-3ml /m2。家禽、家畜飼養(yǎng)場、養(yǎng)豬場、養(yǎng)牛場、污水處理廠、城市水管網(wǎng)區(qū)、城市下水道、河流、堰塘等區(qū)域蚊幼蟲—孑孓發(fā)生量嚴(yán)重區(qū)域、或是有機(jī)質(zhì)含量高的區(qū)域,為3-5 ml / m2。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
:本發(fā)明主要用于殺蚊幼制劑——孑孓清產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方。
培養(yǎng)基配方(%) (LB斜面培養(yǎng)基全球通用在此處省略)
發(fā)酵液體培養(yǎng)基:
酵母粉 3.0
玉米漿 2.5
葡萄糖 2.0
氯化鈣 0.1 (CaCl)
碳酸鈣 0.1 (CaCO3)
磷酸二氫鉀 0.1?。↘H2P04)
添加劑 0.3 復(fù)合維生素若干
pH值(滅菌前) 7.5
碳源、磷源培養(yǎng)基:
碳源 2.5
磷酸二氫鉀 0.3 ?。↘H2PO4)
氯化鈣 0.2 (CaCl2)
氯化鋅 0.03 ?。╖nCl2 )
三氯化鐵 0.05 (FeCl3 )
氯化鎂 0.005 ?。∕gC12)
氯化鈷 0.005 ?。–oC12)
氯化銅 0.005 (CuC12 )
添加劑 0.3
復(fù)合維生素若干;
氮源、磷源培養(yǎng)基:
氮源 2.7
磷酸二氫鉀 0.3 ?。↘H2 PO4)
磷酸氫二鉀 0.3 ?。↘2 HPO4)
氯化鈣 0.2 ?。–aC12)
氯化鋅 0.05 (ZnC12)
三氯化鐵 0.05 (FeC13)
氯化鈷 0.005 (CoC12)
氯化銅 0.005?。–uC12)
添加劑 0.3
復(fù)合維生素若干:
單一碳源、氮源配方篩選原料:
山芋粉,馬鈴薯粉,木薯粉,玉米餅粉,玉米粉,糖蜜。
單一氮源配方篩選原料
蛋白胨,酵母粉,黃豆餅粉,蠶蛹粉,魚粉,花生餅粉,棉籽餅粉(不要抗蟲棉的棉籽餅)。
蘇云金芽孢桿菌以色列亞種幾丁質(zhì)酶氨基酸序列
Ichi 151 DCDKYARCGNFGELKRLKAKYPHLKTIISVGGWTWSNRFSDMAADEKTRKVFAFSTVAFL
Ac 243 SAWDEPYKGNFGNLMALKQAHPDLKILPSVGGWTLSDPFYFLG-DKTKRDTFVASVREFL
Al 241 VDAKDPIRGVYSQLMALKQRYPDLKILPSVGGWTLSDPFHGFT-NKANPDTFVASVKQFL
BcAl 132 DTWDQPIAGNINQLNKLKQTNPNLKTIISVGGWTWSNRFSDVAATAATREVFANSAVDFL
Bl 128 DVWDEPIRGNFKQLLKLKKSHPHLKTFISVGGWTWSNRFSDVAADPVARGNFAASAVEFL
Bs 125 DTWDEPIRGNFKQLLKLKKNHPHLKTFISVGGWSWSNRFSDVAADPAARENFAASAVNFL
Ct 91 AILDTPIRGHFGQLIKYKEQYPHVRTLISVGGWTESKYFSDVALTEESRNTFADSCVEFL
Sm 243 TAWDDPYKGNFGQLMALKQAHPDLKILPSIGGWTLSDPFFFMG-DKVKRDRFVGSVKEFL
Ichi 211 RAYG-FDGVDLDWEYPGVETIPGGSYRP-EDKQNFTLLLQDVRNALN
Ac 302 QTWKFFDGVDIDWEFPGGQGANPSLGGP-NDGATYVVLMKELRAMLD
Al 300 KTWKFYDGVDIDWEFPGGDGPNPDLGDPINDGPAYVALMQELRAMLD
BcAl 192 RKYN-FDGVDLDWEYPVSGGLDGNSKRP-EDKQNYTLLLSKIREKLD
Bl 188 RKYG-FDGVDLDWEYPVSGGLPGNSTRP-EDKFNYTLLLQEVRKKLD
Bs 185 RKYG-FDGVDLDWEYPVSGGLPGNSTRP-EDKFNYTLLLQDVREKLD
Ct 151 RTYR-FDGVDIDWEYPVSGGMPENIRRP-EDKQNFTLLLKCLREKLD
Sm 302 QTWKFFDGVDIDWEFPGGKGANPNLGSP-QDGETYVLLMKELRAMLD