本發(fā)明屬于ACAs領(lǐng)域，特別涉及一種用于研究ACAs的報(bào)告基因質(zhì)粒及其建立方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腎上腺是人體非常重要的內(nèi)分泌器官，分為腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)，分別分泌皮質(zhì)類甾醇和鄰苯二酚胺(例如皮質(zhì)醇和腎上腺素)共同調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝、水鹽平衡及對應(yīng)激的反應(yīng)。抵抗素(Resistin)，作為一種脂肪因子，在嚙齒類動物中主要由成熟脂肪細(xì)胞合成分泌，在人體主要來自于炎癥細(xì)胞，比如中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等。很多研究報(bào)道，在肥胖人群和小鼠中，血清抵抗素水平上調(diào)，并和肥胖和胰島素抵抗程度呈正相關(guān)關(guān)系。另外，抵抗素也是炎癥和動脈粥樣硬化發(fā)生的重要促進(jìn)因素。一些研究表明，在年齡、性別和BMI匹配的人群中，血清抵抗素的水平在庫欣綜合征患者中明顯升高，并且抵抗素水平和BMI呈正相關(guān)關(guān)系。同時(shí)，Ermetici等研究發(fā)現(xiàn)血清抵抗素在腎上腺意外瘤患者中顯著升高。然而，庫欣綜合征患者血清抵抗素升高的原因以及調(diào)控的相關(guān)因素尚不完全清楚。盡管脂肪因子主要來源于脂肪細(xì)胞，但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn)除了脂肪組織，一些其他的組織器官也能合成分泌一些脂肪因子。Kim等研究發(fā)現(xiàn)，促性腺激素釋放激素(GnRH)可以顯著抑制大鼠原代垂體細(xì)胞和LbT2促性腺激素細(xì)胞系脂聯(lián)素(Adiponectin)的合成，這一過程主要介由鈣離子和PKA信號通路來傳遞。而Nogueiras等研究者還證明在大鼠中，抵抗素在其他組織，包括腎上腺中也有適量的表達(dá)。除此之外，也有研究證實(shí)在人胰島、脾臟和骨髓細(xì)胞中也有抵抗素表達(dá)。然而，在人腎上腺組織中是否有抵抗素合成尚不清楚。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于研究ACAs的報(bào)告基因質(zhì)粒及其建立方法與應(yīng)用，本發(fā)明構(gòu)建了含resistin啟動子的報(bào)告基因質(zhì)粒，建立方法簡單，成本低，可以用于表達(dá)PRKACA對抵抗素啟動子轉(zhuǎn)錄的影響，為腎上腺抵抗素分泌相關(guān)的研究提供了新的思路。本發(fā)明的一種用于研究ACAs的報(bào)告基因質(zhì)粒，所述報(bào)告基因質(zhì)粒為含resistin啟動子的報(bào)告基因質(zhì)粒，resistin啟動子的序列如SEQNo.1所示。本發(fā)明的一種用于研究ACAs的報(bào)告基因質(zhì)粒的建立方法，包括：(1)將帶有pGL4.15的DH5α接種于裝有LB/氨芐青霉素的培養(yǎng)管中，然后在37℃搖床中培養(yǎng)12～16小時(shí)，擴(kuò)增質(zhì)粒；離心沉淀，加入細(xì)胞懸浮液、堿裂解液和中和液，經(jīng)清洗、離心得到質(zhì)粒；(2)將上述質(zhì)粒經(jīng)HindIII和XhoI酶切，加入上樣緩沖液，凝膠電泳純化，回收；(3)設(shè)計(jì)上下游引物，與經(jīng)過步驟(2)的質(zhì)粒用連接酶鏈接，最后采用熱擊法轉(zhuǎn)化感受態(tài)，即可；其中，引物序列為RETN-XhoI-FGCTCGCTAGCCTCGAGGAAAGCAAGATGGAGGGTGCCAG；RETN-HindIII-RCCGGATTGCCAAGCTTGATCAGCCCTGCCCTGTGGGGA。所述步驟(1)中的細(xì)胞懸浮液含100ug/mlRnase。所述步驟(2)中的HindIII和XhoI的酶切體系為：10×NEBbuffer2μl，HindIII1μl，XhoI1μl，純化BSA0.2μl，H2O11.8μl，DNA模板1μl。所述步驟(3)中的連接酶為T4DNA連接酶。本發(fā)明的一種用于研究ACAs的報(bào)告基因質(zhì)粒的應(yīng)用，用于表達(dá)PRKACA對抵抗素啟動子轉(zhuǎn)錄的影響。有益效果本發(fā)明構(gòu)建了含resistin啟動子的報(bào)告基因質(zhì)粒，建立方法簡單，成本低，可以用于表達(dá)PRKACA對抵抗素啟動子轉(zhuǎn)錄的影響，為腎上腺抵抗素分泌相關(guān)的研究提供了新的思路。附圖說明圖1為在H295R和SW13細(xì)胞中過表達(dá)PRKACA對于resistin啟動子活性影響；圖2A為在H295R細(xì)胞中過表達(dá)L205R突變與野生型PRKACA對resistin表達(dá)的影響；B為攜帶PRKACAL205R突變的ACAs組織resistin的mRNA水平與野生型的比較；C為野生型和突變型ACAs的蛋白水平比較。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1(一)空載質(zhì)粒擴(kuò)增、抽提、檢測(1)將帶有pGL4.15的DH5α接種于裝有5mlLB/氨芐青霉素的10～20ml的培養(yǎng)管中，然后在37℃搖床中培養(yǎng)12～16小時(shí)，以擴(kuò)增質(zhì)粒。(2)取5.0ml左右的菌液，于室溫(20℃左右)，9000g離心1分鐘以沉淀菌種。(3)倒出或吸出培養(yǎng)基，往沉淀中加入250μl細(xì)菌懸浮液P1(含Rnase100μg/ml)，漩渦振蕩使細(xì)胞完全重新懸浮。細(xì)胞沉淀的完全重懸對于獲得高的產(chǎn)量十分重要。(4)往重懸混和液中加入250μl堿裂解液P2，立即溫和顛倒混勻5～10次。如有必要，可把裂解液置于室溫靜置2～4分鐘使體系變得清亮。避免劇烈混和裂解液，否則會使染色體DNA斷裂而使得到的質(zhì)粒純度降低。裂解反應(yīng)不要超過5分鐘。當(dāng)使用完堿裂解液以后，須蓋緊瓶蓋保存，避免與空氣中的CO2反應(yīng)。(5)往上述混合液中加入350μl中和液P3，溫和地上下顛倒離心管5～10次，混勻，直至形成白色絮狀沉淀?；靹蚝蟊?分鐘，以提高質(zhì)量。(6)室溫，≥12000g離心10分鐘。(7)將上清液小心移至吸附柱(一定要避免吸到沉淀)，9000g離心1分鐘。倒掉收集管中的液體，把吸附管放回收集管。(8)在吸附柱中加入250μl的清洗液B1，靜置1分鐘，9000g離心1分鐘。(9)在吸附柱中，直接加入250μl的清洗液SW液，靜置1分鐘，9000g離心1分鐘。倒掉收集管中液體，將吸附柱放回收集管。(10)在吸附柱中加入600μl的洗滌液WGP，9000g離心1分鐘。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放回收集管。(11)加入250μl的WGP液，離心2分鐘。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放回收集管，9000g空轉(zhuǎn)2分鐘。(12)將在吸附柱放入干凈的1.5ml的Ep管中，加25μl的ddH2O溶解質(zhì)粒，靜置5分鐘后，9000g離心1分鐘，棄離心柱，收集質(zhì)粒DNA。(13)將吸附柱移入一個(gè)干凈的1.5mlEp管中，在吸附柱中加入T1液50μl，室溫靜置3分鐘后，13000g室溫離心3分鐘。將Ep管中收集到的DNA輕輕混勻，以NanoDrop測定濃度后儲存于-20℃。(上述步驟所用試劑均來自于protocal試劑盒)(二)酶切以及載體純化取0.2ml的PCR小管，按照下表配制酶切體系(20μl)，冰上操作。10×NEBbuffer2μlXhoI1μlHindIII1μlPurifiedBSA0.2μlH2O11.8μlDNA模板1μlPCR儀上，37℃，孵育2～3小時(shí)。(三)載體質(zhì)粒純化，回收(1)制膠：膠的濃度為1.2～1.5％，把干燥的制膠板的兩端封好，水平放置在工作臺上；調(diào)整好梳子的高度；在10ml0.5×TBE緩沖液，加入1.2-1.5g瓊脂糖，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至45～50℃時(shí)倒入制膠板中；凝膠凝固后，小心拔去梳子把膠取出，放入電泳緩沖槽中，加入電泳緩沖液。(2)點(diǎn)樣：將酶切好的質(zhì)粒20μl加2.5μl上樣緩沖液，混勻后點(diǎn)入加樣孔，中間一孔是DNAmarker，marker一般加5～10μl。(3)電泳：電壓140V，10～15分鐘。(4)觀察：電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放入凝膠成像儀中，打開電腦中的genesnap軟件，觀察?？梢姌颖居幸幻黠@條帶。(5)割膠純化：在紫外燈下，用刀片切割含條帶的膠，分別放入干凈1.5ml的Ep管中。(四)質(zhì)?；厥?1)每管加入bufferS1400μl，覆蓋住膠即可，最少200μl。(2)放入55～60度烘箱，10分鐘左右，期間觀察膠溶解的情況，如有碎塊，可稍震蕩一下，再溶解1～2分鐘。(3)吸出已溶解的膠和buffer，放入吸附管中，離心9000g，1分鐘。(4)取出柱子，棄管中液體，然后加500ulbufferW1洗，9000g，離心1分鐘，重復(fù)洗一次，9000g，離心1分鐘。(5)棄液體后空轉(zhuǎn)9000g，離心2分鐘，更換新的Ep管，加ddH2O，20μl溶10分鐘。(6)9000g，離心1分鐘。(五)載體連接(1)人RETN基因啟動子序列擴(kuò)增和純化：根據(jù)人RETN基因啟動子區(qū)設(shè)計(jì)上下游引物，包括RETN啟動子核心區(qū)域的片段。擴(kuò)增片段長度約為2200bp，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游+200bp，反應(yīng)以人基因組DNA為模板。①PCR引物序列：②在配制PCR反應(yīng)混合液之前，應(yīng)將每種試劑搖勻。在反應(yīng)混合液中添加了所有試劑之后，需要通過渦旋震蕩進(jìn)行攪勻。③PCR循環(huán)條件(2)準(zhǔn)備冰盒，提前拿出連接buffer(ligasebuffer)。(3)連接體系：10μl，0.2mlPCREp管，室溫(22℃)，連接15-20分鐘。2×ligasebuffer5μl啟動子區(qū)域片段3.5μl酶切純化后的載體0.5μlT4DNA連接酶1μl(六)轉(zhuǎn)化感受態(tài)，篩選陽性克隆并測序分析(熱擊法)準(zhǔn)備LB液配制試劑重量胰蛋白胨(Typtone)10克酵母提取物(YeastExtract)5克氯化鈉(NaCl)10克加入蒸餾水溶解，定容至1000ml用天平稱量4.5克瓊脂糖，加入上述配置好的300mlLB液中，高壓滅菌后于超凈臺內(nèi)按比例加入氨芐霉素或卡那霉素后混勻，鋪板，制成LB固體培養(yǎng)基平板，以封口膜塑封后放4℃待用。將剩余的LB液體按200ml/瓶分裝在錐形瓶里，高壓滅菌后放4℃待用。(1)取-80℃冰箱中的感受態(tài)DH5α菌種，置于冰上，用移液搶吹打幾次混勻。(2)取1.5mlEp管，每管加入50μl感受態(tài)和0.5μg質(zhì)粒，吹打均勻后，冰上放置30分鐘。(3)熱擊：42℃，水浴1.5分鐘。(4)冰鎮(zhèn)：置冰上5分鐘。(5)復(fù)蘇：每管加800～1000μlLB培養(yǎng)基；吹打均勻后，放入搖菌箱，設(shè)置160rpm搖40～60分鐘。(6)4000g，離心3分鐘后，棄部分上清，留200μl每管。(7)取提前準(zhǔn)備好的LB板，每板放入200μl質(zhì)粒，用三角玻璃棒反復(fù)輕推液體，以接種均勻。每次三角形的玻璃棒用后均浸泡在酒精中，然后在酒精燈上燒一會，涼好再用。(8)倒置培養(yǎng)皿，放入菌箱中上層，37℃，孵育14～16小時(shí)左右。(9)挑克隆，每個(gè)板取3～4個(gè)單克隆，每個(gè)克隆放入一個(gè)干凈的小搖管中。加入3mlLB液(Amp+或Kana+)，于37℃孵箱里，250rpm搖14～16小時(shí)，取1ml送上海博尚公司進(jìn)行測序，以驗(yàn)證插入片段是否為構(gòu)建的單鏈DNA。(七)質(zhì)粒小量抽提將測序結(jié)果顯示含成功插入RETN啟動子區(qū)域片段的載體的菌液進(jìn)行質(zhì)粒小抽。(八)熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染及檢測(1)報(bào)告基因轉(zhuǎn)染①將resistin啟動子報(bào)告基因質(zhì)粒各孔0.2μg/孔，對照和野生型和突變型PRKACA質(zhì)粒0.5ug/孔，PRL-TK20ng/孔，用Opti-MEMI型無血清培養(yǎng)液25μl稀釋，按1μg質(zhì)粒加2μlP3000比例加入稀釋液中，輕柔混勻。②使用前將Lipofectamine3000混勻，在優(yōu)化條件后取1μl/孔用Opti-MEMI型無血清培養(yǎng)液25μl稀釋，輕柔混勻。③將質(zhì)粒稀釋液與脂質(zhì)體稀釋液共50μl輕柔混勻，室溫下孵育5分鐘，待質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物形成。④將質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物按50μl/孔加入H295R或SW13細(xì)胞，并將24孔板前后左右輕柔振搖使其分布均勻。⑤轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行熒光素酶活性測定。(2)抽提蛋白①細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，PBS洗2次，24孔板的培養(yǎng)板每孔加入100μl的PLB裂解細(xì)胞，此步驟冰上操作。②放置在搖床上劇烈晃動30分鐘后，收集細(xì)胞裂解液。③4℃，13000g離心30分鐘，取上清檢測。(3)熒光酶活性測定①取50μl的LARⅡ于干凈的1.5ml離心管內(nèi)，加入20μl的細(xì)胞裂解液上清液，輕輕混勻。②立即放入熒光檢測儀測定。③加入50μlStop&GloReagent，輕輕混勻。④立即放入熒光檢測儀測定，并記錄數(shù)值。(九)結(jié)果為了研究PKA信號通路的激活對抵抗素轉(zhuǎn)錄水平的影響，利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)探究過表達(dá)PRKACA對抵抗素啟動子轉(zhuǎn)錄的影響。在腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞系H295R和SW13細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染野生型和突變型PRKACA質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染人抵抗素啟動子區(qū)域2.2kb(-2000至+200)。如圖1所示，與空載質(zhì)粒相比，野生型和突變型PRKACA過表達(dá)都可以上調(diào)抵抗素轉(zhuǎn)錄活性，而且突變型比野生型PRKACA對抵抗素的促進(jìn)作用更加明顯。在蛋白水平上看，野生型和突變型PPRKACA都可以促進(jìn)抵抗素蛋白表達(dá)，但兩者促進(jìn)抵抗素蛋白表達(dá)的能力沒有顯著差異(圖2A)。同樣，在人ACAs腫瘤組織中，抵抗素mRNA水平在PRKACA突變組中顯著上調(diào)(圖2B)，但在蛋白水平，resistin在突變和非突變組中沒有明顯差異(圖2C)。細(xì)胞中過表達(dá)突變型PRKACA可導(dǎo)致更高水平的PKA(Ser197)、CREB(Ser133)和ERK(Thr202/Tyr204)磷酸化，提示L205R是一種激活型突變，具有更強(qiáng)的激活PKA通路的能力。因此，PRKACAL205R突變可以提高PKA信號通路的活性，并通過cAMP/PKA/ERK這一信號通路參與腎上腺中抵抗素的表達(dá)調(diào)控。當(dāng)前第1頁1 2 3