本發(fā)明涉物種鑒定領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種花生物種特異性的基因序列，以及基于該基因序列的特異性引物組合，用于特異地檢測(cè)花生成分。

背景技術(shù)：

花生(學(xué)名：Arachis hypogaea，英文名稱：peanut)，原名落花生，為屬薔薇目，豆科一年生草本植物?；ㄉ?Arachis hypogaea)是花生屬(Arachis)唯一的栽培種?；ㄉ鞘秤玫鞍缀透哔|(zhì)量的食用油的重要來(lái)源，也是中國(guó)最重要的油料作物之一?；ㄉ屎土扛?、營(yíng)養(yǎng)豐富(含油45～55％；蛋白質(zhì)27～30％；碳水化合物6～23％；纖維素2％)，油粕蛋白質(zhì)含量達(dá)50％，還含有豐富的維生素E和B，是良好飼料?；ㄉ蔬€可進(jìn)一步制成花生奶粉、酸奶酪、糕點(diǎn)和膨化食品等?；ㄉo葉是良好飼料，含蛋白10～20％，木質(zhì)化程度低，并含豐富鈣和磷。花生果殼含纖維素70～80％，經(jīng)發(fā)酵后可作飼料，還可制成板材、膠粘劑、醬油、活性炭及化工原料。紅皮花生的種皮是一種中藥，有良好止血作用。

另一方面，花生是最容易感染黃曲霉的農(nóng)作物之一，黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的毒性和致癌性，而且黃曲霉毒素耐熱，在一般烹調(diào)加工的溫度下破壞很少。因此應(yīng)避免食用霉變后的花生。此外，花生還是重要的食物過(guò)敏原，可能會(huì)引起極其嚴(yán)重的過(guò)敏癥?；ㄉ^(guò)敏的癥狀包括：血壓降低、面部和喉嚨腫脹，這些都會(huì)阻礙呼吸，從而導(dǎo)致休克。因此，含有花生成分的食品應(yīng)明確標(biāo)識(shí)。

對(duì)于多組分的農(nóng)產(chǎn)品，經(jīng)過(guò)加工后，從外觀通常難以辨別。市場(chǎng)上很多不法商販為了獲取高額利潤(rùn)，經(jīng)常以低價(jià)值的產(chǎn)品混入或冒充高價(jià)值的產(chǎn)品，比如將大豆油摻入花生油中，將大豆粉摻入花生醬中。另一方面將花生醬摻入芝麻醬，而花生醬極易感染黃曲霉，從而對(duì)消費(fèi)者的健康帶來(lái)危害。因此建立一種可以特異地檢測(cè)花生成分的方法，有助于花生成分的鑒定，防止攙假使雜，保護(hù)消費(fèi)者利益和健康。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因及其檢測(cè)方法，以該基因序列為檢測(cè)靶標(biāo)，篩選出可以特異地鑒定花生的引物組合，用于特異地檢測(cè)花生成分。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：

一種花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因在檢測(cè)花生物種中的用途，所述的花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

一種花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因所使用的PCR引物對(duì)F1/R1，所述的PCR引物對(duì)F1/R1用于擴(kuò)增權(quán)利要求1中的花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因，引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：gcgtggatga ggagatagcc；

引物R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：gtcttggtgg ttggcgttgt。

一種花生物種的分子鑒定方法，包括以下步驟：1)、從待測(cè)樣品中提取目標(biāo)DNA；

2)、以目標(biāo)DNA為模板用權(quán)利要求2中所述的引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以無(wú)菌水為PCR空白對(duì)照，以花生基因組DNA為PCR陽(yáng)性對(duì)照；

3)、將步驟2)中PCR擴(kuò)增出的基因片段用瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，滿足以下條件則說(shuō)明PCR擴(kuò)增結(jié)果可靠：空白對(duì)照擴(kuò)增無(wú)任何帶型，陽(yáng)性對(duì)照有位于165bp的清晰、單一條帶；

4)、判斷目標(biāo)DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物中是否特異性擴(kuò)增出165bp的條帶，若能擴(kuò)增出，則說(shuō)明目標(biāo)DNA中含有花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因，即可判斷所檢測(cè)樣品中含有花生成分。

不同物種由于獨(dú)立進(jìn)化的結(jié)果，它們?cè)谶z傳、生理和品質(zhì)等方面各具特色。利用不同物種特有的DNA序列可以開(kāi)發(fā)成能夠識(shí)別和定量不同物種及其加工產(chǎn)品的標(biāo)記。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：在GenBank中檢索花生的基因序列，分析基因信息，優(yōu)先選擇具有完整序列和信息的基因組序列和cDNA序列。然后將選擇的序列進(jìn)行Blastn分析，選擇特異性強(qiáng)、相似序列少的花生基因序列。以特異性強(qiáng)的基因序列為檢測(cè)靶標(biāo)，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析。最終篩選出來(lái)的引物組合具有以下特征：1、擴(kuò)增條帶清晰、單一；2、在所有的花生品種中均有相同的擴(kuò)增條帶；3、在其他花生近緣種、常見(jiàn)的作物中均沒(méi)有擴(kuò)增。

本發(fā)明提供了一種特異地檢測(cè)花生成分的方法，有助于花生成分的鑒定，防止攙假使雜。與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法相比，本發(fā)明獲得的基因序列有利于實(shí)現(xiàn)花生的分子鑒定，能有效縮短花生的鑒定時(shí)間。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例中分別對(duì)16種不同花生品種的基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果圖；

圖2為實(shí)施例中分別對(duì)花生和16種非花生品種的基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果圖；

圖3為實(shí)施例中花生擴(kuò)增的靈敏度檢測(cè)圖；

圖4為實(shí)施例中檢測(cè)不同樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)具體的說(shuō)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于以下實(shí)施例。

本實(shí)施例中所提供的花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

該基因能夠用于花生物種的分子鑒定中。

本實(shí)施例中同時(shí)提供了用于PCR擴(kuò)增上述花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因的引物對(duì)F1/R1，引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：gcgtggatga ggagatagcc；引物R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：gtcttggtgg ttggcgttgt。

本實(shí)施例提供的花生物種的分子鑒定方法具體包括以下步驟：1)、從待測(cè)樣品中提取目標(biāo)DNA；

2)、以目標(biāo)DNA為模板用權(quán)利要求2中所述的引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以無(wú)菌水為PCR空白對(duì)照，以花生基因組DNA為PCR陽(yáng)性對(duì)照；

3)、將步驟2)中PCR擴(kuò)增出的基因片段用瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，滿足以下條件則說(shuō)明PCR擴(kuò)增結(jié)果可靠：空白對(duì)照擴(kuò)增無(wú)任何帶型，陽(yáng)性對(duì)照有位于165bp的清晰、單一條帶；

4)、判斷目標(biāo)DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物中是否特異性擴(kuò)增出165bp的條帶，若能擴(kuò)增出，則說(shuō)明目標(biāo)DNA中含有花生DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)基因，即可判斷所檢測(cè)樣品中含有花生成分。

以下為本發(fā)明的具體檢測(cè)實(shí)施例。

實(shí)施例1

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1植物材料

進(jìn)行試驗(yàn)的16個(gè)不同花生品種(7596，7519，7602，7607，7613，21016，21399，21513，21134，21088，21282，21127，21020，21387，21065，中花5號(hào))；

以及其他16種不同種屬的材料分別有：油菜，大豆，芝麻，向日葵，油棕，棉花，水稻，玉米，豇豆，豌豆，馬鈴薯，蘿卜，辣椒，茄子，擬南芥，煙草。

1.2酶與試劑

分子生物學(xué)試劑，TAKARA Taq DNA聚合酶，10×PCR緩沖液，dNTP Mixture(10mM)，MgCl₂購(gòu)自大連寶生物公司。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

PCR擴(kuò)增儀：DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler(Bio-Rad,USA)；

核酸電泳儀：DYYIII型YY0115-94(北京六一儀器廠)；

凝膠成像系統(tǒng)：Gel Doc XR System(Bio-Rad,USA)；

其它儀器包括：恒溫水浴鍋、電子天平、離心機(jī)、渦旋儀、純水儀、恒溫培養(yǎng)箱等。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1植物基因組DNA的提取

植物基因組DNA采用QIANGEN公司的DNA小量提取試劑盒DNeasy Plant Mini Kit(貨號(hào)69104)，具體操作如下：

2.1.1、粉碎樣品，取樣100mg。

2.1.2、加入400uL bufferAP1和4uLRNaseA。渦旋混勻。65℃水浴10分鐘。期間混勻2-3次。

2.1.3、加入130uL buffer AP2?；靹?。冰上放置5分鐘。14000rpm離心5min。

2.1.4、將裂解液轉(zhuǎn)入QIAshredder Mini spin coLumn，用自帶的2mL離心管作為收集管。14000rpm離心2min。

2.1.5、將收集液轉(zhuǎn)入一個(gè)新的自備的離心管，加1.5倍體積的BufferAP3/E。吹打混勻。

2.1.6、取650uL混合液到DNeasy Mini spin column(柱子最多承受650uL的體積，因此混合液需離心兩次)，用自帶的2mL離心管作為收集管。8000rpm離心1min，對(duì)剩余的樣品同樣操作。

2.1.7、將柱子置于新的2mL離心管，用500uL buffer AW洗脫，8000rpm離心1min，棄洗脫液。

2.1.8、再用500uL buffer AW洗脫，1400rpm離心2min，棄洗脫液。

2.1.9、將柱子置于新的1.5或2mL離心管中，加入100uL洗脫液Buffer AE。室溫放置5min。14000rpm離心1min。重復(fù)步驟9。

2.2PCR擴(kuò)增

以上述植物材料的基因組DNA為模板，以能特異性鑒定花生的引物組合F1/R1為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)體系為：20ng/μL DNA模板1μL，10×PCR緩沖液2.5μL，25mM MgCl₂2.0μL，10mM dNTP 0.5μL，10μM正、反向引物各0.25μL，DNA聚合酶0.5U，ddH₂O補(bǔ)足至25μL。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PCR擴(kuò)增均以無(wú)菌水為空白對(duì)照，以花生基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，只有當(dāng)空白對(duì)照擴(kuò)增無(wú)任何帶型，陽(yáng)性對(duì)照有與理論相符的清晰、單一條帶(條帶大小為165bp)則說(shuō)明PCR結(jié)果可靠。

如圖1所示，利用本發(fā)明的引物組合對(duì)16個(gè)花生品種基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(泳道M是NEB#M3233V DNA ladder，泳道1為水的空白對(duì)照，2-17分別為花生7596，7519，7602，7607，7613，21016，21399，21513，21134，21088，21282，21127，21020，21387，21065，中花5號(hào))，均擴(kuò)增出清晰、單一條的165bp條帶。表明本發(fā)明公布的基因片段及檢測(cè)方法在花生品種中具有較好的物種內(nèi)穩(wěn)定性。如圖2所示，選取16個(gè)花生近緣種和常見(jiàn)作物，利用本發(fā)明的引物組合對(duì)這16種基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(泳道M是NEB#M3233V DNA ladder，泳道1為陽(yáng)性對(duì)照，泳道2-17分別為油菜，大豆，芝麻，向日葵，油棕，棉花，水稻，玉米，豇豆，豌豆，馬鈴薯，蘿卜，辣椒，茄子，擬南芥，煙草)，結(jié)果只有以花生基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照的泳道有清晰、單一條帶。其他泳道均無(wú)任何帶型，表明本發(fā)明公布的基因片段及檢測(cè)方法在花生品種中具有較好的物種間特異性。如圖3所示，將花生基因組DNA用水梯度稀釋至100ng/uL，10ng/uL，1ng/uL，0.1ng/uL，0.05ng/uL和0.01ng/uL，利用本發(fā)明的引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果當(dāng)DNA濃度低至0.05ng/uL時(shí)仍有清晰可見(jiàn)的條帶(泳道M是NEB#M3233V DNA ladder，泳道1-6分別為100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.05ng，和0.01ng花生基因組DNA，泳道7為空白對(duì)照)，表明本發(fā)明公布檢測(cè)方法可檢測(cè)基因組DNA含量低至0.05ng/uL的樣品，靈敏度較高。

實(shí)施例2

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1植物材料

花生醬(四季寶牌)，混合芝麻醬(六必居牌)，芝麻醬(市售)，花生糖(大白兔牌)，炒芝麻(市售)。

1.2酶與試劑

分子生物學(xué)試劑，TAKARA Taq DNA聚合酶，10×PCR緩沖液，dNTP Mixture(10mM)，MgCl₂購(gòu)自大連寶生物公司。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

PCR擴(kuò)增儀：DNA Engine Dyad Peltier Thermal Cycler(Bio-Rad,USA)；

核酸電泳儀：DYYIII型YY0115-94(北京六一儀器廠)；

凝膠成像系統(tǒng)：Gel Doc XR System(Bio-Rad,USA)；

其它儀器包括：恒溫水浴鍋、電子天平、離心機(jī)、渦旋儀、純水儀、恒溫培養(yǎng)箱等。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1植物基因組DNA的提取

植物基因組DNA采用QIANGEN公司的DNA小量提取試劑盒DNeasy Plant Mini Kit(貨號(hào)69104)，具體操作如下：

2.1.1、粉碎樣品，取樣100mg。

2.1.2、加入400uL bufferAP1和4uLRNaseA。渦旋混勻。65℃水浴10分鐘。期間混勻2-3次。

2.1.3、加入130uL buffer AP2?；靹?。冰上放置5分鐘。14000rpm離心5min

2.1.4、將裂解液轉(zhuǎn)入QIAshredder Mini spin coLumn，用自帶的2mL離心管作為收集管。14000rpm離心2min

2.1.5、將收集液轉(zhuǎn)入一個(gè)新的自備的離心管，加1.5倍體積的BufferAP3/E。吹打混勻。

2.1.6、取650uL混合液到DNeasy Mini spin column(柱子最多承受650uL的體積，因此混合液需離心兩次)，用自帶的2mL離心管作為收集管。8000rpm離心1min，對(duì)剩余的樣品同樣操作。

2.1.7、將柱子置于新的2mL離心管，用500uL buffer AW洗脫，8000rpm離心1min， 棄洗脫液。

2.1.8、再用500uL buffer AW洗脫，1400rpm離心2min，棄洗脫液。

2.1.9、將柱子置于新的1.5或2mL離心管中，加入100uL洗脫液Buffer AE。室溫放置5min。14000rpm離心1min。重復(fù)步驟9。

2.2PCR擴(kuò)增

以1.1中植物材料的基因組DNA為模板，以能特異性鑒定花生的引物組合F1/R1為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)體系為：20ng/μL DNA模板1μL，10×PCR緩沖液2.5μL，25mM MgCl₂2.0μL，10mM dNTP 0.5μL，10μM正、反向引物各0.25μL，DNA聚合酶0.5U，ddH₂O補(bǔ)足至25μL。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PCR擴(kuò)增均以無(wú)菌水為空白對(duì)照，以花生基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，只有當(dāng)空白對(duì)照擴(kuò)增無(wú)任何帶型，陽(yáng)性對(duì)照有與理論相符的清晰、單一條帶(條帶大小為165bp)則說(shuō)明PCR結(jié)果可靠。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，泳道M是NEB#M3233V DNA ladder，泳道1為空白對(duì)照，泳道2為陽(yáng)性對(duì)照，泳道3-7分別為花生醬(四季寶牌)、混合芝麻醬(六必居牌)、芝麻醬(市售)、花生糖(大白兔牌)、炒芝麻(市售)。含有花生成分的樣品包括：花生醬(四季寶牌)、混合芝麻醬(六必居牌)、芝麻醬(市售)、花生糖(大白兔牌)均檢測(cè)到與陽(yáng)性對(duì)照相同的條帶，不含有花生成分的樣品均無(wú)擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的基于花生特異性序列的引物組合能夠準(zhǔn)確鑒定出樣品中的花生成分。

以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述，并不以此限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路上所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。