本發(fā)明涉及制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PGlu-b-TPGS及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

樹(shù)枝狀大分子是近年來(lái)出現(xiàn)的一類(lèi)新型合成高分子，它們具有高度支化、高度對(duì)稱(chēng)、單分散以及高表面官能團(tuán)密度等很多獨(dú)特的性質(zhì)，呈現(xiàn)出其它物質(zhì)無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，因此在很多應(yīng)用領(lǐng)域，尤其是在生物醫(yī)藥和納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，受到極其廣泛的關(guān)注，現(xiàn)在已經(jīng)成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。樹(shù)枝狀大分子與傳統(tǒng)的線性大分子相比有以下幾個(gè)顯著特點(diǎn)：(1)樹(shù)枝狀大分子有明確的分子量及分子尺寸，結(jié)構(gòu)規(guī)整，分子體積、形狀和功能基都可在分子水平上精確控制；(2)樹(shù)枝狀大分子一般由核心出發(fā)，不斷向外分支，代數(shù)較低時(shí)一般為開(kāi)放的分子構(gòu)型，隨代數(shù)的增加和支化的繼續(xù)，從第四代開(kāi)始，分子由敞開(kāi)的松散狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥饩o內(nèi)松的球形三維結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)部具有廣闊的空腔，分子表面具有極高的官能團(tuán)密度；(3)樹(shù)枝狀大分子有很高的反應(yīng)活性及包容能力，在分子中心和分子末端可導(dǎo)入大量的反應(yīng)性或功能性基團(tuán)，用作具有特殊功能的高分子材料。

而在樹(shù)枝狀聚合物基礎(chǔ)上制備上的樹(shù)枝狀嵌段共聚物更可以解決傳統(tǒng)的線性嵌段共聚物在生物醫(yī)用載體領(lǐng)域的多種問(wèn)題，如由多條線性嵌段共聚物自組裝形成的聚合物膠束活體內(nèi)穩(wěn)定性不夠，一方面其自組裝結(jié)構(gòu)只有在聚合物臨界膠束濃度(CMC)以上才會(huì)保持熱力學(xué)穩(wěn)定，然而組成其結(jié)構(gòu)的聚合物在活體內(nèi)極大稀釋?zhuān)硗馄浣Y(jié)構(gòu)還受到生物體內(nèi)復(fù)雜組分-膠束相互作用等多種因素的影響。而自組裝膠束的提前解體將導(dǎo)致負(fù)載的藥物在血液中提前爆釋?zhuān)粌H導(dǎo)致潛在的體內(nèi)毒性，而且也無(wú)法發(fā)揮納米載體的獨(dú)特靶向功能。而由樹(shù)枝狀嵌段共聚物制備得到的納米結(jié)構(gòu)則由于共價(jià)鍵結(jié)構(gòu)而十分穩(wěn)定，避免了因聚合物濃度稀釋而導(dǎo)致納米結(jié)構(gòu)解體的問(wèn)題，因而在藥物載體和基因載體等領(lǐng)域具有更廣闊的實(shí)際應(yīng)用前景。圖1為聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)示意圖。聚酰胺-胺(PAMAM)是第一種完全合成，表征及商用的樹(shù)枝狀聚合物，以乙二胺為核，與丙烯酸甲酯反應(yīng)而成，最常用的是2，3及4代。

然而，目前關(guān)于樹(shù)枝狀嵌段共聚物的研究仍有待深入。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問(wèn)題之一。

本發(fā)明是基于發(fā)明人的以下發(fā)現(xiàn)而完成的：

生物可降解高分子材料由于其在體內(nèi)良好的生物相容性及可降解性廣泛應(yīng)用于給藥系統(tǒng)載體的靶向緩釋、控釋研究。其中聚氨基酸材料是一類(lèi)具有非常好的生物相容性及生物可降解性材料。其單體氨基酸是人體自身所必須，能自行降解、代謝被機(jī)體吸收和排泄，具有其他材料不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。聚氨基酸材料已被廣泛用作手術(shù)縫合線，人工皮膚等，在藥物控釋領(lǐng)域也被廣泛應(yīng)用于計(jì)劃生育、抗腫瘤等領(lǐng)域。其中聚谷氨酸是最常用的聚氨基酸材料之一，其由于側(cè)鏈帶有羧基而具備更多功能化的應(yīng)用，如共價(jià)或靜電負(fù)載藥物，因此它在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有很誘人的應(yīng)用前景和極高的商業(yè)價(jià)值。發(fā)明人研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，PAMAM是由伯胺封端，可以用于引發(fā)氨基酸單體進(jìn)行陰離子開(kāi)環(huán)聚合得到樹(shù)枝狀聚氨基酸，進(jìn)而得到樹(shù)枝狀嵌段共聚物。

Vitamin E TPGS(TPGS)是聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000succinate)的簡(jiǎn)稱(chēng)，是維生素E的水溶性衍生物，由維生素E琥珀酸酯(TOS)的羧基與聚乙二醇1000(PEG1000)酯化而成，相對(duì)分子量約為1513，分子結(jié)構(gòu)如下所示，已載入《美國(guó)藥典》。

TPGS已廣泛應(yīng)用于藥物制劑、食品和化妝品研究中，它是一種兩親分子，有一個(gè)親水的極性頭部和一個(gè)疏水的脂肪族碳鏈尾部，能溶于水，也能溶于大多數(shù)極性有機(jī)溶劑。作為一種優(yōu)良的乳化劑，TPGS還可以促進(jìn)納米粒被細(xì)胞攝取。此外，TPGS本身也具有抗腫瘤的活性，它可誘導(dǎo)活性氧自由基的產(chǎn)生，破壞細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、脂肪酸和核酸等成分而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明TPGS能抑制P-gp介導(dǎo)的藥物運(yùn)輸，由此逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的對(duì)順鉑、DOX、紫杉醇、秋水仙堿等的多藥耐藥，這可能是其增強(qiáng)共施用藥物效力的機(jī)制之一?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)，發(fā)明人大膽設(shè)想將TPGS與抗癌藥及納米醫(yī)藥結(jié)合起來(lái)將能夠顯著提高對(duì)腫瘤的治療效果。

為此，本發(fā)明的目的在于提出一種能夠有效用于制備載藥納米?；蛟佥d藥微球、穩(wěn)定性好、或者能夠提高治療效果的樹(shù)枝狀嵌段共聚物及其制備方法和應(yīng)用。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種樹(shù)枝狀嵌段共聚物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該樹(shù)枝狀嵌段共聚物具有如式I所示的結(jié)構(gòu)：

其中，n為192-576的整數(shù)；PAM為聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子聚合物PAMAM，TPGS-為式Ⅱ所示基團(tuán)：

其中，p為23。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子聚合物為PAMAM-G2，PAMAM-G3或PAMAM-G4。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種制備前面所述的樹(shù)枝狀嵌段共聚物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：(1)使谷氨酸芐酯-N-羧酸酐與聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子聚合物PAMAM接觸，得到PAM-PBLG樹(shù)枝狀共聚物，(2)使聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯與丁二酸酐或馬來(lái)酸酐接觸，得到TPGS-COOH，(3)使所述PAM-PBLG樹(shù)枝狀共聚物與所述TPGS-COOH接觸，得到樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PBLG-b-TPGS，(4)使所述樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PBLG-b-TPGS進(jìn)行水解，得到樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PGlu-b-TPGS。

其中，n為192-576的整數(shù)，

PAM為聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子聚合物PAMAM，

TPGS為式Ⅱ所示基團(tuán)：

p為23。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的上述方法可以快速高效地制備獲得樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PGlu-b-TPGS，操作簡(jiǎn)單、方便快捷，且原料來(lái)源廣泛、價(jià)廉易得，反應(yīng)條件溫和，易于實(shí)現(xiàn)，且得到的目標(biāo)產(chǎn)物收率較高、雜質(zhì)較少。另外，獲得的樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PGlu-b-TPGS可以有效作為輔料制備藥物，特別是載藥納米?；蜉d藥微球，制備得到的載藥納米?；蜉d藥微球在體內(nèi)穩(wěn)定性好，有利于提高藥物的治療效果。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(1)中，所述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子聚合物為PAMAM-G2，PAMAM-G3或PAMAM-G4。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(1)中，所述谷氨酸芐酯-N-羧酸酐與聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子聚合物PAMAM的質(zhì)量比為(90-99)：(10-1)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(1)中，在無(wú)水無(wú)氧、25-45攝氏度的條件下，使所述谷氨酸芐酯-N-羧酸酐與聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子聚合物PAMAM進(jìn)行聚合反應(yīng)48-72小時(shí)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(2)進(jìn)一步包括：(2-1)在第一有機(jī)溶劑中，存在第一催化劑、20-50攝氏度的條件下，使聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯與丁二酸酐或馬來(lái)酸酐反應(yīng)12-48小時(shí)，(2-2)向步驟(2-1)得到的反應(yīng)液中加入第一沉淀劑，并干燥得到的沉淀物，得到所述TPGS-COOH。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(2-1)中，所述第一有機(jī)溶劑為選自二氯甲烷，三氯甲烷，二氧六環(huán)，乙腈，四氫呋喃，N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜中的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(2-1)中，所述第一催化劑為選自吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、乙二胺、三乙烯二胺和四乙烯三胺中的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(2-1)中，所述第一催化劑、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯與丁二酸酐或馬來(lái)酸酐的摩爾比為(1-3)：(1-3)：(7-9)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(2-2)中，所述第一沉淀劑為選自乙醚，石油醚，正庚烷和正己烷中的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(3)進(jìn)一步包括：(3-1)在第一有機(jī)溶劑中，存在第二催化劑和脫水縮合劑，4-40攝氏度的條件下，使所述PAM-PBLG樹(shù)枝狀共聚物和所述TPGS-COOH反應(yīng)12-48小時(shí)，(3-2)向步驟(3-1)得到的反應(yīng)液中加入第二沉淀劑，并干燥得到的沉淀物，得到所述樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PBLG-b-TPGS。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(3-1)中，所述第二有機(jī)溶劑為選自二氯甲烷，三氯甲烷，二氧六環(huán)，乙腈，四氫呋喃，N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜中的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(3-1)中，所述第二催化劑為選自吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶中的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(3-1)中，所述脫水縮合劑為選自N,N-二環(huán)己基碳二亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺中的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(3-1)中，所述第二催化劑、脫水縮合劑、PAM-PBLG樹(shù)枝狀共聚物和TPGS-COOH的摩爾比為(48-640)：(16-3840)：1：(16-64)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(3-2)中，所述第二沉淀劑為選自乙醚，石油醚，正庚烷和正己烷中的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(4)中，所述水解在氫氧化鈉溶液中、HBr/CF₃COOH溶液中或存在Pt/C的條件下進(jìn)行，所述水解的溫度為20-40攝氏度，時(shí)間為12-24小時(shí)。

在本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了前面所述的樹(shù)枝狀嵌段共聚物在制備藥物中的用途，所述樹(shù)枝狀嵌段共聚物作為藥用輔料。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的樹(shù)枝狀嵌段共聚物可以作為載體材料用于制備藥物，特別是用于制備載藥納米粒或載藥微球，制備獲得的載藥納米粒或載藥微球穩(wěn)定性好，靶向性好，且本分發(fā)明的該載體材料可以與藥物有效成分協(xié)同作用，提高藥物的治療效果。

附圖說(shuō)明

圖1為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PGlu-b-TPGS合成路線圖。

圖2為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的PAM3-PBLG的核磁共振圖(¹HNMR)。

圖3為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的PAM3-PBLG-b-TPGS的核磁共振圖(¹HNMR)。

圖4為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的PAM3-PGlu-b-TPGS的核磁共振圖(¹HNMR)。

圖5為激光粒度儀檢測(cè)載順鉑PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒的粒徑和粒徑分布結(jié)果。

圖6為Zeta電位儀測(cè)量載順鉑PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒的電位分布結(jié)果。

圖7為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的載順鉑PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒的透射電鏡照片。

圖8為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的載順鉑PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒粒徑隨濃度的變化曲線。

圖9為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的載順鉑PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒的體外藥物釋放曲線。

圖10為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的載順鉑PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒和空白PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒(與載藥納米粒相同納米粒懸液濃度)對(duì)A549/DDP多藥耐藥細(xì)胞在24h的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖11為(與載藥納米粒相同納米粒懸液濃度)載順鉑PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒和空白PAM-PGlu-b-TPGS納米粒(與載藥納米粒相同納米粒懸液濃度)對(duì)A549/DDP多藥耐藥細(xì)胞在48h的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖12為(與載藥納米粒相同納米粒懸液濃度)載順鉑PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒和空白PAM-PGlu-b-TPGS納米粒(與載藥納米粒相同納米粒懸液濃度)對(duì)A549/DDP多藥耐藥細(xì)胞在72h的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖13為激光共聚焦掃描電子顯微鏡觀察用PAM-PGlu-b-TPGS材料制備的載熒光素納米粒在37℃下孵育2h的A549/DDP細(xì)胞。

圖14為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的載順鉑PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒對(duì)腫瘤的抑制效果圖。

圖15為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的載順鉑PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒對(duì)小鼠體重與治療時(shí)間的變化曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種樹(shù)枝狀嵌段共聚物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該樹(shù)枝狀嵌段共聚物具有如式I所示的結(jié)構(gòu)：

其中，n為192-576的整數(shù)，PAM為聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子聚合物PAMAM，TPGS為式Ⅱ所示基團(tuán)：

其中，p為23。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的該樹(shù)枝狀嵌段共聚物可以有效作為輔料用于制備藥物，特別是用于制備載藥納米?；蜉d藥微球，得到的載藥納米?；蜉d藥微球穩(wěn)定性好，靶向性好，且本發(fā)明的該樹(shù)枝狀嵌段共聚物可以與藥物的活性成分協(xié)同、配合作用，提高藥物的治療效果。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子聚合物PAMAM可以為PAMAM-G2，PAMAM-G3或PAMAM-G4。需要說(shuō)明的是，本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“PAMAM-G2”、“PAMAM-G3”和“PAMAM-G4”分別表示聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子第二代、第三代和第四代。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種制備前面所述的樹(shù)枝狀嵌段共聚物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟：

(1)使谷氨酸芐酯-N-羧酸酐與聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子聚合物PAMAM接觸，得到PAM-PBLG樹(shù)枝狀共聚物。

其中，n為192-576的整數(shù)，

PAM為聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子聚合物PAMAM。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中。上述聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子聚合物可以為PAMAM-G2，PAMAM-G3或PAMAM-G4。由此，原料來(lái)源廣泛，價(jià)廉易得。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，步驟(1)中，可以在無(wú)水無(wú)氧、25-45攝氏度的條件下，使所述谷氨酸芐酯-N-羧酸酐與聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子聚合物PAMAM進(jìn)行聚合反應(yīng)48-72小時(shí)。由此，能夠?yàn)樯鲜龇磻?yīng)物提供最合適的反應(yīng)條件，有利于提高反應(yīng)的效率和產(chǎn)物收率，減少副反應(yīng)發(fā)生。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，步驟(1)中，谷氨酸芐酯-N-羧酸酐與聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高分子聚合物PAMAM的質(zhì)量比可以為(90-99)：(10-1)。由此，既能保證反應(yīng)有效、穩(wěn)定進(jìn)行，又能避免或減少材料的浪費(fèi)，經(jīng)濟(jì)性好，且獲得的產(chǎn)物性質(zhì)良好。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(1)還可以包括對(duì)PAM-PBLG樹(shù)枝狀共聚物進(jìn)行純化的步驟。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，通過(guò)以下步驟對(duì)PAM-PBLG樹(shù)枝狀共聚物進(jìn)行純化：將上述PAM-PBLG樹(shù)枝狀共聚物溶于二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或二氧六環(huán)中，加入乙醚，石油醚或正己烷使所述共聚物沉淀，過(guò)濾并干燥沉淀物，即得到純化的PAM-PBLG樹(shù)枝狀共聚物。

(2)使聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯與丁二酸酐或馬來(lái)酸酐接觸，得到TPGS-COOH。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(2)可以進(jìn)一步包括以下步驟：

(2-1)在第一有機(jī)溶劑中，存在第一催化劑、20-50攝氏度的條件下，使聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯與丁二酸酐或馬來(lái)酸酐反應(yīng)12-48小時(shí)。由此，能夠在最適合的條件下進(jìn)行反應(yīng)，目標(biāo)產(chǎn)物收率高，副反應(yīng)少，目標(biāo)產(chǎn)物中雜質(zhì)少。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，步驟(2-1)中，第一有機(jī)溶劑的具體種類(lèi)不受特別限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要靈活選擇。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，可以采用的第一有機(jī)溶劑可以為選自二氯甲烷，三氯甲烷，二氧六環(huán)，乙腈，四氫呋喃，N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜中的至少一種。由此，具有較好的反應(yīng)效果。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，步驟(2-1)中，可以采用的第一催化劑可以為選自吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、乙二胺、三乙烯二胺和四乙烯三胺中的至少一種。優(yōu)選情況下，第一催化劑可以為選自下述a)和b)中的任意一種，或者a)和b)按照摩爾比為1：1-10的混合物：a)吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶、4-二甲氨基吡啶；b)三乙胺、乙二胺、三乙烯二胺和四乙烯三胺。由此，可以高效催化聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯與丁二酸酐或馬來(lái)酸酐反應(yīng)，選擇性好，反應(yīng)速率大大提高，且目標(biāo)產(chǎn)物收率較高。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(2-1)中，上述第一催化劑、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯與丁二酸酐或馬來(lái)酸酐的摩爾比可以為(1-3)：(1-3)：(7-9)。由此，可以按照較佳的配比進(jìn)行反應(yīng)，既能保證反應(yīng)充分進(jìn)行，也不會(huì)因反應(yīng)物過(guò)多而浪費(fèi)原料或反應(yīng)物過(guò)少而導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率較低。

(2-2)向步驟(2-1)得到的反應(yīng)液中加入第一沉淀劑，并干燥得到的沉淀物，得到所述TPGS-COOH。

需要說(shuō)明的是，在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“沉淀劑”是指向液相中加入后能產(chǎn)生沉淀的試劑。在該步驟中，采用的第一沉淀劑可以為選自乙醚，石油醚，正庚烷和正己烷中的至少一種。通過(guò)加入上述第一沉淀劑，可以快速、有效地使得目標(biāo)產(chǎn)物沉淀，進(jìn)而能夠方便快捷地分離得到目標(biāo)產(chǎn)物。

(3)使所述PAM-PBLG樹(shù)枝狀共聚物與所述TPGS-COOH接觸，得到樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PBLG-b-TPGS。

其中，TPGS為式Ⅱ所示基團(tuán)：

p為23。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，步驟(3)可以進(jìn)一步包括以下步驟：

(3-1)在第二有機(jī)溶劑中，存在第二催化劑和脫水縮合劑，4-40攝氏度的條件下，使所述PAM-PBLG樹(shù)枝狀共聚物和所述TPGS-COOH反應(yīng)12-48小時(shí)。由此，能夠提供最合適的反應(yīng)條件，有利于提高反應(yīng)速率和反應(yīng)效率，及減少副反應(yīng)的發(fā)生，目標(biāo)產(chǎn)物收率高，雜質(zhì)少。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，步驟(3-1)中，第二有機(jī)溶劑的具體種類(lèi)不受特別限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要靈活選擇。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，可以采用的第二有機(jī)溶劑可以為選自二氯甲烷，三氯甲烷，二氧六環(huán)，乙腈，四氫呋喃，N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜中的至少一種。由此，有利于反應(yīng)充分，反應(yīng)效果較好。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，步驟(3-1)中，采用的第二催化劑可以為選自吡啶、2-甲基吡啶、4-甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶中的至少一種。由此，可以高效催化反應(yīng)進(jìn)行，選擇性好，目標(biāo)產(chǎn)物收率高，反應(yīng)速率大大提高。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，步驟(3-1)中，采用的脫水縮合劑可以為選自N,N-二環(huán)己基碳二亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺中的至少一種。由此，能夠有效促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行，提高反應(yīng)速率和目標(biāo)產(chǎn)物收率。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，步驟(3-1)中，第二催化劑的用量可以為所述TPGS-COOH的摩爾量的3-10倍，脫水縮合劑的用量可以為所述TPGS-COOH的摩爾量的1-60倍?？偟膩?lái)說(shuō)，上述第二催化劑、脫水縮合劑、PAM-PBLG樹(shù)枝狀共聚物和TPGS-COOH的摩爾比可以為(48-640)：(16-3840)：1：(16-64)。由此，各反應(yīng)物的配比較佳，既能保證反應(yīng)充分進(jìn)行，又不會(huì)浪費(fèi)原料。

(3-2)向步驟(3-1)得到的反應(yīng)液中加入第二沉淀劑，并干燥得到的沉淀物，得到所述樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PBLG-b-TPGS。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，步驟(3-2)中，采用的第二沉淀劑可以為選自乙醚，石油醚，正庚烷和正己烷中的至少一種。由此，可以使目標(biāo)產(chǎn)物快速沉淀，進(jìn)而方便快捷地分離目標(biāo)產(chǎn)物。

(4)使所述樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PBLG-b-TPGS進(jìn)行水解，得到樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PGlu-b-TPGS。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，步驟(4)中，上述水解可以在氫氧化鈉溶液中、HBr/CF₃COOH溶液中或存在Pt/C的條件下進(jìn)行，水解的溫度可以為20-40攝氏度，時(shí)間可以為12-24小時(shí)。由此，可以在最適合的條件下使得酯基發(fā)生水解，得到目標(biāo)產(chǎn)物，有利于提高目標(biāo)產(chǎn)物的收率。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，步驟(4)可以進(jìn)一步包括透析與凍干的步驟。具體地，可以將上述水解得到的反應(yīng)液加入透析袋，并在pH為2的鹽酸溶液中透析48小時(shí)，后在去離子水中透析24小時(shí)，每3小時(shí)換一次透析水，然后冷凍干燥得到樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PGlu-b-TPGS。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，該步驟得到樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PGlu-b-TPGS的分子量為50119-177348。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的上述方法可以快速高效地制備獲得樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PGlu-b-TPGS，操作簡(jiǎn)單、方便快捷，且原料來(lái)源廣泛、價(jià)廉易得，反應(yīng)條件溫和，易于實(shí)現(xiàn)，且得到的目標(biāo)產(chǎn)物收率較高、雜質(zhì)較少。另外，獲得的樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PGlu-b-TPGS可以有效作為輔料制備藥物，特別是載藥納米?；蜉d藥微球，制備得到的載藥納米?；蜉d藥微球在體內(nèi)穩(wěn)定性好，可以與藥活性成分協(xié)同、配合作用，進(jìn)而提高藥物的治療效果。

在本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了前面所述的樹(shù)枝狀嵌段共聚物在制備藥物中的用途，所述樹(shù)枝狀嵌段共聚物作為藥用輔料。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的樹(shù)枝狀嵌段共聚物可以作為載體材料用于制備藥物，特別是用于制備載藥納米?；蜉d藥微球，制備獲得的載藥納米?；蜉d藥微球穩(wěn)定性好，靶向性好，且本分發(fā)明的該載體材料可以與藥物有效成分協(xié)同作用，提高藥物的治療效果。

本發(fā)明制備樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM-PGlu-b-TPGS方法簡(jiǎn)單，無(wú)污染。所獲得的樹(shù)枝狀嵌段共聚物具有良好的生物相容性和生物可降解性，可作為藥用輔料應(yīng)用于制備載藥納米粒和載藥微球中。是一種很有應(yīng)用前景的材料。

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。

實(shí)施例1：樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM2-PGlu-b-TPGS的制備

制備方法包括如下步驟(合成路線圖見(jiàn)圖1)：

(1)樹(shù)枝狀共聚物PAM2-PBLG的制備：在有機(jī)溶劑N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，按質(zhì)量百分比，以96％的谷氨酸芐酯-N-羧酸酐單體和4％樹(shù)枝狀聚酰胺-胺PAMAM-G2為原料，在無(wú)水無(wú)氧條件下，在35℃，聚合反應(yīng)48小時(shí)，得到數(shù)均分子量M_n為44899(G2，n＝192，p＝23)的PAM-PBLG樹(shù)枝狀共聚物。

將上述得到的PAM2-PBLG樹(shù)枝狀聚合物加入乙醚中沉淀，過(guò)濾并將沉淀物真空干燥，即得到純化的PAM2-PBLG樹(shù)枝狀聚合物。

按照上述步驟，有機(jī)溶劑分別采用二氯甲烷，三氯甲烷，二氧六環(huán)，乙腈或二甲基亞砜，同樣制備得到了PAM2-PBLG樹(shù)枝狀聚合物。

(2)TPGS-COOH的制備：在有機(jī)溶劑乙腈中，按摩爾百分比，以20％的TPGS、80％的丁二酸酐或馬來(lái)酸酐、20％的第一催化劑為原料，在40℃反應(yīng)12小時(shí)，加入沉淀劑乙醚進(jìn)行沉淀，過(guò)濾，將沉淀于40℃真空干燥24h，獲得TPGS-COOH；第一催化劑是摩爾比為1:1的4-二甲氨基吡啶(DMAP)和三乙胺。

按照上述步驟，第一催化劑分別采用摩爾比為1：1的2-甲基吡啶和三乙烯二胺，或摩爾比為1：1的4-甲基吡啶和三乙胺，同樣獲得了羧基化樹(shù)枝狀聚合物TPGS-COOH；

(3)樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM2-PBLG-b-TPGS的制備：在有機(jī)溶劑中，加入摩爾比為1：16的PAM2-PBLG和TPGS-COOH，加入相當(dāng)TPGS-COOH摩爾量5倍的脫水縮合劑N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，在相當(dāng)TPGS-COOH摩爾量1倍的第二催化劑吡啶的作用下，在10℃反應(yīng)28小時(shí)，反應(yīng)液用沉淀劑沉淀，過(guò)濾，干燥沉淀物，即獲得分子量為67399(G2，n＝192，p＝23)的樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM2-PBLG-b-TPGS。其中，有機(jī)溶劑為選自二氯甲烷，三氯甲烷，二氧六環(huán)，乙腈，四氫呋喃，N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜中的至少一種，沉淀劑為選自乙醚，石油醚，正庚烷和正己烷中的至少一種。

(4)在1M NaOH溶液中，將PAM2-PBLG-b-TPGS在20-40℃條件下水解12小時(shí)，然后加入透析袋在pH＝2的鹽酸溶液中透析48小時(shí)，后又在去離子水中透析24小時(shí)，每3小時(shí)換一次透析水，冷凍干燥得到分子量為50119(G2，n＝192，p＝23)的樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM2-PGlu-b-TPGS。

按照上述步驟，脫水縮合劑采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺或者第二催化劑采用4-甲基吡啶，同樣獲得了樹(shù)枝狀兩親性嵌段共聚物PAM2-PGlu-b-TPGS。

實(shí)施例2：樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM3-PGlu-b-TPGS的制備

制備方法包括如下步驟：

(1)樹(shù)枝狀共聚物PAM3-PBLG的制備：在有機(jī)溶劑二氯甲烷中，按質(zhì)量百分比，以97％的谷氨酸芐酯-N-羧酸酐單體和3％樹(shù)枝狀聚酰胺-胺PAMAM-G3為原料，在無(wú)水無(wú)氧條件下，在25℃，聚合反應(yīng)60小時(shí)，得到數(shù)均分子量M_n為76340(G3，n＝320，p＝23)的PAM3-PBLG樹(shù)枝狀共聚物；

將得到的PAM3-PBLG樹(shù)枝狀聚合物加入乙醚中沉淀，過(guò)濾，將沉淀真空干燥，即得到純化的PAM3-PBLG樹(shù)枝狀聚合物。

(2)TPGS-COOH的制備：在有機(jī)溶劑四氫呋喃中，按摩爾百分比，以10％的TPGS、90％的丁二酸酐或馬來(lái)酸酐、10％的第一催化劑為原料，在40℃反應(yīng)24小時(shí)，加入沉淀劑乙醚進(jìn)行沉淀，過(guò)濾，將沉淀于40℃真空干燥24小時(shí)，獲得TPGS-COOH；第一催化劑是摩爾比為1:1的4-二甲氨基吡啶(DMAP)和三乙胺；

(3)樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM3-PBLG-b-TPGS的制備：在有機(jī)溶劑中，加入摩爾比為1：32的PAM3-PBLG和TPGS-COOH，加入相當(dāng)TPGS-COOH摩爾量10倍的脫水縮合劑N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，在相當(dāng)TPGS-COOH摩爾量2倍的第二催化劑吡啶的作用下，在10℃反應(yīng)28小時(shí)，反應(yīng)液用沉淀劑沉淀，過(guò)濾，干燥沉淀物，即獲得分子量為116840(G3，n＝320，p＝23)的樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM2-PBLG-b-TPGS。其中，有機(jī)溶劑為選自二氯甲烷，三氯甲烷，二氧六環(huán)，乙腈，四氫呋喃，N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜中的至少一種，沉淀劑為選自乙醚，石油醚，正庚烷和正己烷中的至少一種。

(4)在1M NaOH溶液中，將PAM3-PBLG-b-TPGS在20-40℃條件下水解12小時(shí)，然后加入透析袋在pH＝2的鹽酸溶液中透析48小時(shí)，后又在去離子水中透析24小時(shí)，每3小時(shí)換一次透析水，冷凍干燥得到分子量為88040(G3，n＝320，p＝23)的樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM3-PGlu-b-TPGS。

核磁共振氫譜(¹HNMR)和凝膠滲透色譜(GPC)結(jié)果證明樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM3-PGlu-b-TPGS已經(jīng)合成成功。

圖2-圖4分別為聚合物PAM3-PBLG、PAM3-PBLG-b-TPGS和PAM3-PGlu-b-TPGS的氫核磁共振譜圖。在圖2的PAM3-PBLG核磁圖譜中，a峰(δ為1.5-3ppm)為樹(shù)枝狀聚合物PAMAM-G3的亞甲基(CH₂)，b峰(δ＝3.90ppm)及e峰(δ＝5.12ppm)分別歸屬為聚谷氨酸上的主鏈次甲基(CH)和側(cè)鏈芐酯上的亞甲基峰(CH₂)，而核磁積分結(jié)果顯示這兩個(gè)峰的比例為1：2也驗(yàn)證了它們的歸屬。這說(shuō)明谷氨酸單體在PAM3的引發(fā)下成功開(kāi)環(huán)聚合。而δ在1.5-3ppm的范圍內(nèi)同時(shí)還有谷氨酸側(cè)鏈上的兩個(gè)亞甲基峰(CH₂)c和d，這樣通過(guò)積分計(jì)算可以得出PAM3-PBLG的谷氨酸聚合物為320，平均每條鏈10個(gè)谷氨酸，而PAM3-PBLG的數(shù)均分子量Mn為76340。

圖3的PAM3-PBLG-b-TPGS的¹HNMR中，出現(xiàn)的新峰a(δ＝3.65ppm)為T(mén)PGS上PEG的亞甲基(CH₂)。通過(guò)和聚谷氨酸上的峰b及c對(duì)比，計(jì)算得出PAM3-PBLG-b-TPGS上修飾有27條TPGS鏈，因此數(shù)均分子量為Mn為116840。

圖4的PAM3-PGlu-b-TPGS的¹HNMR中，可以看出在δ＝7.2ppm左右沒(méi)有苯環(huán)的峰，說(shuō)明保護(hù)的谷氨酸芐酯基團(tuán)已經(jīng)完全水解，而TPGS的特征峰a及谷氨酸主鏈的特征峰b都還在，說(shuō)明PAM3-PBLG-b-TPGS已經(jīng)完全水解從而制備得到PAM3-PGlu-b-TPGS，通過(guò)計(jì)算得到其數(shù)均分子量Mn為88040。

實(shí)施例3：樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM4-PGlu-b-TPGS的制備

制備方法包括如下步驟：

(1)樹(shù)枝狀共聚物PAM4-PBLG的制備：在有機(jī)溶劑二氯甲烷中，按質(zhì)量百分比，以97％的谷氨酸芐酯-N-羧酸酐單體和3％樹(shù)枝狀聚酰胺-胺PAMAM-G4為原料，在無(wú)水無(wú)氧條件下，在40℃，聚合反應(yīng)72小時(shí)，得到數(shù)均分子量M_n為139188(G4，n＝576，p＝23)的PAM4-PBLG樹(shù)枝狀共聚物；

將PAM4-PBLG樹(shù)枝狀聚合物加入乙醚中沉淀，過(guò)濾，將沉淀真空干燥，即得到純化的PAM4-PBLG樹(shù)枝狀聚合物。

(2)TPGS-COOH的制備：在有機(jī)溶劑四氫呋喃中，按摩爾百分比，以30％的TPGS、70％的丁二酸酐或馬來(lái)酸酐、30％的第一催化劑為原料，在30℃反應(yīng)16小時(shí)，加入沉淀劑乙醚進(jìn)行沉淀，過(guò)濾，將沉淀于40℃真空干燥24h，獲得TPGS-COOH；第一催化劑是摩爾比為1:1的4-二甲氨基吡啶(DMAP)和三乙胺；

(3)樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM4-PBLG-b-TPGS的制備：在有機(jī)溶劑中，加入摩爾比為1：64的PAM4-PBLG和TPGS-COOH，加入相當(dāng)TPGS-COOH摩爾量16倍的脫水縮合劑N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，在相當(dāng)TPGS-COOH摩爾量3倍的第二催化劑吡啶的作用下，在10℃反應(yīng)28小時(shí)，反應(yīng)液用沉淀劑沉淀，過(guò)濾，干燥沉淀物，即獲得分子量為229188(G4，n＝576，p＝23)的樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM4-PBLG-b-TPGS。其中，有機(jī)溶劑為選自二氯甲烷，三氯甲烷，二氧六環(huán)，乙腈，四氫呋喃，N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜中的至少一種，沉淀劑為選自乙醚，石油醚，正庚烷和正己烷中的至少一種。

(4)在1M NaOH溶液中，將PAM4-PBLG-b-TPGS在20-40℃條件下水解12小時(shí)，然后加入透析袋在pH＝2的鹽酸溶液中透析48小時(shí)，后又在去離子水中透析24小時(shí)，每3小時(shí)換一次透析水，冷凍干燥得到分子量為177348(G4，n＝576，p＝23)的樹(shù)枝狀嵌段共聚物PAM4-PGlu-b-TPGS。

該實(shí)施例所得產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)確認(rèn)數(shù)據(jù)與實(shí)施例2無(wú)實(shí)質(zhì)性差別，此處不再贅述。

聚合物的分子量及分子量分布可以分別通過(guò)核磁共振譜圖(¹HNMR)和凝膠滲透色譜圖(GPC)計(jì)算得出。樹(shù)枝狀共聚物的分子量和分子量分布如表1所示。

表1樹(shù)枝狀共聚物的分子量及分子量分布

注：M_n^a.根據(jù)核磁共振譜圖(¹H-NMR)計(jì)算得出。

M_n^b.根據(jù)凝膠滲透色譜圖(GPC)計(jì)算得出。

實(shí)施例4：制備載順鉑(Pt)的PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒

利用樹(shù)枝狀共聚物PAM3-PGlu-b-TPGS上谷氨酸的羧基-COOH和抗癌藥順鉑Pt的絡(luò)合相互作用制備載順鉑(Pt)的PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒。

制備方法如下：分別配備含有10mM Glu(谷氨酸)的PAM3-PGlu-b-TPGS聚合物溶液及5mM Pt溶液，然后將二者按體積比分別為1/1，2/1，3/1及4/1混合，快速震蕩攪勻，放置反應(yīng)過(guò)夜。得到的納米粒溶液用超濾離心管(截留分子量10KDa)純化，即得不同載藥量的載藥納米粒。

利用激光粒度儀分別測(cè)定制備獲得的載藥納米粒的粒徑、粒徑分布、不同載藥量的載藥納米粒的粒徑及不同濃度的載藥納米粒的粒徑，利用Zeta電位儀測(cè)定載藥納米粒的Zeta電位及電位分布，并利用透射電鏡觀察載藥納米粒的形態(tài)。通過(guò)電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)檢測(cè)納米粒的載藥量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2、圖5-圖8。

表2示出了載藥量對(duì)載藥納米粒的粒徑和Zeta電位的影響，從表2可以看出，制備得到載藥量為33％的載順鉑PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒通過(guò)激光粒度儀檢測(cè)得到粒徑在100nm以?xún)?nèi)，分布很窄，而當(dāng)載藥量達(dá)到50％時(shí)則會(huì)因?yàn)橄嗷プ饔锰珡?qiáng)而聚集，粒徑達(dá)到900nm。因此，后面測(cè)試中所用的載藥納米粒載藥量都為33％。

表2.用PAM3-PGlu-b-TPGS共聚物材料制備載順鉑納米粒過(guò)程中，載藥量對(duì)納米粒的粒徑和Zeta電位的影響

該實(shí)施例制備所得載順鉑(Pt)的PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒的粒度分布結(jié)果見(jiàn)圖5，由圖5可知，該載藥納米粒的粒徑分布很窄，在89nm左右。

圖6顯示該載藥納米粒的Zeta電位測(cè)試結(jié)果，由圖6可知，該載藥納米粒的Zeta電位在-13mV左右，表面電荷的絕對(duì)值比較高，顆粒之間相互排斥作用較強(qiáng)，因而在分散相中高度穩(wěn)定，電位在-13mV左右的納米粒在體內(nèi)分布穩(wěn)定。

圖7為該載藥納米粒的透射電鏡圖，由圖7可以看出，載藥納米粒大小均一，呈球形，粒徑大約在80nm，和粒度儀的測(cè)試結(jié)果一致。

圖8為不同濃度下該載藥納米粒的粒徑分布結(jié)果圖，可以看出即使載藥納米粒被稀釋1000倍，粒徑依然保持不變，說(shuō)明該載藥納米粒穩(wěn)定性非常好，具有潛在的實(shí)際應(yīng)用潛力。

按照如下步驟通過(guò)透析法測(cè)定載藥納米粒的藥物緩釋曲線：將3mL載藥納米粒溶液置于截留分子量為3000的透析袋中，封好袋口。密閉的透析袋放入50mL離心管中，加入30mL含(DMEM)或不含(PBS pH 7.4)細(xì)胞培養(yǎng)液的透析液，置于恒溫水浴搖床中于37℃，120rpm振蕩。在一定時(shí)間間隔內(nèi)，從離心管中取出3mL溶液，通過(guò)ICP-MS檢測(cè)每次釋放的順鉑量，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制載藥納米顆粒體外釋放曲線，所得結(jié)果見(jiàn)圖9。

如圖9所示，載順鉑的PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒在不含細(xì)胞培養(yǎng)液的透析液中透析時(shí)，順鉑藥物基本不釋放，這說(shuō)明納米載體非常穩(wěn)定，不會(huì)產(chǎn)生爆釋突釋。而在細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，由于藥物能夠快速釋放持續(xù)長(zhǎng)達(dá)72小時(shí)，說(shuō)明細(xì)胞環(huán)境能夠促進(jìn)納米粒的解體和藥物的釋放，達(dá)到控制釋放的目的。

利用MTT法測(cè)定載藥納米離子的細(xì)胞毒性，具體如下：將A549/DDP耐藥細(xì)胞(ATCC)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)24h貼壁后，棄去陳舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗一次，加入待測(cè)樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照分別培養(yǎng)24h、48h、72h。在規(guī)定的時(shí)間間隔后，棄去陳舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗一次，每孔加入100μl含MTT 1mg/ml的細(xì)胞培養(yǎng)基，37℃孵育4h后，棄去MTT，每孔加入100μl的二甲基亞砜(DMSO)，黑暗37℃培養(yǎng)2h，振蕩10min，用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm波長(zhǎng)的吸光度。結(jié)果將圖10-圖12。其中，圖10-圖12分別為載順鉑的PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒(Pt-loaded NPS)、空白PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒(Pt-free NPS)和游離順鉑(Pt)對(duì)A549/DDp細(xì)胞在24h、48h和72h的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明，不載藥的空白PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒具有良好的生物相容性，因?yàn)樵诓煌{米粒懸液濃度下它對(duì)A549細(xì)胞均沒(méi)有明顯的毒性；而載順鉑PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒具有明顯的細(xì)胞毒性，并且細(xì)胞毒性大于游離的藥物順鉑，說(shuō)明載藥納米粒能夠更好的克服細(xì)胞對(duì)游離藥物的多藥耐藥性。此外，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明載順鉑的PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒對(duì)A549/DDP細(xì)胞的毒性具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性。

實(shí)施例5：制備修飾熒光素的載順鉑(Pt)的PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒

通過(guò)共價(jià)鍵合的方法制備修飾熒光素的載順鉑的PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒。

制備方法如下：準(zhǔn)確稱(chēng)取10mg實(shí)施例2制備的PAM3-PGlu-b-TPGS樹(shù)枝狀共聚物溶于超純水中，加入含0.2mg 6-氨基熒光素(FITC-NH₂)的DMSO溶液，再加入1mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，25℃反應(yīng)12小時(shí)，之后透析3天，直到透析液中檢測(cè)不到熒光信號(hào)，冷凍干燥得到修飾熒光素的PAM3-PGlu-b-TPGS聚合物。再用實(shí)施例4中的方法制備修飾熒光素的載順鉑PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒，檢測(cè)結(jié)果表明修飾熒光素的載順鉑PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒的粒徑和未修飾熒光素的類(lèi)似。

將A549/DDP細(xì)胞懸液均勻接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再加入1ml培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂孵箱中培養(yǎng)24h。于A549/DDP細(xì)胞中加入1mg/mL的修飾熒光素的載順鉑PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒，繼續(xù)培養(yǎng)2h。用冰冷的PBS沖洗三次，加入甲醇固定細(xì)胞20min，棄去甲醇，加入碘化丙啶(PI)染液孵育5min，再用PBS沖洗三次，可以在細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)細(xì)胞核的定位來(lái)確定熒光素納米粒在細(xì)胞中的位置。圖13是用激光共聚焦掃描電子顯微鏡觀察A549/DDP細(xì)胞對(duì)修飾熒光素的載順鉑PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒的攝取結(jié)果，其中，細(xì)胞核用PI染成藍(lán)色，載熒光素載藥納米粒是綠色的，分別通過(guò)PI通道和EGFP通道觀察細(xì)胞攝取情況：圖13A是通過(guò)PI通道觀察的情況(藍(lán)色)；圖13B是通過(guò)EGFP通道觀察的情況(綠色)；圖13C是通過(guò)PI通道和EGFP通道觀察的圖像重疊后的結(jié)果。從圖中可以看出，僅僅在與細(xì)胞孵育2h后，納米粒就已經(jīng)被細(xì)胞所攝取。從圖13C可以清楚得看到，呈綠色的納米粒大多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)中，緊緊包圍著呈藍(lán)色的細(xì)胞核。

實(shí)施例6：載順鉑(Pt)的PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒的體內(nèi)治療

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6-7周齡BALB/c裸鼠，雌雄各半，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SPF(specific pathogen-free)環(huán)境級(jí)別監(jiān)控及飼養(yǎng)，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在遵照本院動(dòng)物委員會(huì)法令法規(guī)前提下進(jìn)行。每只裸鼠右側(cè)皮下注射2.0×10⁶A549/DDP細(xì)胞，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到可以觸摸到的大小后，老鼠被隨機(jī)分為3組，分別用生理鹽水(Saline)，順鉑(8mg/kg，Pt)和載順鉑的PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒(含有8mg/kg的Pt，Pt-Loaded NPS)治療16天，期間每?jī)商煊盟幰淮?，同時(shí)稱(chēng)重并測(cè)量腫瘤大小。圖14為載藥納米粒子對(duì)腫瘤的抑制效果圖，從圖中可以看出，在經(jīng)過(guò)治療，相比于對(duì)照(生理鹽水注射)組，Pt裸藥組和載Pt的PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒組均使得腫瘤體積得到抑制，而載Pt的PAM3-PGlu-b-TPGS納米粒治療則更顯著的抑制了腫瘤增長(zhǎng)。圖15為小鼠的體重與治療時(shí)間的變化曲線，通過(guò)監(jiān)測(cè)小鼠體重發(fā)現(xiàn)，這幾種治療方式并沒(méi)有引起小鼠體重的明顯減輕，說(shuō)明藥物和載藥納米粒治療的副作用小。

在本發(fā)明的描述中，需要解釋的是，術(shù)語(yǔ)“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個(gè)或者更多個(gè)該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上，除非另有明確具體的限定。

在本說(shuō)明書(shū)的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書(shū)中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說(shuō)明書(shū)中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。