發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明總體上涉及植物分子生物學、植物轉(zhuǎn)化，以及植物育種的領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及包含一個新穎的轉(zhuǎn)基因基因型的抗昆蟲的轉(zhuǎn)基因玉米植物并涉及檢測樣品及其組合物中玉米(corn)植物DNA的存在的方法。

發(fā)明背景

植物害蟲是在全世界重要農(nóng)作物損失中的一個主要因素。由于非哺乳動物害蟲(包含昆蟲)的侵染，僅在美國每年就損失大約80億美元。玉米根蟲的多個種被認為是最具破壞性的玉米害蟲。重要的根蟲害蟲種類包括西方玉米根蟲(Diabrotica virgifera virgifera)、北方玉米根蟲(D.longicornis barberi)、南方玉米根蟲(D.undecimpunctata howardi)、以及墨西哥玉米根蟲(D.virgifera zeae)。

玉米根蟲主要是由密集施用化學殺蟲劑來控制的。由此可以達到好的玉米根蟲的控制，但這些化學品有時也能影響有益的生物。由化學殺蟲劑的廣泛使用產(chǎn)生的另一個問題是出現(xiàn)了抗藥性昆蟲品種。通過各種抗藥性管理實踐已部分地緩和了這一狀況，但對可替代的蟲害控制策略仍有不斷增加的需求。一種這樣的替代方案包括在轉(zhuǎn)基因植物中表達編碼殺蟲蛋白的外來基因。這種方法已經(jīng)提供了一種保護以免受選定昆蟲害蟲侵襲的有效方法，并且表達殺蟲毒素的轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)被商業(yè)化，這允許農(nóng)業(yè)工作者減少化學殺蟲劑的應用。

植物中外來基因的表達可以被它們的染色體位置所影響，這可能是由于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的緊密地接近于整合位點(參見，例如，Weising et al,1988,"Foreign Genes in Plants,"Ann.Rev.Genet.22:421-477)。因此，通常的做法是生產(chǎn)幾百種不同的轉(zhuǎn)殖項(event)并且篩選這些轉(zhuǎn)殖項得出單個的轉(zhuǎn)殖項，該單個的轉(zhuǎn)殖項具有對于商業(yè)目的所希望的轉(zhuǎn)基因表達水平和模式。一個具有希望的轉(zhuǎn)基因表達水平或模式的轉(zhuǎn)殖項對于使用常規(guī)育種方法通過有性遠交將該轉(zhuǎn)基因滲入至其他遺傳背景中是有用的。這樣雜交的子代保持該原始轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達特性。使用這一策略來確保在許多已很好地適應了當?shù)厣L條件的品種中可靠的基因表達。

它將有利地能夠檢測出特殊轉(zhuǎn)殖項的存在，以便確定有性雜交的子代是否包含一種感興趣的轉(zhuǎn)基因。另外，檢測一種特定的轉(zhuǎn)殖項的一個方法有助于遵循條例，這些條例要求例如上市前批準以及源自重組農(nóng)作物植物的食品標簽。這有可能通過任何熟知的核酸檢測方法檢測出轉(zhuǎn)基因的存在，該檢測方法包括但不限于使用多核苷酸引物的熱擴增(聚合酶鏈式反應(PCR))或者使用核酸探針的DNA雜交。典型地，為了用于檢測特異DNA構(gòu)建體(該DNA構(gòu)建體已被用于轉(zhuǎn)化不同的植物品種)的試劑和方法學的簡易性和一致性，這些檢測方法一般集中于頻繁使用的遺傳元件上，例如，啟動子、終止子以及標記基因，因為對于許多DNA構(gòu)建體而言，該編碼序列區(qū)域是可互換的。結(jié)果，此類方法對于僅在編碼序列上不同的構(gòu)建體之間進行區(qū)分可能是無用的。此外，此類方法對于在不同轉(zhuǎn)殖項之間進行區(qū)分可能是無用的，特別是使用同樣的DNA構(gòu)建體所產(chǎn)生的那些，除非鄰近該插入的異源DNA的染色體DNA的序列(“側(cè)翼DNA”)是已知的。

本發(fā)明包括一種抗昆蟲轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)殖項，該轉(zhuǎn)殖項已經(jīng)將一個FR8a基因結(jié)合到它的基因組中，這披露于2008年10月9日公開的國際公開號WO 08/121633中，該專利通過引用結(jié)合在此，該基因編碼一個FR8a殺昆蟲毒素，該毒素在控制葉甲屬(Diabrotica spp.)種類的昆蟲害蟲方面是有用的。該轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)殖項還已經(jīng)將PMI基因結(jié)合到它的基因組中，該基因編碼磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)，這披露于美國專利號5,767,378中，該專利通過引用結(jié)合在此，該酶作為選擇性標記是有用的，這允許該植物利用甘露糖作為碳源。本發(fā)明進一步包括新的分離的核酸序列，這些序列對于該轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)殖項是獨特的，對于鑒定該轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)殖項以及對于檢測生物樣品中的來自轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)殖項的核酸、以及多種試劑盒是有用的，這些試劑盒包括用于檢測在生物樣品中的這些核酸所必需的試劑。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)殖項(命名為5307)，該轉(zhuǎn)殖項包括新的轉(zhuǎn)基因基因型，該基因型包括FR8a基因以及PMI基因，該PMI基因?qū)貙⒗ハx耐受性以及利用甘露糖作為碳源的能力賦予該5307玉米轉(zhuǎn)殖項及其子代。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明的基因型的轉(zhuǎn)基因玉米植物、來自包括本發(fā)明的基因型的轉(zhuǎn)基因玉米植物的種子、以及通過將包括本發(fā)明的基因型的玉米近交系與自身或不同基因型的另一種玉米系進行雜交來生產(chǎn)包括本發(fā)明的基因型的轉(zhuǎn)基因玉米植物的方法。除了通過本發(fā)明的新型基因型給予這些玉米植物的特征之外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的玉米植物可能基本上具有對應的同基因的非轉(zhuǎn)基因玉米植物的所有形態(tài)學及生理學特征。本發(fā)明還提供了用于檢測在生物樣品中來自轉(zhuǎn)殖項5307的核酸類的存在的組合物以及方法，這是基于插入至該玉米基因組的產(chǎn)生該5307轉(zhuǎn)殖項的重組體表達盒的DNA序列，以及位于插入點側(cè)翼的基因組序列的DNA序列。該5307轉(zhuǎn)殖項可以通過分析FR8a以及PMI蛋白的表達水平以及通過測試抗玉米根蟲的效能來進一步表征。

根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供了一種優(yōu)選地分離的核酸分子，該核酸分子包括被插入到玉米轉(zhuǎn)殖項5307的玉米植物基因組中的異源DNA序列的至少10個連續(xù)核苷酸以及在被插入到玉米轉(zhuǎn)殖項5307的玉米植物基因組中的異源DNA序列的插入點側(cè)翼的玉米植物基因組DNA的至少10個連續(xù)核苷酸。根據(jù)這個方面的優(yōu)選地分離的核酸分子可以包括被插入到玉米轉(zhuǎn)殖項5307的玉米植物基因組中的異源DNA序列的至少20個或至少50個連續(xù)核苷酸以及在被插入到玉米轉(zhuǎn)殖項5307的玉米植物基因組中的異源DNA序列的插入點側(cè)翼的玉米植物基因組DNA的至少20或至少50個連續(xù)核苷酸。

根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了優(yōu)選地分離的核酸分子，該核酸分子包括選自下組的轉(zhuǎn)殖項5307的至少一個連接序列，該組由下列各項組成：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，以及它們的互補物。連接序列跨越包含被插入到該玉米基因組中的表達盒的異源DNA與來自插入點側(cè)翼的玉米基因組的DNA之間的接點，并且對于5307轉(zhuǎn)殖項是診斷性的。

根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了一種優(yōu)選地分離的核酸，該核酸將一種異源DNA分子連接至玉米轉(zhuǎn)殖項5307中的玉米植物基因組中，該轉(zhuǎn)殖項包含從約11至約20個連續(xù)核苷酸的序列，該序列選自下組，該組由下列各項組成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2，以及它們的互補物。

根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了優(yōu)選地分離的核酸分子，該核酸分子包括選自下述組成的組的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4，以及它們的互補物。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了包括本發(fā)明的核酸分子的擴增子。

還根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了用于檢測轉(zhuǎn)殖項5307的側(cè)翼序列引物。這類側(cè)翼序列引物包括優(yōu)選地分離的核酸序列，該核酸序列包括來自如SEQ ID NO:5中所列出的核苷酸1-1348的至少10-15個連續(xù)核苷酸(在此任意地命名為5'側(cè)翼序列)，或它們的互補物(還被披露為SEQ ID NO:111)。在這個方面的一個實施方案中，該側(cè)翼序列引物是選自下組，該組由下列各項組成：SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:14，以及它們的互補物。

在本發(fā)明的另一個方面，這些側(cè)翼序列引物包括優(yōu)選地分離的核酸序列，該核酸序列包括來自如SEQ ID NO:6中所列出的核苷酸1-1093的至少10-15個連續(xù)核苷酸(在此任意地命名為3'側(cè)翼序列)，或它們的互補物。在這個方面的一個實施方案中，該側(cè)翼序列引物是選自下組，該組由下列各項組成：SEQ ID NO:69至SEQ ID NO:72，以及它們的互補物。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了例如對于核酸擴增有用的引物對。這類引物對包括第一引物，該引物包括至少10-15個連續(xù)核苷酸長度的核苷酸序列，該核苷酸序列是上述基因組側(cè)翼序列(SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:6)或與之互補；以及第二引物，該引物包括被插入到該轉(zhuǎn)殖項5307基因組中的異源DNA的至少10-15個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。該第二引物優(yōu)選地包括核苷酸序列，該核苷酸序列鄰近于如SEQ ID NO:7中所列出的植物基因組側(cè)翼DNA序列的插入序列或與之互補。在這個方面的一個實施方案中，該插入序列引物是選自下組，該組由下列各項組成：SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:68，以及它們的互補物。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了檢測在生物樣品中存在相應于轉(zhuǎn)殖項5307的DNA的方法。這類方法包括：(a)使包含DNA的樣品與引物對(當這些引物被用在由來自玉米轉(zhuǎn)殖項5307的基因組DNA進行的核酸擴增反應中時)進行接觸，產(chǎn)生擴增子，該擴增子對于玉米轉(zhuǎn)殖項5307是診斷性的；(b)進行核酸擴增反應，由此產(chǎn)生該擴增子；以及(c)對該擴增子進行檢測。在這個方面的一個實施方案中，該擴增子包含選自下述組成的組的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、以及它們的互補物。

根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了檢測生物樣品中存在相應于該5307轉(zhuǎn)殖項的DNA的方法。這類方法包括：(a)使包含DNA的樣品與一種探針進行接觸，該探針在高嚴謹條件下與來自玉米轉(zhuǎn)殖項5307的基因組DNA雜交并且在高嚴謹條件下不與對照玉米植物的DNA雜交；(b)使該樣品以及探針經(jīng)受高嚴謹雜交條件；以及(c)檢測該探針與該DNA的雜交。該被檢測的雜交的DNA序列包括下列各項的至少一個多核苷酸序列，包括：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、以及它們的互補物。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了試劑盒用來檢測在生物樣品中的轉(zhuǎn)殖項5307核酸。該試劑盒包括至少一個DNA序列，該序列包括足夠長的多核苷酸，該多核苷酸是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或與其互補，其中該DNA序列作為與來自轉(zhuǎn)殖項5307的分離的DNA雜交的引物或探針是有用的，并且當擴增樣品中的核酸序列或與其雜交隨后對該擴增子或與該目標序列的雜交進行檢測時，這些引物或探針是對于樣品中存在來自轉(zhuǎn)殖項5307的核酸序列是診斷性的。該試劑盒進一步包括使核酸雜交或者擴增方法能夠完成的必需的其他材料。

在另一個方面，本發(fā)明提供了檢測生物樣品中玉米轉(zhuǎn)殖項5307蛋白的一種方法，包括：(a)從玉米轉(zhuǎn)殖項5307組織的樣品中提取蛋白；(b)使用免疫方法來測定該提取的蛋白，該方法包括對于由該5307轉(zhuǎn)殖項產(chǎn)生的殺蟲性或選擇性標記蛋白特異性的抗體；以及(c)檢測所述抗體與該殺蟲性或選擇性標記蛋白的結(jié)合。

在另一方面，本發(fā)明提供了從轉(zhuǎn)殖項5307玉米植物、組織、或種子得到的一種生物樣品，其中該樣品包括核酸，該核酸包括核苷酸序列，該序列是選自下組的序列或與其互補，該組由下列各項組成：SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2，并且該序列在該樣品中使用核酸擴增或核酸雜交的方法是可檢測的。在這個方面的一個實施方案中，該樣品選自下組，該組由下列各項組成：玉米面粉、玉米粗粉、玉米糖漿、玉米油、玉米淀粉、以及全部或部分地包含玉米副產(chǎn)物的制造的谷類食物。

在另一個方面，本發(fā)明提供了從包含一種核苷酸序列的轉(zhuǎn)殖項5307玉米植物、組織、或種子得到的提取物，該序列是選自下組的核苷酸序列或與其互補，該組由下列各項組成：SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2。在這個方面的一個實施方案中，在該提取物中該序列用一種核酸擴增或核酸雜交的方法是可檢測的。在這個方面的另一個實施方案中，該樣品選自下組，該組由下列各項組成：玉米面粉、玉米粗粉、玉米糖漿、玉米油、玉米淀粉、以及全部或部分地包含玉米副產(chǎn)物的制造的谷類食物。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了包括本發(fā)明的核酸分子的玉米植物以及種子。在本發(fā)明的一個實施方案中，轉(zhuǎn)殖項5307玉米種子的保存物是根據(jù)2008年10月15日的布達佩斯條約存放到美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。所述種子的樣品被存放為ATCC登錄號：PTA-9561，其分類命名為美國玉蜀黍(Corn,Zea mays,USA):5307。

根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)至少抗玉米根蟲侵染的玉米植物的一種方法，包括：(a)將第一親本玉米植物與第二親本玉米植物進行有性雜交，其中該第一或第二親本玉米植物包括玉米轉(zhuǎn)殖項5307DNA，由此產(chǎn)生大量的第一代子代植物；(b)選擇第一代子代植物，該植物至少是抗玉米根蟲侵染的；(c)將該第一代子代植物自交，由此產(chǎn)生大量的第二代子代植物；(d)從該第二代子代植物中選擇植物，該植物至少是抗玉米根蟲侵染的；其中該第二代子代植物包括選自下述組成的組的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4。

然而根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)玉米種子的方法，包括將第一親本玉米植物與第二親本玉米植物進行雜交，并且收集得到的第一代玉米種子，其中該第一或第二親本玉米植物是本發(fā)明的近交玉米植物。

根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)雜交玉米種子的一種方法，包括以下步驟：(a)播種根據(jù)本發(fā)明的第一近交玉米系的種子以及具有不同基因型的第二近交玉米系的種子；(b)培養(yǎng)從所述種子得到的玉米植物直至開花的時間；(c)將這些玉米近交系之一的玉米植物的花去雄；(d)允許發(fā)生其他近交系的授粉，以及(e)收獲由此生產(chǎn)的雜種種子。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了選擇染色體5上包括轉(zhuǎn)殖項5307的核酸分子的玉米植物以及種子的方法。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用了多態(tài)性標記來選擇或跟蹤對于5307玉米轉(zhuǎn)殖項特異性的序列。本發(fā)明提供了選擇對于5307玉米轉(zhuǎn)殖項特異性的序列的方法，包括以下步驟：(a)對多態(tài)性標記序列進行檢測；(b)為了檢測該標記的目的設(shè)計測定法；(c)在來自多個玉米系的玉米核酸序列上運行該測定法；以及(d)基于具有對于玉米轉(zhuǎn)殖項5307具有特異性的核苷酸的序列來選擇玉米系。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了染色體5上的位點用于靶向整合異源核酸。本發(fā)明提供了選擇對于5307玉米轉(zhuǎn)殖項特異的用于靶向整合的序列的方法，包括以下步驟：(a)基于該插入位點或載體序列來設(shè)計同源序列；(b)在目標基因座處使用這些同源序列；(c)使用鋅指核酸酶從而在該目標基因座處產(chǎn)生斷裂；以及(d)將異源供體分子插入對于玉米轉(zhuǎn)殖項5307特異的核苷酸或pS YN 12274的載體序列中。這種技術(shù)的一個實例被證明于Shukla等人(Nature vol.459,21May 2009)中。

本發(fā)明上述以及其他方面將從以下詳細說明中變得更清楚。

序列表中序列的說明

SEQ ID NO:1是5'基因組-插入片段接點。

SEQ ID NO:2是3'插入片段-基因組接點。

SEQ ID NO:3是5'基因組+插入片段序列。

SEQ ID NO:4是3'插入片段+基因組序列。

SEQ ID NO:5是5'基因組+插入片段序列。

SEQ ID NO:6是3'玉米基因組側(cè)翼序列。

SEQ ID NO:7是轉(zhuǎn)殖項5307全長插入片段。

SEQ ID NO:8-14是本發(fā)明中有用的5'側(cè)翼序列引物。

SEQ ID NO:15-68是本發(fā)明中有用的5307轉(zhuǎn)基因插入片段引物。

SEQ ID NO:69-72是本發(fā)明中有用的3'側(cè)翼序列引物。

SEQ ID NO:73-75是FR8a TAQMAN引物以及探針。

SEQ ID NO:76-78是PMI TAQMAN引物以及探針。

SEQ ID NO:79-81是ZmAdh TAQMAN引物以及探針。

SEQ ID NO:82-90是本發(fā)明中有用的5307轉(zhuǎn)殖項特異性引物以及探針。

SEQ ID NO:91-102是本發(fā)明中有用的玉米基因組引物以及探針。

SEQ ID NO:103是AC202955染色體5序列，其中N是任何堿基(“A”、“T”、“G”或“C”)。

SEQ ID NO:104是umcl475標記區(qū)域。

SEQ ID NO:105-106是umcl475引物。

SEQ ID NO:107是uazl90標記區(qū)域。

SEQ ID NO:108-109是uazl90引物。

SEQ ID NO:110是SEQ ID NO:103(AC202955染色體5序列)的反向互補物，其中N是任何堿基(“A”、“T”、“G”或“C”)。

SEQ ID NO:111是5'玉米基因組側(cè)翼序列。

附圖簡要說明

圖1說明了被命名為pSYN12274的一個植物表達載體。該質(zhì)粒圖譜鑒定出用于Southern分析的Smal和Pmel限制性位點。

圖2是一個繪制的圖譜，該圖說明了這些元件的結(jié)構(gòu)，這些元件包括被插入到玉米的基因組中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)殖項5307的異源核酸序列，并且列出了多個相對位置，在這些位置處這些被插入的核酸序列被連接到玉米基因組DNA序列上，這些玉米基因組DNA序列位于這些被插入的異源DNA序列的末端的側(cè)翼。l＝5'側(cè)翼植物基因組(SEQ ID NO:5)；2＝右邊緣區(qū)域；3＝CMP啟動子；A＝FR8a基因：5＝NOS終止子；6＝ZmUbINT啟動子；I＝PMI基因；8＝NOS終止子；9＝左邊緣區(qū)域(區(qū)段2至9被包含在SEQ ID NO:7中)；并且10＝3'側(cè)翼植物基因組(SEQ ID NO:6)。

定義

提供了下列定義和方法以更好地定義本發(fā)明并且指導本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員實施本發(fā)明。除非另作說明，此處所使用的術(shù)語應根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的那些普通技術(shù)人員的常規(guī)用法來理解。在分子生物學中普通術(shù)語的定義還可以在Rieger et al.,Glossary of Genetics:Classical and Molecular,5ss edition,Springer-Verlag:New York,1994中找到。

如在此所使用的，術(shù)語“擴增的”是指使用至少一種核酸分子作為模板，構(gòu)建核苷酸分子的多個拷貝或與該核酸分子互補的多個拷貝。擴增系統(tǒng)包括聚合酶鏈式反應(PCR)系統(tǒng)、連接酶鏈式反應(LCR)系統(tǒng)、基于核酸序列的擴增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Q-β復制酶系統(tǒng)、基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng)(TAS)，以及鏈置換擴增(SDA)。參見，例如，Diagnostic Molecular Microbiology:Principles and Applications,D.H.Persing et al,Ed.,American Society for Microbiology,Washington,D.C.(1993)。擴增產(chǎn)物被稱為擴增子。

“生物樣品”是一種植物、植物材料或包括植物材料的產(chǎn)品。術(shù)語“植物”旨在包括玉米(玉蜀黍)植物組織(處于任何成熟階段)，以及從任何一個這樣的植物取得或得到的細胞、組織、器官，包括但不限于任何種子、葉、莖、花、根、單細胞、配子、細胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。如在此所使用的“植物材料”是指從植物獲得或衍生的材料。包括植物材料的產(chǎn)品涉及食物、飼料或使用植物材料來生產(chǎn)的或可以被植物材料污染的(contaminated)其他產(chǎn)品。應當理解的是在本發(fā)明的上下文中是針對對于玉米轉(zhuǎn)殖項5307特異的核酸的存在(暗示樣品中存在核酸)來測試這樣的生物樣品。因此，在此提到的用來鑒定生物樣品中的玉米轉(zhuǎn)殖項5307的方法涉及鑒定生物樣品中的核酸，這些核酸來自轉(zhuǎn)殖項5307玉米植物并且對于轉(zhuǎn)殖項5307是診斷性的。

“編碼序列”是被轉(zhuǎn)錄成RNA的核酸序列，例如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正義RNA或反義RNA。優(yōu)選地，該RNA然后在生物體中被翻譯以產(chǎn)生蛋白質(zhì)。

此處所用的“檢測試劑盒”是指用來在樣品中檢測來自轉(zhuǎn)殖項5307玉米植物的DNA存在或不存在的一種試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明的核酸探針和引物(它們在高嚴謹?shù)臈l件下特異性地與靶DNA序列雜交)以及使核酸雜交或者擴增方法能夠完成所必要的其他材料。

如此處所用，術(shù)語轉(zhuǎn)基因的“轉(zhuǎn)殖項”是指一種通過用異源DNA(例如，包括感興趣的基因的表達盒)轉(zhuǎn)化和再生單個的植物細胞而產(chǎn)生的重組植物。術(shù)語“轉(zhuǎn)殖項”是指包含該異源DNA的原始轉(zhuǎn)化體和/或該轉(zhuǎn)化體的子代。術(shù)語“轉(zhuǎn)殖項”也指在該轉(zhuǎn)化體與另一個玉米系之間通過有性遠交而產(chǎn)生的子代。即使在重復回交至輪回親本后，來自該轉(zhuǎn)化的親本的插入DNA和側(cè)翼DNA存在于在該雜交子代的同樣的染色體位置。通常，植物組織的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生多個轉(zhuǎn)殖項，每個轉(zhuǎn)殖項代表DNA構(gòu)建體插入至植物細胞的基因組的不同位置上?；谠撧D(zhuǎn)基因的表達或其他希望的特征，選擇了特殊的轉(zhuǎn)殖項。因此，如在此使用的“轉(zhuǎn)殖項5307”、“5307轉(zhuǎn)殖項”、或“5307”是指初始的5307轉(zhuǎn)化體和/或5307轉(zhuǎn)化體的子代，包括從其得到的任何植物。

如在此使用的“表達盒”是指能夠在適當?shù)乃拗骷毎兄敢厥夂塑账嵝蛄械谋磉_的一種核酸分子，包含可操作地連接到感興趣的核苷酸序列(其可操作地連接到終止信號上)上的啟動子。它還典型地包含正確翻譯該核苷酸序列所需的序列。該表達盒還可以包含一些在感興趣的核苷酸序列的直接表達中不是必需的但是由于方便的限制位點為了從表達載體去除該表達盒而存在的序列。包含該感興趣的核苷酸序列的表達盒可以是嵌合體的，意味著它的至少一個組分相對于它的至少一個其他組分是異源的。該表達盒還可以是一種天然發(fā)生的表達盒，但已經(jīng)是以在對異源表達有用的重組體形式而獲得的。然而，典型地，該表達盒對于該宿主是異源的，即，該表達盒的特殊核酸序列不是天然發(fā)生在該宿主細胞內(nèi)，且必須是通過本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)化方法被引入該宿主細胞或該宿主細胞的祖先中。在該表達盒中核苷酸序列的表達可能是在組成型啟動子或由誘導型啟動子的控制之下，該啟動子只有當該宿主細胞暴露于一些特殊的外界刺激時才引發(fā)轉(zhuǎn)錄。在多細胞生物體的情況下，例如一種植物，該啟動子還可以對特殊組織、或器官、或者發(fā)育階段是特異的。當被轉(zhuǎn)化進植物中時，表達盒或其片段也可被稱為“插入的序列”或者“插入序列”。

“基因”是定義的區(qū)域，該區(qū)域位于基因組之內(nèi)并且，除了前述的編碼核酸序列之外，它包含其他(主要是調(diào)控性的)負責編碼部分的表達(也就是轉(zhuǎn)錄和翻譯)的控制的核酸序列。基因也可包含其他5'和3'未轉(zhuǎn)譯序列以及終止序列。其他可能存在的元件是，例如，內(nèi)含子。

“感興趣的基因”是指任何基因，當被轉(zhuǎn)移至植物時，它賦予該植物一種所希望的特征，例如抗生素抗性、病毒抗性、抗蟲性、抗病性，或者其他害蟲抗性、除草劑耐受性、改進的營養(yǎng)價值，在工業(yè)過程改進的性能或者改變的繁殖能力。“感興趣的基因”還可以是這樣基因，該基因被轉(zhuǎn)入植物用來在該植物中生產(chǎn)商業(yè)上有價值的酶或代謝產(chǎn)物。

如在此使用的“基因型”是由親本玉米植物遺傳的遺傳物質(zhì)，并不是所有這些遺傳物質(zhì)都必然地表達在后代玉米植物中。該5307基因型是指轉(zhuǎn)化進植物的基因組的異源遺傳物質(zhì)以及位于插入序列側(cè)翼的遺傳物質(zhì)。

“異源”核酸序列是這樣核酸序列，該序列與將其引入的宿主細胞并非天然相關(guān)聯(lián)，包括天然發(fā)生的核酸序列的非天然發(fā)生的多個拷貝。

“同源”核酸序列是與將其引入的宿主細胞天然相關(guān)聯(lián)的核酸序列。

當術(shù)語“分離的”用于與核酸相關(guān)時，是指這樣核酸序列，該核酸序列從至少一個污染物核酸中被鑒定并且分離出來，該污染物核酸通常是以其天然來源與該核酸序列相結(jié)合的。分離的核酸是以與其在自然界中被發(fā)現(xiàn)的不同的一種形式或設(shè)置而存在的。相比之下，未分離的核酸(例如DNA和RNA)發(fā)現(xiàn)處于它們自然存在的狀態(tài)下。分離的核酸可以是位于轉(zhuǎn)基因植物中并且仍然被認為是“分離的”。

“可操作地連接”是指在單一核酸片段上多個核酸序列的關(guān)聯(lián)，這樣使得一個的功能影響另一個的功能。例如，當啟動子能夠影響編碼序列或者功能RNA的表達時(即，該編碼序列或功能RNA處于該啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下)，則該啟動子與該編碼序列或者功能RNA是可操作地連接的。正義方向或者反義方向的編碼序列能夠與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。

如在此使用的“引物”是分離的核酸，它們通過核酸雜交被退火為互補靶DNA鏈，以在該引物與該靶DNA鏈之間形成雜交，然后通過一種聚合酶(例如DNA聚合酶)沿著該靶DNA鏈延長。多對或多組引物可以用于一種核酸分子的擴增，例如通過聚合酶鏈式反應(PCR)或者其他常規(guī)的核酸擴增方法。

“探針”是分離的核酸分子，一種常規(guī)的可檢測的標記或報道分子附接到該核酸分子上，例如一種放射性同位素、配體、化學發(fā)光體試劑或者酶。這樣一種探針與一種靶核酸的鏈互補，在本發(fā)明的情況下，與來自玉米轉(zhuǎn)殖項M5307的基因組DNA的一條鏈互補。轉(zhuǎn)殖項5307的基因組DNA可以是來自玉米植物或來自樣品，該玉米植物或樣品包括來自該轉(zhuǎn)殖項的DNA。根據(jù)本發(fā)明的探針不僅包含脫氧核糖核酸或核糖核酸，還包含與靶DNA序列特異地結(jié)合并且可以用來檢測靶DNA序列的存在的聚酰胺類以及其他探針材料。

通常這些引物和探針的長度是在10至15個核苷酸之間或更長，這些引物和探針還可以長度是在至少20個核苷酸或更長，或至少25個核苷酸或更長，或長度是在至少30個核苷酸或更長。這類引物和探針在高嚴謹雜交條件下特異地與靶序列雜交。根據(jù)本發(fā)明的引物和探針可能具有與該靶序列互補的完整序列，雖然與該靶序列不同并保留與該靶序列雜交的能力的探針可通過常規(guī)方法進行設(shè)計。

“嚴謹條件”或“嚴謹雜交條件”包括在其下一種探針與它的靶序列雜交的所指條件，以達到比其他序列更高的可檢出程度。嚴謹條件是靶序列依賴的，并取決于多核苷酸的結(jié)構(gòu)而不同。通過控制該雜交和/或洗滌條件的嚴謹度，能夠鑒定與該探針(同源探查)100％互補的靶序列?？商娲兀烧{(diào)整嚴謹條件以允許序列中的一些錯配，以便檢測到更低程度的相似性(異源探查)。更長的序列在更高溫度下特異地雜交。在“Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays",Elsevier:New York；以及Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2,Ausubel et ai,Eds.,Greene Publishing and Wiley-Interscience:New York(1995),并且還有Sambrook et al.(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(5^th Ed.Cols Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)”中找到了對于核酸雜交的廣泛指導。

特異性典型地是雜交后洗滌的功能，關(guān)鍵因素為最終洗滌溶液的離子強度和溫度。通常，對于處于定義的離子強度和PH值條件下的特異序列，高嚴謹雜交和洗滌條件被選擇為比熱熔點(T_m)約低5℃。T_m是50％的該靶序列與一種完全匹配的探針雜交的溫度(在定義的離子強度和PH值條件下)。典型地，在高嚴謹調(diào)節(jié)下，一種探針將與它的靶子序列雜交，而不與其他序列雜交。

對于互補核酸(這些互補核酸在Southern印跡或Northern印跡的濾紙上具有多于100個互補殘基)的雜交的高嚴謹雜交條件的一個實例是50％甲酰胺與1mg肝素，在42℃進行雜交過夜。非常高嚴謹?shù)南礈鞐l件的一個實例是0.15M NaCl，在72℃下約洗滌15分鐘。高嚴謹洗滌條件的一個實例是0.2x SSC洗滌，在65℃下進行15分鐘(參見，Sambrook,下文，對于SSC緩沖液的描述)。

本發(fā)明的示例性雜交條件包括在7％SDS、0.25M NaPO₄、pH 7.2、67℃條件下雜交過夜，然后在5％SDS、0.20M NaPO₄、pH 7.2、65℃條件下洗滌兩次，每次30分鐘，并在1％SDS、0.20M NaPO₄、pH7.2、65℃條件下洗滌兩次，每次30分鐘。對于例如多于100個核苷酸的雙鏈核苷酸的示例性的中等嚴謹洗滌是1x SSC，在45℃進行15分鐘。對于例如多于100個核苷酸的雙鏈核苷酸的示例性的低嚴謹洗滌是4-6x SSC，在40℃進行15分鐘。

對于約10至50個核苷酸的探針，高嚴謹條件典型地涉及在pH 7.0至8.3下小于約1.0M Na離子的鹽濃度，典型地約0.01至1.0M Na離子濃度(或其他鹽類)，并且溫度典型地是至少約30℃。高嚴謹條件還可以通過加入去穩(wěn)定試劑(例如甲酰胺)來實現(xiàn)。一般而言，相比于不相關(guān)的探針，在特定的雜交測定中觀察到高出2倍(或更高)的信噪比就表明檢測到特異的雜交。如果它們編碼的蛋白質(zhì)基本相同，則在高嚴謹條件下彼此不雜交的核酸仍然是基本相同的。例如，當使用該遺傳密碼允許的最大程度的密碼簡并而生成核酸的拷貝時，則發(fā)生這種情況。

以下是可以被用于雜交與本發(fā)明的參考核苷酸序列基本上相同的核苷酸的示例性的多組雜交/洗滌條件：在50℃下在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA下一個參考核苷酸序列優(yōu)選地與該參考核苷酸序列雜交，在50℃下在2X SSC、0.1％SDS中進行洗滌，更優(yōu)選地在50℃下在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA下雜交，在50℃下在1X SSC、0.1％SDS下進行洗滌；并且更希望地在50℃下在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA下雜交，在50℃下在0.5X SSC、0.1％SDS下進行洗滌；優(yōu)選地在50℃下在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA下雜交，在50℃下在0.1X SSC、0.1％SDS下進行洗滌；更優(yōu)選地在50℃下在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA下雜交，在65℃下在0.1X SSC、0.1％SDS下進行洗滌。本發(fā)明的這些序列可以使用所有以上條件進行檢測。為了定義本發(fā)明的目的，使用了高嚴謹條件。

“轉(zhuǎn)化”是將異源核酸引入至一種寄主細胞或生物體中的過程。具體地說，“轉(zhuǎn)化”是指將DNA分子穩(wěn)定整合進感興趣的生物體的基因組中。

“轉(zhuǎn)化的/轉(zhuǎn)基因的/重組的”是指已經(jīng)引入了異源核酸分子的宿主生物體，例如細菌或植物。該核酸分子能夠被穩(wěn)定地整合進入該宿主的基因組中或者該核酸分子也能作為染色體外的分子而存在。這樣染色體外的分子能夠自動復制。轉(zhuǎn)化的細胞、組織或者植物應理解為不僅包含轉(zhuǎn)化過程的最后產(chǎn)物，還包含其轉(zhuǎn)基因的子代?！胺寝D(zhuǎn)化的”、“非轉(zhuǎn)基因的”，或“非重組的”宿主是指一種野生型生物體，即，一種細菌或植物，它不包含異源核酸分子。如在此所使用的，“轉(zhuǎn)基因的”是指一種植物、植物細胞、或多個具有結(jié)構(gòu)或沒有結(jié)構(gòu)的植物細胞，這些細胞通過熟知的基因操作和基因插入技術(shù)已將代表感興趣的基因的核酸整合進該植物基因組中，并典型地整合進細胞核的染色體中、線粒體或其他包含染色體的細胞器中(在與天然植物或植物細胞中正常存在的位點不同的一個位點處或以多于在天然植物或植物細胞中正常存在的拷貝數(shù))。轉(zhuǎn)基因植物來自這種核酸序列的操作和插入(與天然發(fā)生的突變相反)，以產(chǎn)生一種非天然發(fā)生的植物或具有一種非天然發(fā)生的基因型的植物。植物和植物細胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的，并可能包含例如電穿孔、顯微注射、土壤桿菌屬介導的轉(zhuǎn)化、以及基因槍轉(zhuǎn)化(ballistic transformation)。

在此使用了如在37C.F.R.§1.822中對于DNA堿基和氨基酸給出的命名法。

發(fā)明詳述

本發(fā)明涉及一種遺傳改進的玉米系，該玉米系產(chǎn)生昆蟲控制蛋白質(zhì)FR8a、以及允許該植物利用甘露糖作為碳源的磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)。本發(fā)明特別涉及被命名為轉(zhuǎn)殖項5307(包含新型基因型)的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)殖項，以及檢測在生物樣品中的來自這個轉(zhuǎn)殖項的核酸的組合物以及方法。本發(fā)明進一步涉及包含該轉(zhuǎn)殖項5307基因型的玉米植物，涉及來自該玉米植物的轉(zhuǎn)基因種子，以及涉及通過將包含該轉(zhuǎn)殖項5307基因型的玉米近交體與其自身或與另一種玉米系進行雜交而產(chǎn)生包含該轉(zhuǎn)殖項5307基因型的一種玉米植物的方法。包括本發(fā)明的轉(zhuǎn)殖項5307基因型的玉米植物在控制鞘翅目昆蟲害蟲方面是有用的，這些昆蟲害蟲包括西方玉米根蟲(Diabrotica virgifera virgifera，western corn rootworm)、墨西哥玉米根蟲(D.virgifera zeae,Mexican corn rootworm)、以及北方玉米根蟲(D.longicornis barber i,northern corn rootworm)。包括本發(fā)明的轉(zhuǎn)殖項5307基因型的玉米植物還能夠利用甘露糖作為碳源。

在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種轉(zhuǎn)殖項5307玉米植物的轉(zhuǎn)基因玉米種子。所述種子的一個樣品被存放為ATCC登錄號：PTA-9561。轉(zhuǎn)殖項5307的轉(zhuǎn)基因種子包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:6、以及它們的互補物。這些序列定義了被插入到該玉米轉(zhuǎn)殖項5307的玉米植物基因組中的一種異源DNA序列的插入點。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種優(yōu)選地分離的核酸分子，該分子包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種優(yōu)選地分離的核酸分子，其中該核酸分子被包含在以ATCC登錄號PTA-9561存放的的玉米種子中。

在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種優(yōu)選地分離的核酸分子，該核酸分子包括被插入到玉米轉(zhuǎn)殖項5307的玉米植物基因組中的異源DNA序列的至少10個或更多個(例如15、20、25、或50個)連續(xù)核苷酸以及位于被插入到玉米轉(zhuǎn)殖項5307的玉米植物基因組中的異源DNA序列的插入點的側(cè)翼的玉米植物基因組DNA的至少10個或更多個(例如，15、20、25、或50個)連續(xù)核苷酸。還包括這樣的核苷酸序列，這些核苷酸系列含有來自轉(zhuǎn)殖項5307的連續(xù)插入序列的10個或更多個核苷酸以及來自鄰近該插入序列的轉(zhuǎn)殖項5307的側(cè)翼DNA的至少一個核苷酸。這類核苷酸序列是對于轉(zhuǎn)殖項5307是診斷性的。來自5307轉(zhuǎn)殖項的基因組DNA的核酸擴增產(chǎn)生了包括這類診斷性核苷酸序列的一種擴增子。

在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種優(yōu)選地分離的核酸序列，該核酸序列包括這樣的核苷酸序列，該核苷酸序列包括選自下組的轉(zhuǎn)殖項5307的至少一個連接序列，該組由下列各項組成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、以及它們的互補物，其中連接序列跨越被插入到該玉米基因組中的異源表達盒與來自位于該插入位點側(cè)翼的玉米基因組的DNA之間的結(jié)點，并且是對于該轉(zhuǎn)殖項是診斷性的。

在另一個實施方案中，本發(fā)明包括優(yōu)選地分離的核酸，該核酸將異源DNA分子連接至玉米轉(zhuǎn)殖項5307中的玉米植物基因組中，該轉(zhuǎn)殖項包含從約11至約20個連續(xù)核苷酸的序列，該序列選自下組，該組由下列各項組成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2，以及它們的互補物。

在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種優(yōu)選地分離的核酸分子，該核酸分子包括選自下述組成的組的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4，以及它們的互補物。

在本發(fā)明的一個實施方案中提供了擴增子，該擴增子包括選自下述組成的組的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4，以及它們的互補物。

在另一個實施方案中，本發(fā)明包含用于檢測轉(zhuǎn)殖項5307的側(cè)翼序列引物。這類側(cè)翼序列引物包括分離的核酸序列，該核酸序列包括來自SEQ ID NO:5(在此任意地命名為5'側(cè)翼序列)的核苷酸1-1348的至少10-15個連續(xù)核苷酸，或它們的互補物(也被披露為SEQ ID NO:111)。在這個實施方案的一個方面，該側(cè)翼序列引物是選自下組，該組由下列各項組成：SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:14，以及它們的互補物。這些側(cè)翼序列可以被延伸以包括染色體5序列，其中特別強調(diào)的是包括SEQ ID NO:103的核苷酸在檢測與5307玉米轉(zhuǎn)殖項相關(guān)的序列方面是有用的。在SEQ ID NO:103的背景下，“N”被定義為任何堿基(“A”、“T”、“G”、或“C”)。SEQ ID NO:110是這個序列的反向互補物。在SEQ ID NO:110的背景下，“N”被定義為任何堿基(“A”、“T”、“G”、或“C”)。

在另一個實施方案中，本發(fā)明包括側(cè)翼序列引物，這些引物包括來自SEQ ID NO:6(在此被任意地命名為3'側(cè)翼序列)的核苷酸1-1093的至少10-15個連續(xù)核苷酸，或它們的互補物。在這個實施方案的一個方面，該側(cè)翼序列引物是選自下組，該組由下列各項組成：SEQ ID NO:69至SEQ ID NO:72，以及它們的互補物。

在又另一個實施方案中，本發(fā)明包括一對多核苷酸引物，包括第一多核苷酸引物以及第二多核苷酸引物，在樣品中玉米轉(zhuǎn)殖項5307DNA模板的存在下它們一起起作用從而產(chǎn)生對于玉米轉(zhuǎn)殖項5307是診斷性的擴增子，其中該第一引物序列是位于被插入到玉米轉(zhuǎn)殖項5307的玉米植物基因組中的異源DNA序列的插入點側(cè)翼的玉米植物基因組或與其互補，并且該第二多核苷酸引物序列是被插入到該玉米轉(zhuǎn)殖項5307的玉米植物基因組中的異源DNA序列或與其互補。

在這個實施方案的一個方面，該第一多核苷酸引物包含來自SEQ ID NO:5的位置1-1348的至少10個連續(xù)核苷酸，或者它們的互補物。在這個實施方案的另一個方面，該第一多核苷酸引物包括在SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:14中列出的核苷酸序列，或它們的互補物。在這個實施方案的另一個方面，該第一多核苷酸引物包含來自SEQ ID NO:6的位置1-1093的至少10個連續(xù)核苷酸，或者它們的補體。在這個實施方案的另一個方面，該第一多核苷酸引物包括在SEQ ID NO:69至SEQ ID NO:72中列出的核苷酸序列，或它們的互補物。在這個實施方案的又另一個方面，該第二多核苷酸引物包含SEQ ID NO：7的至少10個連續(xù)核苷酸，或者它們的互補物。在這個實施方案的又另一個方面，該第二多核苷酸引物包括在SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:68中列出的核苷酸序列，或它們的互補物。

在這個實施方案的另一方面，該第一多核苷酸引物(在SEQ ID NO:8中列出)以及該第二多核苷酸引物(在SEQ ID NO:41中列出)在樣品中在玉米轉(zhuǎn)殖項5307DNA模板存在下共同起作用，以產(chǎn)生如實例4中所描述的對于該玉米轉(zhuǎn)殖項5307是診斷性的一種擴增子。在這個實施方案的另一方面，該第一多核苷酸引物(在SEQ ID NO:69中列出)以及該第二多核苷酸引物(在SEQ ID NO:72中列出)在一個樣品中在一個玉米轉(zhuǎn)殖項5307DNA模板存在下共同起作用，以產(chǎn)生如實例4中所描述的對于該玉米轉(zhuǎn)殖項5307是診斷性的擴增子。

本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)容易獲得進一步向外進入位于該插入的異源DNA序列的任何一端側(cè)翼的基因組序列中的額外的序列，以此用作一種引物序列，該引物序列可用于這類引物對中以擴增對于該5307轉(zhuǎn)殖項是診斷性的序列。為了本披露的目的，短語“進一步向外進入位于該插入的異源DNA序列的任何一端側(cè)翼的基因組序列中”具體指序列運動，該運動遠離該插入的異源DNA序列的末端(插入的DNA序列鄰近天然基因組DNA序列的點)并且向外進入該特殊染色體的基因組DNA(該異源DNA序列被插入該特殊染色體)。優(yōu)選地，對應于該插入序列的一部分的引物序列或與該插入序列的一部分互補的引物序列將DNA或RNA的一條新生鏈的轉(zhuǎn)錄延長部分引(prime)向最近的側(cè)翼序列接點。因此，對應于該基因組側(cè)翼序列的一部分或與該基因組側(cè)翼序列的一部分互補的引物序列將DNA或RNA的一條新生鏈的轉(zhuǎn)錄延長引向最近的側(cè)翼序列接點。引物序列可以是插入至該植物的染色體中的異源DNA序列或基因組側(cè)翼序列，或者能夠與其互補。本領(lǐng)域的一位普通技術(shù)人員將很容易認識到如下益處：引物序列是否需要是(或者是否需要是互補于)在該插入的異源DNA序列中給出的或在SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中給出的序列取決于通過使用嵌套引物所希望獲得的產(chǎn)品的性質(zhì)，這些引物旨在用于擴增特定的側(cè)翼序列，該側(cè)翼序列包含在該基因組DNA序列與該插入的異源DNA序列之間的接點。此外，為了設(shè)計陽性對照的目的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應該能夠為多個天然玉米基因設(shè)計引物。一個這樣的實例是玉米Adhl基因，其中用于通過核酸擴增來生產(chǎn)擴增子的適合的引物的實例被列出為SEQ ID NO:79以及SEQ ID NO:80。

在另一個實施方案中，本發(fā)明包括檢測生物樣品中存在相應于轉(zhuǎn)殖項5307的DNA的一種方法，其中該方法包括：(a)將包含DNA的樣品與一種探針進行接觸，該探針在高嚴謹條件下與來自玉米轉(zhuǎn)殖項5307的基因組DNA雜交并且在高嚴謹條件下不與對照玉米植物的DNA雜交；(b)使該樣品和探針經(jīng)受高嚴謹雜交條件；以及(c)檢測該探針與該DNA的雜交。在這個實施方案的一個方面，該擴增子包括選自下述組成的組的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4，以及它們的互補物。

在另一個實施方案中，本發(fā)明包括檢測生物樣品中存在相應于5307轉(zhuǎn)殖項的DNA的一種方法，其中該方法包括：(a)將包含DNA的樣品與一種探針進行接觸，該探針在高嚴謹條件下與來自玉米轉(zhuǎn)殖項5307的基因組DNA雜交并且在高嚴謹條件下不與對照玉米植物的DNA雜交；(b)使該樣品以及探針經(jīng)受高嚴謹雜交條件；以及(c)檢測該探針與該DNA的雜交?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域熟知的任何方法進行檢測，包括但不限于熒光的、化學發(fā)光的、放射線學的、免疫學的、或其他的方法。在雜交旨在被用作擴增特殊序列的方法以產(chǎn)生對于該5307玉米轉(zhuǎn)殖項是診斷性的一個擴增子的情況下，通過本領(lǐng)域熟知的任何方法進行的該擴增子的生產(chǎn)和檢測旨在指示該目標序列的預期雜交(其中使用了探針或引物)或者用來指示一些序列的雜交(其中使用了兩個或更多個探針或引物)。術(shù)語“生物樣品”旨在包括一種含有或被懷疑含有一種核酸的樣品，它包含在如下點的任一側(cè)的五個和十個之間的核苷酸，在該點處插入的異源DNA序列的兩個終止端的一個或另一個接觸在該染色體內(nèi)的該基因組DNA序列(該異源DNA序列被插入該染色體中)，此處也被稱為接點序列。另外，該接點序列包含少至兩個核苷酸：它們是在該側(cè)翼基因組DNA內(nèi)的第一核苷酸，鄰近并共價連接至在該插入的異源DNA序列內(nèi)的第一核苷酸。

在又另一個實施方案中，本發(fā)明包括用來檢測生物樣品中存在轉(zhuǎn)殖項5307核酸的一種試劑盒，其中該試劑盒包括與選自下組的核苷酸序列同源或互補的足夠長度的連續(xù)核苷酸的至少一種核酸分子，該組由下列各項組成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、以及SEQ ID NO:4，該核苷酸序列作為DNA引物或?qū)τ谵D(zhuǎn)殖項5307特異的探針起作用，以及使核酸雜交或擴增能夠?qū)崿F(xiàn)所必需的其他物質(zhì)。能夠使用多種檢測方法，包括TAQMAN(Perkin Elmer)、熱擴增、連接酶鏈反應、Southern雜交、ELISA法，以及比色和熒光檢測法。具體地，本發(fā)明提供了用于檢測在包含來自轉(zhuǎn)殖項5307的基因組核酸的樣品中的目標序列(即轉(zhuǎn)殖項5307中插入的DNA與玉米植物的基因組DNA的結(jié)點中的至少一個)的存在的試劑盒。該試劑盒包含至少一種多核苷酸，該多核苷酸能夠結(jié)合至該靶位點上或基本上鄰近該靶位點，以及至少一種手段，該手段用于檢測該多核苷酸與該靶位點的結(jié)合。這些檢測手段可為熒光的、化學發(fā)光的、比色的或者同位素的手段，并且可以加上至少免疫學方法以檢測該結(jié)合。還構(gòu)思了試劑盒，它能夠檢測在樣品中的該靶位點的存在，即，轉(zhuǎn)殖項5307中插入DNA與玉米植物的基因組DNA的接點中至少一個，利用了兩種或更多種多核苷酸序列，這些多核苷酸序列在一起能結(jié)合至鄰近該靶序列核苷酸序列或在該靶序列的約100個堿基對之內(nèi)、或在約200個堿基對之內(nèi)、或在約500個堿基對之內(nèi)或在約1000個堿基對之內(nèi)，并且這些多核苷酸序列能向彼此延伸以形成包含至少該靶位點的擴增子。

在另一個實施方案中，本發(fā)明包括用于檢測生物樣品中轉(zhuǎn)殖項5307蛋白的一種方法，該方法包括：(a)從玉米轉(zhuǎn)殖項5307組織的樣品中提取蛋白；(b)使用一種免疫學方法來測定所提取的蛋白，該方法包括對于由該5307轉(zhuǎn)殖項產(chǎn)生的殺蟲性或選擇性標記蛋白具有特異性的抗體；以及(c)檢測所述抗體與該殺蟲性或選擇性標記蛋白的結(jié)合。

本發(fā)明的另一個實施方案包括一種包括該轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)殖項5307的基因型的玉米植物或其多個部分，其中該基因型包括以下各項中列出的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、或它們的互補物。

在這個實施方案的一個方面，該玉米植物是來自以下近交玉米系：CG5NA58、CG5NA58A、CG3ND97、CG5NA01、CG5NF22、CG4NU15、CG00685、CG00526、CG00716、NP904、NP948、NP934、NP982、NP991、NP993、NP2010、NP2013、NP2015、NP2017、NP2029、NP2031、NP2034、NP2045、NP2052、NP2138、NP2151、NP216j5、NP2161、NP2171、NP2174、NP2208、NP2213、NP2222、NP2275、NP2276、NP2316、BCTT609、AF031、H8431、894、BUTT201、R327H、2044BT、以及2070BT。然而本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到該轉(zhuǎn)殖項5307基因型能夠被基因滲入至任何能用玉米進行育種的植物品種(包括野生型玉蜀黍種)中，因此這個實施方案的優(yōu)選的近交系并不意味著是限制性的。

在另一個實施方案中，本發(fā)明包含玉米植物，該植物包含至少一個第一DNA序列和一個第二DNA序列，它們連接在一起形成連續(xù)的核苷酸序列，其中該第一DNA序列在連接序列內(nèi)并且包含至少約10-15個連續(xù)核苷酸，這些核苷酸選自下組，該組由下列各項組成：核苷酸SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、以及它們的互補物，其中該第二DNA序列在選自下組的異源插入DNA序列之內(nèi)，該組由下列各項組成：SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:68，以及它們的互補物；并且其中該第一和第二DNA序列作為核苷酸引物或探針對于檢測在生物樣品中的玉米轉(zhuǎn)殖項5307核酸序列的存在是有用的。在這個實施方案的一個方面，該核苷酸引物被用在DNA擴增方法中以擴增來自從該玉米植物中提取的模板DNA的靶DNA序列，并且該玉米植物通過對應于包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的DNA序列的擴增子的產(chǎn)生而可以從其他玉米植物中鑒定出來。

本發(fā)明的玉米植物可以被進一步表征：用限制性內(nèi)切核酸酶Smal和Pmel消化該植物的基因組DNA導致在高嚴謹條件下使用全長探針產(chǎn)生一種單一的雜交帶。此處舉例證明的是包含SEQ ID NO:7中給出的核苷酸序列的一種全長探針。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種玉米植物，其中該轉(zhuǎn)殖項5307基因型賦予該玉米植物對昆蟲的抗性或利用甘露糖的能力。在這個實施方案的一個方面，賦予該玉米植物對昆蟲的抗性的基因型包括一種FR8a基因。在這個實施方案的另一個方面，對該玉米植物賦予利用甘露糖的能力的基因型包括一種PMI基因。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了從轉(zhuǎn)殖項5307玉米植物、組織、或種子得到的生物樣品，其中該樣品包括一種選自下組的序列或與其互補的核苷酸序列，該組由下列各項組成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4，并且其中在該樣品中的該序列使用核酸擴增或核酸雜交的方法是可檢測的。因此，該基因序列作為一種檢測手段而起作用。在這個實施方案的一個方面，該樣品選自以下各項：玉米面粉、玉米粗粉、玉米糖漿、玉米油、玉米淀粉，以及全部或部分地包含玉米副產(chǎn)物的制造的谷類食物。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了從包含一種核苷酸序列的轉(zhuǎn)殖項5307玉米植物、組織、或種子得到的提取物，該核苷酸序列是選自下組的一種核苷酸序列或與其互補，該組由下列各項組成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4。這樣的種子的一個實例被存放在ATCC的登錄號PTA-9561下。在這個實施方案的一個方面，使用一個核酸擴增或核酸雜交的方法檢測了在該提取物中的該序列。在這個實施方案的另一個方面，該樣品選自以下各項：玉米面粉、玉米糖漿、玉米油、玉米淀粉，以及全部或部分地包含玉米副產(chǎn)物的制造的谷類食物。

在又另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)至少抵抗一種玉米根蟲侵染的玉米植物的方法，包括：(a)將第一親本玉米植物與第二親本玉米植物進行有性雜交，其中所述第一或第二親本玉米植物包括玉米轉(zhuǎn)殖項5307DNA，由此產(chǎn)生大量的第一代子代植物；(b)選擇第一代子代植物，該植物是對于至少一種玉米根蟲侵染是抵抗性的；(c)將該第一代子代植物自交，由此產(chǎn)生大量的第二代子代植物；以及(d)從該第二代子代植物中選擇一種植物，該植物是至少抗玉米根蟲侵染的；其中該第二代子代植物包括選自下述組成的組的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)雜交玉米種子的一種方法，包括：(a)播種第一近交玉米系的種子，該玉米系包含選自下組的一種核苷酸序列，該組由下列各項組成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、以及SEQ ID NO:4，并且播種具有不同基因型的一種第二近交系的種子；(b)培育來自所述播種的玉米植物直到開花的時期；(c)將這些玉米近交系中的植物的所述的花去雄；(d)將這兩種不同的近交系彼此有性雜交；以及(e)收獲由此生產(chǎn)的雜交種子。在這個實施方案的一個方面，該第一近交玉米系提供了母本。在這個實施方案的另一個方面，該第一近交玉米系提供了父本。本發(fā)明還包括通過實施的方法產(chǎn)生的種子以及由該種子長成的雜交植物。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了選擇與玉米轉(zhuǎn)殖項5307相關(guān)的標記的方法，包括：(a)篩選玉米轉(zhuǎn)殖項5307染色體5序列，(b)將這些與非轉(zhuǎn)基因NP2222序列進行比較，(c)為了檢測序列變異的目的來比較這些序列，(d)將這些序列變異用作手段來開發(fā)與玉米轉(zhuǎn)殖項5307相關(guān)的標記，(e)使用這些標記來篩選系，以及(f)檢測該標記證實在染色體5上存在玉米轉(zhuǎn)殖項5307序列。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認識到本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因基因型能通過育種而基因滲入至包含不同轉(zhuǎn)基因基因型的其他玉米系中。例如，可以將包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因基因型的玉米近交系與包含抗鱗翅目的Bt11轉(zhuǎn)殖項的轉(zhuǎn)基因基因型的玉米近交系進行雜交，這是本領(lǐng)域已知的，從而產(chǎn)生了包括本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因基因型和該Bt11轉(zhuǎn)基因基因型兩者的玉米種子。其他轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)殖項的實例(這些轉(zhuǎn)殖項可以與本發(fā)明的近交系進行雜交)包括草甘膦除草劑耐受性轉(zhuǎn)殖項GA21以及NK603、草甘膦耐受性/鱗翅目昆蟲抗性的MON802轉(zhuǎn)殖項、鱗翅目昆蟲抗性轉(zhuǎn)殖項DBT418、鱗翅目昆蟲抗性轉(zhuǎn)殖項DAS-06275-8、鱗翅目昆蟲抗性轉(zhuǎn)殖項MIR162、雄性不育轉(zhuǎn)殖項MS3、草胺膦耐受性轉(zhuǎn)殖項B16、鱗翅目昆蟲抗性轉(zhuǎn)殖項MON 80100、草胺膦除草劑耐受性轉(zhuǎn)殖項T14以及T25、鱗翅目昆蟲抗性轉(zhuǎn)殖項176、鞘翅目昆蟲抗性轉(zhuǎn)殖項MIR604以及鞘翅目昆蟲抗性轉(zhuǎn)殖項MON863，所有這些在本領(lǐng)域中都是已知的。將進一步認識到可以用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的基因型進行其他組合，并因此這些實例不應被視為是限制性的。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員也將認識到包含本本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因基因型的轉(zhuǎn)基因玉米種子能用不同的種子處理化學品(包括殺蟲劑)進行處理，以增強或協(xié)同該FR8a蛋白的殺蟲活性。例如，可以用商購殺蟲劑來處理本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因玉米種子?？梢允褂眠@樣一種組合用來增加活性譜并且用來增加表達的蛋白以及化學品的效果。

育種

本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因基因型能夠采用本領(lǐng)域公認的育種技術(shù)而基因滲入至任何玉米近交系或雜種中。植物育種的目標是將不同的所希望的性狀結(jié)合在單一品種或雜交種中。對于大田作物而言，這些性狀可能包括對昆蟲和疾病的抵抗性、對除草劑的耐受性、對熱和旱的耐受性、減少農(nóng)作物成熟的時間、更高的產(chǎn)量，以及更好的農(nóng)藝學質(zhì)量。隨著許多農(nóng)作物的機械收獲，植物特征(例如發(fā)芽和植物叢建立、生長速率、成熟，以及植物和耳穗的高度)的均一性是很重要的。

大田作物是通過利用了植物授粉方法的技術(shù)進行育種的。如果來自一朵花的花粉被轉(zhuǎn)移至同一植物的同一朵花或另一朵花，則該植物是自花受粉的。如果花粉來自不同植物的花，則該植物是異花授粉的。

已經(jīng)自花授粉及對于許多代的類型進行了選擇的植物在幾乎所有基因位點變得純合，并產(chǎn)生純種子代(true breeding progeny)的均一種群。在兩種不同純合系之間的雜交產(chǎn)生雜交植物(對于很多基因位點可以是雜合的)的均一種群。兩種植物(每種在很多基因位點上是雜合的)的雜交將產(chǎn)生遺傳上不同的并且將是不均一的雜交植物的種群。

玉米能通過自花受粉和異花授粉兩種技術(shù)培育。玉米在同一個植物上具有分開的雄花和雌花，分別位于雄花穗和耳穗上。當風將花粉從雄花穗吹到從耳穗頂突出的花絲時，則在玉米中發(fā)生自然授粉。

在植物中控制雄性育性的一個可靠方法為改善植物育種提供了機會。這對于開發(fā)依賴于某些雄性不育系統(tǒng)的玉米雜種尤其是成立的。對育種者而言有幾個可用的控制雄性育性的選擇，例如，手工或機械去雄(或去雄花穗)、細胞質(zhì)雄性不育性、遺傳雄性不育性、殺配子藥等等。

雜種玉米種子通常通過雄性不育系統(tǒng)結(jié)合手工或機械去雄花穗而典型地產(chǎn)生。兩個玉米近交系以交錯條帶的方式種植在一塊地上，并且從該近交系(雌性)中去除帶花粉的雄花穗。假如能足夠隔離外來玉米花粉源，則該去雄花穗近交系的耳穗將只從另一個近交系(雄性)受精，因此得到的種子是雜種并且將形成雜交植物。

通過使用本領(lǐng)域中賦予遺傳的雄性不育性的許多方法(每種方法都有其自身的優(yōu)點和缺點)中的一種方法能夠避免這種費力的且有時不可靠的去雄花穗的方法。這些方法采用多種途徑，例如將一種編碼細胞毒性物質(zhì)的基因遞送到該植物中，該細胞毒性物質(zhì)與雄性組織特異性啟動子或反義系統(tǒng)相關(guān)，其中對育性至關(guān)重要的基因被鑒定出來，并且該基因的反義引物被插入至該植物中(參見：Fabinjanski等EPO 89/3010153.8公開文件號329,308和公開號為WO 90/08828的PCT公開文件PCT/CA90/00037)。

玉米近交系的開發(fā)

使用雄性不育近交只是玉米雜種生產(chǎn)中的一個因素。本領(lǐng)域已知的且在玉米植物育種計劃中使用的植物育種技術(shù)包括但不限于，輪回選擇、回交、系譜育種、限制長度多態(tài)性增強選擇、標記輔助選擇和轉(zhuǎn)化。在一個玉米植物育種計劃中玉米雜種的開發(fā)通常需要純合近交系的開發(fā)、這些系的雜交、以及這些雜交的評估。系譜育種和輪回選擇育種方法被用來開發(fā)來自繁殖種群的近交系。玉米植物育種計劃將來自兩個或更多個近交系或各種其他種質(zhì)源的遺傳背景結(jié)合進入育種集合體中，從該集合體中通過自交和選擇所希望的表型而開發(fā)新的近交系。這些新的近交體與其他近交系雜交，并且評價來自這些雜交的雜種以確定它們當中哪些具有商業(yè)潛力。如在一個玉米植物育種計劃中所實踐的，植物育種和雜種開發(fā)是昂貴且耗時的過程。

系譜育種開始于兩個基因型的雜交，其中每個基因型可能具有一個或多個所希望的特征，這些特征在另一個中缺乏或補充另一個。如果這兩種原始的親本不能提供所有的所希望的特征，則可將其他源包含在該繁殖種群中。在該系譜方法中，將優(yōu)良植物自交并在連續(xù)后代中進行選擇。在這些后續(xù)代中，作為自花授粉和選擇的結(jié)果，該雜合條件對均勻系讓步。典型地，在自花授粉及選擇的培育五代或更多代的系譜方法中按如下實行：F₁→F₂；F2→F₃；F3→F₄；F₄→F₅；等。

輪回選擇育種(例如回交)可以用來改進近交系及使用這些近交體產(chǎn)生的雜種。回交可被用來將一個特異的希望的性狀從一個近交系或來源轉(zhuǎn)移至缺乏該性狀的近交系。這可以通過例如將優(yōu)良的近交體(輪回親本)與攜帶對于所討論的性狀適當?shù)囊粋€或多個基因的供體近交體(非輪回親本)進行雜交來完成。然后將這種雜交的子代配對回至該優(yōu)良的輪回親本，然后在得到的子代中對于從該非輪回親本轉(zhuǎn)移的所希望的性狀進行選擇。選擇了所希望的性狀的五代或更多代回交代之后，該子代對于控制被轉(zhuǎn)移的特性的位點將是純合的，但對于基本上所有其他基因?qū)⑴c該優(yōu)良的親本相像。然后，最后回交的子代進行自交以便對于被轉(zhuǎn)移的一個或多個基因給出純合子代。從包含被轉(zhuǎn)移的一個或多個基因的近交體中發(fā)育的雜種與從沒有被轉(zhuǎn)移該一個或多個基因的同樣的近交體發(fā)育的雜種基本上是一樣的。

良種近交系，即，純種繁育的純合近交系，還可作為起始材料被用于育種或作為由此發(fā)展其他近交系的源種群。源自良種近交系的這些近交系可以用以上描述的系譜育種和輪回選擇育種方法來開發(fā)。作為一個實例，當在玉米植物育種計劃中使用回交育種來創(chuàng)造這些衍生系時，良種近交體可以被用作親本系或起始材料或源種群，并且可以作為供體或輪回親本。

玉米雜交體的開發(fā)

單交玉米雜種來自兩個近交系的雜交，這兩個近交系中的每一個具有一個與另一個基因型互補的基因型。該第一代的雜種子代被命名為F₁。在玉米植物育種計劃中的商品雜種的開發(fā)中，僅僅搜索F₁雜種植物。優(yōu)選的F₁雜種比它們的近交親本更有活力的。這種雜種活力或雜種優(yōu)勢可以在許多的多基因性狀中表現(xiàn)出來，包括增加的植物生長及增加的產(chǎn)率。

在一個玉米植物育種計劃中的玉米雜種的開發(fā)涉及三個步驟：(1)從不同種質(zhì)庫選擇植物用于起始育種雜交；(2)將從幾代的育種雜交中選擇的植物進行自交以產(chǎn)生一系列近交系，雖然這些近交系彼此不同，但是它們是純種傳代的且高度均一的；以及(3)將所選擇的近交系與不同的近交系進行雜交以產(chǎn)生雜種子代(F₁)。在玉米的同系繁殖過程中，這些系的活力下降。當兩種不同的近交系雜交以產(chǎn)生雜種子代(F₁)時活力被恢復。這些近交系的純合性和均一性的重要結(jié)果是在已確定的近交對之間的雜種將總是一樣的。一旦給出優(yōu)良雜種的近交體被鑒定出來，只要保持這些近交親本的均一性，就能無限地復制該雜種種子。通過F₁雜種展示的許多雜種活力在下一代(F₂)中消失。因此，來自雜種的種子不用于播種儲備。

雜種種子的生產(chǎn)需要將通過該母本產(chǎn)生的花粉消除或失活?；ǚ鄣牟煌耆コ蚴Щ顬樽曰ㄊ诜厶峁┝丝赡苄?。這個不注意地自花授粉的種子可能無意中與雜種種子一起收獲并包裝。

一旦該種子被播種，有可能鑒定并選擇這些自花授粉的植物。這些自花授粉的植物將與用來產(chǎn)生該雜種的雌性近交系在遺傳上是等同的。

如對本領(lǐng)域的一位普通技術(shù)人員很清楚的是，前述只是不同方式中的一些方式，通過這些方式那些尋求將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的基因型滲入至其他玉米系的人們可獲得本發(fā)明的近交體。還有其他可供使用的手段，并且上述實例僅僅是說明性的。

實施例

通過參考以下具體的實例可以進一步描述本發(fā)明。這些實例僅僅是作為說明性的目的而提供的，并且不旨在進行限制，除非另外說明。在此所使用的標準的重組DNA以及分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且被Ausubel(ed.), Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(1994)；J.Sambrook,et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d Ed.,Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)；and by T.J.Silhavy,M.L.Berman,and L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1984)進行了描述。

實例1.5307轉(zhuǎn)殖項的轉(zhuǎn)化和選擇

通過土壤桿菌屬介導的轉(zhuǎn)化近交玉米(玉蜀黍)系NP2222來產(chǎn)生5307轉(zhuǎn)殖項。使用來自質(zhì)粒pSYN12274的DNA片段，基本上如Negrotto等人(Plant Cell Reports 19:798-803,2000)(該文件通過引用結(jié)合在此)中所述轉(zhuǎn)化未成熟胚(圖1)。pSYN12274包含核苷酸序列，該序列包括串聯(lián)表達盒。該第一表達盒包括CMP啟動子序列(美國專利7,166,770)，該啟動子序列可操作地連接到FR8a編碼序列上，該編碼序列進一步可操作地連接到胭脂堿合成酶3'端轉(zhuǎn)錄終止以及多腺苷酸化序列上。該第二表達盒包括玉米泛素啟動子(ZmUbilnt)(Christensen et al.1992PMB 18:675)，該啟動子可操作地連接到PMI編碼序列上，該序列進一步可操作地連接到胭脂堿合酶3'端轉(zhuǎn)錄終止以及多腺苷酸化序列上。

從8至12天的耳穗上切下未成熟胚并用新鮮的培養(yǎng)基沖洗以為轉(zhuǎn)化作準備。將胚與包含轉(zhuǎn)化載體pSYN12274的土壤桿菌屬細胞的懸浮液混合，渦旋30秒，并允許孵育另外的5分鐘。抽吸過量的土壤桿菌屬溶液，然后將胚移至含有非選擇性培養(yǎng)基的平板上。將胚在22℃、黑暗條件下與剩余的土壤桿菌屬共培養(yǎng)2至3天。將胚轉(zhuǎn)移至補充有替卡西林(100mg/ml)和硝酸銀(1.6mg/1)的培養(yǎng)基中，并在黑暗條件下孵育10天。將產(chǎn)生胚性愈傷組織的胚轉(zhuǎn)移至含有甘露糖的細胞培養(yǎng)基中。

用PCR分析(參見實例2)測試再生的小植株，以測試PMI和FR8a這兩種基因的存在、以及抗生素抗性大觀霉素(spec)基因的缺乏。將對兩種轉(zhuǎn)基因陽性并且對spec基因陰性的植物轉(zhuǎn)移至溫室中以進一步繁殖。使用抗玉米根蟲的昆蟲生物測定進行鑒定并篩選出陽性轉(zhuǎn)殖項。殺蟲轉(zhuǎn)殖項的特征在于通過TAQMAN分析的拷貝數(shù)。選擇轉(zhuǎn)殖項5307用于基于具有單拷貝的轉(zhuǎn)基因進行進一步分析，通過ELISA鑒定良好的蛋白表達、以及當與用同一構(gòu)建體制成的其他轉(zhuǎn)殖項進行比較時的抗玉米根蟲的更好的殺蟲活性。

將該T₀ 5307轉(zhuǎn)殖項與近交玉米系NP2460回交，產(chǎn)生T₁種群。將T₁植物進行自花授粉從而產(chǎn)生T₂代，并且重復這個過程從而產(chǎn)生T₃代。使用T₃植物的子代測試來鑒定純合的(轉(zhuǎn)化的)家族。將轉(zhuǎn)殖項5307轉(zhuǎn)化的NP2460近交體與其他良種近交系進行雜交從而產(chǎn)生雜交體，這些雜交體被用于進一步的研究。

實例2.通過TAQMAN PCR檢測轉(zhuǎn)殖項5307

TAQMAN分析基本如Ingham等描述的(Biotechniques(生物技術(shù))，31:132-140,2001)來進行，將其通過引用結(jié)合在此。簡言之，基本上根據(jù)生產(chǎn)者的說明(除了所有步驟在1.2ml的96孔板中進行以外)使用基因組DNA提取試劑盒(Gentra Systems,Minneapolis,MN)將基因組DNA從轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米植物的葉子里分離出來。將干燥的DNA小粒再次懸浮在TE緩沖液(10Mm Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA)中。

TAQMAN PCR反應在96孔板中進行。對于內(nèi)源性玉米基因?qū)φ?，設(shè)計了對玉蜀黍醇脫氫酶(Adh)基因特異的引物和探針(Genbank登錄號AF044295)。普通技術(shù)人員會認識到其他玉米基因可用作內(nèi)源控制?？梢詫⒎磻嗦愤M行從而同時擴增FR8a與Adh或PMI與Adh。對于每個樣品而言，通過將20μL提取的基因組DNA與35μL 2x TAQMAN Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)合并而產(chǎn)生母體混合物(添加引物至各自的最終濃度為900nM、添加探針至各自的最終濃度為100nM，以及添加水至最終體積為70μL)。在96孔擴增板中將這個混合物分配成三個重復(每個20μL)并用光學透明的熱封膜進行密封(Marsh Bio Products)。在ABI Prime 7700儀器中運行PCR，使用以下擴增參數(shù)：在50℃下2分鐘以及在95℃下10分鐘，之后在95℃下15秒35個循環(huán)以及60℃下1分鐘。

TAQMAN分析的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)殖項5307具有FR8a基因的一個拷貝以及PMI基因的一個拷貝。

所使用的適合的引物/探針序列組合的實例是：

引物名稱 引物序列SEQ IDNO:

FR8a-正向 5'-TACGAGAGCTGGGTGAACTTCA-3 SEQ ID NO:73

FR8a-反向 5'-CGATCAGGTCCAGCACGG-3' SEQ ID NO:74

FR8a-探針 5'-CCGCTACCGCCGCGAGATGA-3' SEQ ID NO:75

(5'標志物＝FAM，3'標志物＝TAMRA)

PMI-正向 5'-CCGGGTGAATCAGCGTTT-3'SEQ ID NO:76

PMI-反向 5'-GCCGTGGCCTTTGACAGT-3'SEQ ID NO:77

PMI-探針 5'-TGCCGCCAACGAATCACCGG-3' SEQ ID NO:78

(5'標記＝FAM，3'標記＝TAMRA)

ZmADH-267正向 5'-GAACGTGTGTTGGGTTTGCAT-3' SEQ ID NO:79

ZmADH-337反向 5'-TCCAGCAATCCTTGCACCTT-3' SEQ ID NO:80

ZmADH-316探針 5'-TGCAGCCTAACCATGCGCAGGGTA-3' SEQ ID NO:81

(5'標記＝TET，3'標記＝TAMRA)

PM1271、MIC5307a以及MIC5307b TAQMAN測定法被設(shè)計成一種轉(zhuǎn)殖項特異性測定法，該特異性測定法涵蓋該3'連接序列。

所使用的適合的引物/探針序列組合的實例是：

引物名稱 引物序列SEQ ID NO:

PM1277-正向 5'-GCCGTATCCGCAATGTGTTA-3' SEQ ID NO:82

PM1277-反向 5'-GGCCCAGGGAAGAGGGTATAT-3' SEQ ID NO:83

PM1277-探針 5'-AAGTTGTCTAAGCGTCAAT-3' SEQ ID NO:84

(5'標記＝TET，3'標記＝TAMRA)

MIC5307a-正向 5'-TGTCTAAGCGTCAATTTGTTTACACC-3' SEQ ID NO:82

MIC5307a-反向 5'-TTTGCCAGTGGGCCCA-3' SEQ ID NO:83

MIC5307a-探針 5'-ACAATATACCCTCTTCCCTGGGCCAGG-3' SEQ ID NO:84

(5'標記＝TET，3'標記＝TAMRA)

MIC5307b-正向 5'-GCCGTATCCGCAATGTGTTA-3' SEQ ID NO:82

MIC5307b-反向 5'-AAGTTGTCTAAGCGTCAAT-3' SEQ ID NO:83

MIC5307b-探針 5'-GGCCCAGGGAAGAGGGTATAT-3' SEQ ID NO:84

(5'標志物＝TET，3'標志物＝TAMRA)

實例3.通過Southern印跡檢測轉(zhuǎn)殖項5307

基本上用Thomas等的方法(Theor.Appl.Genet.86:173-180,1993)(通過引用結(jié)合在此)將用于Southern分析的基因組DNA從代表轉(zhuǎn)殖項5307的回交6(BC6)代的10棵植物的匯集的葉組織中分離出來。用于DNA分離的所有植物用TAQMAN PCR(如實例2所描述的)單獨地進行分析以確認存在FR8a基因和PMI基因的單一拷貝。對于陰性分離子的控制，從代表轉(zhuǎn)殖項5307的BC4代5個植物的匯集的葉組織中分離出DNA。使用TAQMAN PCR對這些陰性分離子植物單獨地進行分析，并且這些測定對于FR8a基因以及PMI基因的存在是陰性的，但是如所期望的，對于內(nèi)部對照(內(nèi)源玉米Adh基因)測定是陽性的。

使用常規(guī)的分子生物學技術(shù)進行Southern分析。用Smal和Pmel限制性酶對基因組DNA(7.5μg)進行雙重消化，這些限制性酶在該轉(zhuǎn)殖項5307T-DNA插入序列(來自質(zhì)粒pSYN12274)中具有單個的識別位點(圖1)。這個途徑允許確定這些元件的拷貝數(shù)目，對應于用于每個Southern分析的特異探針，這些元件已經(jīng)被結(jié)合進轉(zhuǎn)殖項5307中。這導致在轉(zhuǎn)殖項5307中存在一個雜交帶/拷貝的元件。這導致在轉(zhuǎn)殖項5307中對于每拷貝元件存在一個雜交帶。在瓊脂糖凝膠電泳以及堿性轉(zhuǎn)移到膜上之后，使用元件特異性全長PCR產(chǎn)生的探針來進行雜交。用于該Southern印跡中的全長探針包括SEQ ID NO:7中列出的核苷酸序列。這些探針使用Rediprime^TM II系統(tǒng)(Amersham Biosciences,Cat.No.RPN 1633)通過隨機引物法用³²P進行標記。

使用以下的高嚴謹雜交條件：將1-2百萬cpm/ml加入到PerfectHyb(Sigma)中，該PerfectHyb添加有預熱到65℃的100μg/ml的小牛胸腺DNA(Invitrogen)。在與上述相同的溶液中進行與雜交，在相同的溫度下過夜或持續(xù)至少1小時。在65℃下雜交3小時，隨后在65℃下在2X SSC、0.1％SDS中洗滌2次，每次20分鐘，并且在65℃下在0.1X SSC、0.1％SDS中洗滌2次，每次20分鐘。

在每個Southern印跡中包含了三個對照樣品：(1)來自陰性(非轉(zhuǎn)化的)分離子的DNA，用于鑒定任何內(nèi)源性的可能與元件特異的探針交叉雜交的玉蜀黍序列；(2)來自陰性分離子的DNA，在該分離子中引入了一定量的Smal-Pmel消化的pSYN12274(該消化的量與基于探針長度的一個拷貝數(shù)相等)，以證明本實驗在檢測在玉蜀黍基因組之內(nèi)的單個基因拷貝中的敏感性；以及(3)Smal-Pmel消化的pSYN12274質(zhì)粒，它等于基于探針長度的一個拷貝數(shù)，以作為雜交的一個陽性對照并且證明本實驗的敏感性。

這些雜交數(shù)據(jù)提供了證實的證據(jù)以支持TAQMAN PCR分析，即轉(zhuǎn)殖項5307包含單拷貝的FR8a和PMI基因，以及該5307轉(zhuǎn)殖項不包含pSYN12274中存在的任何載體主鏈序列。如對于FR8a和PMI探針兩者所期望的，該Smal-Pmel消化導致了具有正確大小的單個雜交帶，證明每個基因的單個拷貝存在于該5307轉(zhuǎn)殖項中。此外，對于主鏈探針，雜交的缺乏證明在轉(zhuǎn)化過程期間沒有任何pSYN12274載體主鏈序列被整合到轉(zhuǎn)殖項5307中。

實例4.T-DNA插入片段測序

存在于轉(zhuǎn)殖項5307中的整個轉(zhuǎn)基因DNA插入片段的核苷酸序列被確定用來證明該插入片段的總完整性、功能性元件的連續(xù)性以及用來檢測任何單獨的堿基對改變。從由BC5代得到的DNA進行PCR擴增轉(zhuǎn)殖項5307插入片段(作為兩個單獨的重疊片段)。使用與位于該轉(zhuǎn)殖項5307插入片段側(cè)翼的植物基因組序列同源的一種多核苷酸引物以及與該FR8a基因同源的一個多核苷酸引物來擴增每一片段。為了產(chǎn)生5'片段，將與該5'側(cè)翼序列同源的第一多核苷酸引物(SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:15)，與同該插入的DNA該FR8a基因同源的第二核苷酸引物(SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:41)、泛素啟動子(SEQ ID NO:42至SEQ ID NO:53)或PMI基因(SEQ ID NO:54至SEQ ID NO:60)相結(jié)合。為了產(chǎn)生3'片段，將與該3'側(cè)翼序列同源的第一多核苷酸引物(SEQ ID NO:69至SEQ ID NO:72)與同該FR8a基因內(nèi)的該插入的DNA同源的第二核苷酸引物(SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:17)、泛素啟動子(SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:26)或PMI基因(SEQ ID NO:27至SEQ ID NO:32)相結(jié)合。

使用擴展高保真PCR系統(tǒng)(Roche,Cat.No.1732650)以及以下的擴增參數(shù)來進行PCR擴增：在94℃下1個循環(huán)2分鐘，隨后在94℃下15秒在55-65℃下30秒10個循環(huán)，以及在68℃下5分鐘，隨后94℃下15秒在55-65℃下30秒20個循環(huán)，并且在72℃下5分鐘+5秒/循環(huán)，隨后在72℃下7分鐘1個循環(huán)。

使用SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:41從該PCR擴增得到的擴增子包括該5'連接序列(SEQ ID NO:1)。使用SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:72從該PCR擴增得到的擴增子包括該3'連接序列(SEQ ID NO:2)。將每個測序片段單獨地克隆到載體(Invitrogen,Cat.No.K4700-20)中并且對于每個片段用三個分開的克隆進行鑒定和測序。使用ABI1.1或Big Dye 3.1 dGTP(對于GC豐富的模板)化學法使用ABI3730XL分析儀進行測序。使用來自華盛頓大學(University of Washington)的Phred、Phrap和Consed包進行序列分析，并且該序列分析是在每10,000個堿基中少于1個的誤差率下進行的(E wing and Green,1998)。通過結(jié)合來自6個單獨的克隆的序列數(shù)據(jù)(每個測序片段3個)以產(chǎn)生該轉(zhuǎn)殖項5307插入片段的共有序列從而確定最終的共有序列。為了進一步確認該轉(zhuǎn)殖項5307插入片段與該pSYN12274質(zhì)粒之間任何單獨的堿基對差異，對于其中在初始共有序列中看到的堿基對差異的任何區(qū)域特異的小(約300-500bp)PCR產(chǎn)物，使用上述相同的方法進行擴增。對于該轉(zhuǎn)殖項5307插入片段中所有推定的堿基對差異，直接PCR產(chǎn)物測序在所討論的所有堿基對處導致單一的清楚的峰，這表明這些差異可能存在于該轉(zhuǎn)殖項5307插入片段中。采用ClustalW程序結(jié)合下列參數(shù)進行比對：記分矩陣(scoring matrix)blosum55、空位開放罰分(gap opening penalty)15、空位延伸罰分(gap extension penalty)6.66(Thompson et al,1994,Nucleic Acids Research,22,4673-4680)。

該轉(zhuǎn)殖項5307T-DNA插入片段的共同序列數(shù)據(jù)證明，該插入片段的總完整性以及該插入片段中功能性的元件的連續(xù)性已經(jīng)如pSYNl2274中所預期的那樣被保持了。

實例5.側(cè)翼DNA序列的分析

使用OmniPlex^TM技術(shù)(基本上如Kamberov等人(Proceedings of SPIE,Tools for Molecular Analysis and High-Throughput Screening,4626:1-12,2002)中所述，該文件通過引用結(jié)合在此)得到位于被插入到轉(zhuǎn)殖項5307的玉米基因組中的同源DNA側(cè)翼的玉米基因組DNA序列。

5’和3'側(cè)翼序列和連接序列用標準PCR過程來證實。使用SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:14中所列出的第一多核苷酸引物與SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:41中所列出的第二多核苷酸引物相結(jié)合來證實該5'側(cè)翼以及連接序列。使用SEQ ID NO:69至SEQ ID NO:72中所列出的第一多核苷酸引物與SEQ ID NO:27至SEQ ID NO:32中所列出的第二多核苷酸引物相結(jié)合來證實該3'側(cè)翼以及連接序列。普通技術(shù)人員應認識到其他引物序列也可用于證實該側(cè)翼序列和連接序列。

被發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)殖項5307插入片段的右側(cè)邊緣(5'側(cè)翼序列)上是示于SEQ ID NO:5中的玉米基因組序列側(cè)翼，并且其左側(cè)邊緣(3'側(cè)翼序列)上是示于SEQ ID NO:6中的玉米基因組序列側(cè)翼。該5'連接序列列出在SEQ ID NO:1中。該3'連接序列列出在SEQ ID NO:2中。pSYN12274載體插入的整合位點被包括在SEQ ID NO:103或它的反向互補物SEQ ID NO:110之內(nèi)，這取決于所使用的核酸的方向。

實例6.通過ELISA檢測轉(zhuǎn)殖項5307蛋白

為了表征轉(zhuǎn)殖項5307植物中FR8a(活性殺蟲要素)以及磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)(選擇性標記)蛋白的表達范圍，在數(shù)個植物組織中通過ELISA確定了FR8a蛋白和PMI的濃度。在轉(zhuǎn)殖項5307中對于轉(zhuǎn)基因而言這些雜交體是半合子的，而對于這些轉(zhuǎn)基因而言該近交體是純合的。

通過使用或者咖啡研磨器、摻和器、Grindomix^TM研磨器(Brinkmann Instruments；Westbury,NY,USA)、帶有研棒的研缽或碾磨機、或這些裝置的一種組合之一進行處理將整個植物以及單獨的部分(除了花粉以外)磨成細粉末。所有處理都是在干冰亦或液氮的存在下進行的。將樣品良好地混合以確保均勻。保留整個植物組織樣品或代表性的子樣品用于分析，這允許足夠的樣品尺寸用來歸檔保存保留的植物組織樣品。確定每個樣品的百分比干重并且將處理過的樣品存儲在約-80℃下直至冷凍干燥。

提取新鮮的組織(除了花粉和青貯飼料之外)以及全植物樣品。對于每個被分析的樣品，將1.0g等分部分的粉末化的新鮮材料稱重加入15ml的聚丙烯管中，懸浮在3ml的提取緩沖劑[50mM CAPS、0.1M NaCl、2mM EDTA、1mM二硫蘇糖醇、1mM 4-(l-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽、1mM亮抑酶肽、pH 10]中，并且使用一臺均質(zhì)器(Tomtek；Hamden,CT,USA)進行提取。在4℃下在10,000xg下離心15分鐘之后，使用上清液通過ELISA進行FR8a和PMI分析。在用碘乙酰胺進行處理(如Hill和Straka (1988)所描述的)之后，使用BCATM蛋白測定試劑(Pierce；Rockford,IL,USA)對提取物中的總蛋白進行定量。

通過將花粉1:30(w/v)懸浮在提取緩沖劑中來制備花粉提取物。在冰上30分鐘之后，通過在約15,000psi下3次通過French高壓細胞破碎儀來破碎這些花粉懸浮液，隨后在4℃下在14,000x g下離心5分鐘。如下所述通過ELISA在這些上清液上進行Cry3A055和PMI分析。如上所述對總蛋白進行定量。

通過將青貯飼料1:25(w/v)懸浮在2X提取緩沖劑中來制備青貯飼料提取物。在冰上30分鐘之后，使用一臺Brinkmann Polytron均質(zhì)器(Brinkmann；Westbury,NY,USA)來提取青貯飼料懸浮液。在4℃下在10,000x g下離心15分鐘之后，使用上清液通過ELISA進行FR8a和PMI分析。如上所述對總蛋白進行定量。

FR8a定量

使用免疫親和純化的單克隆抗-mCry3A抗體以及免疫親和純化的多克隆抗-Cry1Ab抗體通過ELISA(Tijssen,1985)針對FR8a定量分析如上所述制備的提取物?；谖挥跇藴是€的線性部分上的純參考蛋白的最低濃度估計雙夾心ELISA的定量的下限、在無背景干擾下可以被分析的對照提取物的最大體積、以及該等分部分代表的相應的該樣品的重量。

在從所有轉(zhuǎn)殖項5307得到的植物組織中檢測到可定量水平的FR8a蛋白。在大多數(shù)情況下，這些結(jié)果被表示為5個重復組織樣品的平均值。對照樣品水平在所有組織的定量限度之下。

貫穿所有生長階段，在葉、根、以及花粉中所測量的平均FR8a水平的范圍對應地為從約18-29μg/g濕重(77-113μg/g干重)，約1.8-4.1μg/g濕重(22-41μg/g干重)以及約<LOD-0.15μg/g濕重(<LOD-0.15μg/g干重)，[檢測限(LOD)＝0.08μg/g濕重，0.08μg/g干重]。

在各時間點處對于每種組織在近交和雜交基因型中的FR8a的水平總體上是類似的。

PMI定量

使用對于PMI具有親和性的蛋白A純化的多克隆兔抗體和免疫親和純化的多克隆山羊抗體通過ELISA(Tjissen,1985)對于PMI來定量分析如上所述制備的提取物?；谖挥谠摌藴是€的線性部分上的純參考蛋白的最低濃度估計雙夾心ELISA的定量的下限、在無背景干擾下可以被分析的對照提取物的最大體積、以及該等分部分代表的相應的該樣品的重量。

在從被分析的轉(zhuǎn)殖項5307得到的植物組織的大多數(shù)中檢測到PMI蛋白。在大多數(shù)情況下，這些結(jié)果被表示為5個重復組織樣品的平均值。對于所有階段和組織，對照樣品水平在定量限度之下。

貫穿所有植物生長階段，在葉、根、以及花粉中所測量的平均PMI水平范圍對應地為從約0.4至約0.6μg/g濕重(1.5-2.3μg/g干重)，約0.1-0.2μg/g濕重(0.9-1.5μg/g干重)以及約16.7-30.6μg/g濕重(17.1-31.1μg/g干重)，[檢測限(LOD)＝0.08μg/g濕重(鮮重fresh wt.)，0.08μg/g干重]。

在各時間點處對于每種組織在近交和雜交基因型中PMI的水平總體上是類似的。

實例7.轉(zhuǎn)殖項5307的大田效果

西方玉米根蟲和北方玉米根蟲

在美國12個地點針對抗西方玉米根蟲以及北方玉米根蟲的效果來測試轉(zhuǎn)殖項5307植物。在加入或不加入殺蟲性種子處理下對轉(zhuǎn)殖項5307進行測試。對照組包括用兩種不同比率的和一種未處理的檢驗來處理的種子。這些處理包括在中心(以隨機化完全區(qū)塊方式進行設(shè)計)處間隔30"的2個17.5-20英尺行的4個重復。隨機地選出10個植物/每個處理并且使用0-3尺度針對效果進行評估，其中0＝無采食損害(可以給出的最低等級)；1＝一個節(jié)點(根的圓周)，或完整的節(jié)點的等效物，在該莖的約2英寸內(nèi)被吃掉(在第7節(jié)點上的土壤線)；2＝被吃掉兩個完整的節(jié)點；3＝被吃掉3個或更多的節(jié)點(可以給出的最高等級)。在完全被吃的節(jié)點之間中的損害被記錄為節(jié)點損失的百分比，即1.50＝1¹/₂個節(jié)點被吃掉，0.25＝一個節(jié)點的1/4被吃掉。

轉(zhuǎn)殖項5307效果與用于隴中的商業(yè)的顆粒狀的殺蟲劑標準品進行比較。該實驗設(shè)計是如上所述。表2中的結(jié)果證明轉(zhuǎn)殖項5307的效果在保護植物免受玉米根蟲采食損害方面比得上商業(yè)的標準品。

表2.轉(zhuǎn)殖項5307與用于隴中的商業(yè)殺蟲劑的效果的比較。

墨西哥玉米根蟲

在德克薩斯的兩個地點針對對墨西哥玉米根蟲的抗性來評估轉(zhuǎn)殖項5307植物。實驗設(shè)計基本上與上述相同。

清楚的速率響應是明顯的。示于表3中的結(jié)果證明轉(zhuǎn)殖項5307的效果在保護植物免受墨西哥玉米根蟲采食損害方面比得上商業(yè)的標準品。

表3.轉(zhuǎn)殖項5307的效果與用于隴中的抗墨西哥玉米根蟲的商業(yè)的殺蟲劑進行比較

在本說明書中提到的所有公開文件以及專利申請對于本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的技術(shù)水平是指示性的。所有公開文獻和專利申請均通過引用結(jié)合在此，其程度如同每個單獨的公開文獻或?qū)＠暾埍淮_切地并單獨地指明通過引用而被結(jié)合。

雖然為了清楚理解的目的已經(jīng)通過說明和舉例的方式在一定詳細程度上描述了以上發(fā)明，顯然的是在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以進行某些改變和變更。

實例8.在玉蜀黍中用于靶向整合的轉(zhuǎn)殖項5307插入位點的用途

在SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中披露的轉(zhuǎn)殖項5307側(cè)翼序列被用來檢索玉米基因組數(shù)據(jù)庫。與兩個側(cè)翼序列相同的匹配被發(fā)現(xiàn)于染色體5的BAC克隆ZMMBBc0077H14上(NCBI登錄號AC202955)。更具體地說，該轉(zhuǎn)殖項5307插入片段位于5'標記(在此稱為公開的分子標記umcl475(SEQ ID No:104))與3'標記(在此稱為公開的分子標記uazl90(SEQ ID No:107))之間。使用這個信息，可以確定的是被插入到轉(zhuǎn)殖項5307中的該異源DNA替換了玉米基因組DNA的38個核苷酸，它位于5'側(cè)翼序列(缺失的序列的上游)與3'側(cè)翼序列(缺失的序列的下游)之間。用于鑒定分子標記uazl90有用的引物被列出為SEQ ID NO:108和109。用于鑒定分子標記umcl475有用的引物被列出為SEQ ID NO:105和106。為了精細繪制插入位點的目的，進一步開發(fā)了多種標記。這些標記被命名為SMl108C、SM0584B、SM0377D以及SM0501D。用于檢測這些標記有用的引物和探針如下：SMl108C(SEQ ID NO:91至SEQ ID NO:93)、SM0584B(SEQ ID NO:94至SEQ ID:96)、SM0377D(SEQ ID NO:97至SEQ ID NO:99)、以及SM0501D(SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:102)。

轉(zhuǎn)殖項5307的轉(zhuǎn)基因在大田條件下經(jīng)過幾代的一致農(nóng)藝學性能說明這些在轉(zhuǎn)殖項5307插入位點周圍的被鑒定的區(qū)域為其他感興趣的轉(zhuǎn)基因基因的靶向整合提供了良好的基因組位置。這種靶向整合克服了所謂的“位置效應”的問題、以及當轉(zhuǎn)基因整合進入宿主時在基因組中產(chǎn)生突變的風險。這種靶整合的其他的優(yōu)點包括但不限于，減少在獲得轉(zhuǎn)基因植物(該植物展示所希望水平的轉(zhuǎn)基因表達而不同樣展示由該轉(zhuǎn)基因的不經(jīng)意的插入至宿主基因組中的重要的位置導致的異常)之前必須篩選和測試大量數(shù)目的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)殖項。另外，這種靶向整合允許堆疊轉(zhuǎn)基因使得具有兩種基因的良種植物系的育種更有效。

使用以上披露的傳授內(nèi)容，普通技術(shù)人員能夠使用本領(lǐng)域已知的方法來將轉(zhuǎn)基因靶向到與轉(zhuǎn)殖項5307中相同的插入位點或靶向到緊密接近于5307中的插入位點的一個位點。一種這樣的方法披露于美國專利申請公開號20060253918中，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。簡言之，位于插入位點5'側(cè)翼的高達20Kb的基因組序列(SEQ ID NO:5)和位于插入位點3'側(cè)翼的高達20Kb的基因組序列(SEQ ID NO:6)也被用來使其位于旨在通過同源重組插入染色體5上的基因組位置中的一個或多個感興趣的基因的側(cè)翼。這些序列可進一步被安排有T-DNA邊緣重復側(cè)翼，如左側(cè)邊緣(LB)及右側(cè)邊緣(RB)的重復序列以及其他加強序列以增強T-DNA的遞送效率。一個或多個感興趣的基因能像在轉(zhuǎn)殖項5307插入位點處完全一樣地放置或能被放置在轉(zhuǎn)殖項5307插入位點周圍的20Kb區(qū)域之內(nèi)的任何位置，以賦予一致水平的轉(zhuǎn)基因表達而不對該植物造成有害的影響。包含一個或多個感興趣的基因及側(cè)翼序列的DNA載體能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾個方法之一(包括但不限于土壤桿菌屬介導的轉(zhuǎn)化)被遞送至植物細胞中。將DNA載體插入至轉(zhuǎn)殖項5307靶位點能通過幾種方法之一(包括但不限于共表達或重組增強基因的上調(diào)或內(nèi)源重組抑制基因的下調(diào))而被進一步加強。此外，本領(lǐng)域中已知在基因組中分裂特異的序列能被用于增加同源重組的頻率，因此插入至轉(zhuǎn)殖項5307插入位點及其側(cè)翼區(qū)域能通過自然或設(shè)計的序列特異的內(nèi)切核酸酶的表達而加強以分裂這些序列。

這種技術(shù)的一個實例被證明于Shukla等人(Nature vol.459,21May2009)中?；谠谠撃繕酥参飪?nèi)使用同源序列，為了將異源序列靶向特異的基因座，這種方法使用了鋅指核酸酶。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以將該轉(zhuǎn)殖項5307插入片段用于5'標記(在此命名為公開的分子標記umcl475(SEQ ID No:104))與3'標記(在此命名為公開的分子標記uazl90(SEQ ID No:107))之間從而產(chǎn)生用于靶向插入的基因座。

實例9.轉(zhuǎn)殖項5307插入位點及側(cè)翼序列用于穩(wěn)定基因表達的用途

當在玉蜀黍和其他農(nóng)作物的其他基因組位置中作為轉(zhuǎn)基因被插入時，位于轉(zhuǎn)殖項5307插入位點側(cè)翼的基因組序列也可被用來穩(wěn)定其他的一個或多個或感興趣的基因的表達。具體而言，位于插入位點5'側(cè)翼的高達20Kb的基因組序列(SEQ ID NO:5)和位于插入位點3'側(cè)翼的高達20Kb的基因組序列(SEQ ID NO:6)也被使其位于旨在插入植物基因組的一個或多個感興趣的基因的側(cè)翼。這些序列可進一步安排有T-DNA邊緣重復側(cè)翼，如左側(cè)邊緣(LB)及右側(cè)邊緣(RB)的重復序列以及其他的加強序列以增強T-DNA的遞送效率。一個或多個感興趣的基因能像在轉(zhuǎn)殖項5307插入位點處完全一樣地放置或能被放置在轉(zhuǎn)殖項5307插入位點周圍的20Kb區(qū)域之內(nèi)的任何位置，以賦予一致水平的轉(zhuǎn)基因表達。包含一個或多個感興趣的基因以及轉(zhuǎn)殖項5307插入位點側(cè)翼序列的DNA載體能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾個方法中的一種方法(包含但不限于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、基因槍轟擊以及土壤桿菌屬介導的轉(zhuǎn)化)被遞送至植物細胞中。被遞送的DNA能夠被隨機整合至植物基因組中或也能作為獨立分離的遺傳單位(例如人工染色體或微型染色體)的一部分出現(xiàn)。包含一個或多個感興趣的基因的DNA載體及轉(zhuǎn)殖項5307 插入位點側(cè)翼序列也能被遞送至植物細胞中。因此，通過用位于基因組序列側(cè)翼的轉(zhuǎn)殖項5307插入位點圍繞一個或多個感興趣的基因，這類基因的表達在轉(zhuǎn)基因宿主植物(例如雙子葉植物或單子葉植物，像玉米)中得到穩(wěn)定。

保藏

申請人已經(jīng)在2008年10月15日將以上披露的轉(zhuǎn)殖項5307的玉米種子，根據(jù)布達佩斯條約，保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，地址為10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110-2209，ATCC登記號為PTA-9561。此保藏將在該保藏機構(gòu)保存30年，或在最后一次要求之后的5年，或本專利的有效期內(nèi)，以更長的為準，且此時期內(nèi)如果必須將被替換。諸位申請人對從ATCC獲得所保藏的物質(zhì)沒有限制；然而，諸位申請人無權(quán)免除法律在轉(zhuǎn)移生物材料或其在商業(yè)上的運輸方面所施加的任何限制。

在本說明書中所引用的所有公開文獻和已公開的專利文件均通過引用結(jié)合在此，其程度如同每個單獨的公開文獻或?qū)＠募淮_切地并單獨地指明通過引用而結(jié)合。

本發(fā)明包括：

1.轉(zhuǎn)基因玉米植物的種子，該轉(zhuǎn)基因玉米植物包括昆蟲控制轉(zhuǎn)殖項(event)5307，所述種子的實例以ATCC登錄號PTA-9561進行了保藏。

2.轉(zhuǎn)基因玉米(corn)植物、細胞以及它的組織，包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。

3.核酸分子，包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。

4.根據(jù)項3所述的核酸分子，其中該核酸分子被包含在保藏在ATCC處登錄號PTA-9561下的玉米種子中。

5.擴增子，包括如項3或4所述的核酸分子。

6.多核苷酸引物對，包括第一多核苷酸引物以及第二多核苷酸引物，在樣品中玉米轉(zhuǎn)殖項5307DNA模板的存在下它們一起起作用從而產(chǎn)生對于玉米轉(zhuǎn)殖項5307是診斷性的擴增子，其中該第一引物序列是位于被插入到玉米轉(zhuǎn)殖項5307的玉米植物基因組中的異源DNA序列的插入點側(cè)翼的玉米植物基因組或與其互補，并且該第二多核苷酸引物序列是被插入到該玉米轉(zhuǎn)殖項5307的玉米植物基因組中的異源DNA序列或與其互補。

7.根據(jù)項6所述的多核苷酸引物對，其中該第一多核苷酸引物包含來自如SEQ ID NO:5中所列出的位置1-1348的至少10個連續(xù)核苷酸，或它們的互補物。

8.根據(jù)項7所述的多核苷酸引物對，其中該第一多核苷酸引物包括選自下述組成的組的核苷酸序列：SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:14，或它們的互補物。

9.根據(jù)項6所述的多核苷酸引物對，其中該第一多核苷酸引物包含來自如SEQ ID NO:6中所列出的位置1-1093的至少10個連續(xù)核苷酸，或它們的互補物。

10.根據(jù)項9所述的多核苷酸引物對，其中該第一多核苷酸引物包括選自下述組成的組的核苷酸序列：SEQ ID NO:69至SEQ ID NO:72，或它們的互補物。

11.根據(jù)項6所述的多核苷酸引物對，其中該第二多核苷酸引物包含來自如SEQ ID NO:7中所列出的位置1-6206的至少10個連續(xù)核苷酸，或它們的互補物。

12.根據(jù)項11所述的多核苷酸引物對，其中該第二多核苷酸引物包括選自下述組成的組的核苷酸序列：SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:68，以及它們的互補物。

13.在包含玉米核酸的樣品中檢測對于轉(zhuǎn)殖項5307獨特的核酸分子的存在的方法，該方法包含：

a)從玉米中分離核酸分子；

b)將該核酸分子與核酸引物序列對SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:69至SEQ ID NO:72與SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:68，或它們的互補物相組合；

c)進行核酸擴增反應，這產(chǎn)生擴增子；以及

d)對該擴增子進行檢測。

14.在包含玉米核酸的樣品中玉米核酸的樣品中檢測對于轉(zhuǎn)殖項5307獨特的核酸分子的存在的方法，該方法包含：

e)從玉米中分離核酸分子；

f)將該核酸分子與核酸引物序列對SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:89，分別地連同它們的探針序列SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:87以及SEQ ID NO:90一起進行組合；

g)進行核酸擴增反應，這產(chǎn)生包含該探針的擴增子；以及

h)對該探針進行檢測。

15.DNA分子，包括由項13所述的方法生產(chǎn)的擴增子。

16.在包含玉米核酸的樣品中證實對于轉(zhuǎn)殖項5307獨特的核酸分子的不存在的方法，該方法包含：

a)從玉米中分離基因組DNA；

b)將該核酸分子與核酸引物序列對SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:69至SEQ ID NO:72與SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:68，或它們的互補物，連同作為陽性對照的玉米天然基因核酸引物對一起進行組合；

c)進行核酸擴增反應，這不產(chǎn)生對于轉(zhuǎn)殖項5307特異性的擴增子，并且產(chǎn)生對該玉米天然基因陽性對照特異性的擴增子；以及

d)對該玉米天然基因陽性對照特異性的擴增子進行檢測。

17.從轉(zhuǎn)殖項5307玉米植物、組織、種子或細胞中得到的生物樣品，其中該樣品包括核苷酸序列，該核苷酸序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或與其互補。

18.如項17所述的生物樣品，其中該序列用核酸擴增或核酸雜交方法在該提取物中是可檢測的。

19.如項17所述的生物樣品，其中該樣品選自由下列各項組成的組：玉米面粉、玉米粗粉、玉米糖漿、玉米油、玉米淀粉，以及全部或部分地包含玉米副產(chǎn)物的制造的谷類。

20.從轉(zhuǎn)殖項5307玉米植物、種子、組織、或細胞的生物樣品中得到的提取物，所述提取物包括與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2互補的核苷酸序列。

21.如項20所述的提取物，其中該序列用核酸擴增或核酸雜交方法在該提取物中是可檢測的。

22.如項20所述的提取物，其中該樣品選自由下列各項組成的組：玉米面粉、玉米粗粉、玉米糖漿、玉米油、玉米淀粉，以及全部或部分地包含玉米副產(chǎn)物的制造的谷類。

23.一種培育包含昆蟲控制性狀的玉米植物的方法，該性狀被遺傳連接到核酸標記或其互補物上，其中所述標記核酸分子是使用SEQ ID NO:91至SEQ ID NO:102或它們的互補物進行鑒定的。

24.對于在玉米中的抗昆蟲性狀的標記輔助選擇的方法，包括：

a)從玉米中分離核酸分子；

b)將該核酸分子與核酸引物序列對和探針SEQ ID NO:91至SEQ ID NO:102或它們的互補物相組合；

c)進行核酸擴增反應，這產(chǎn)生擴增子；

d)對該擴增子進行檢測；以及

e)為了培育抗昆蟲玉米的目的選擇植物。

25.生產(chǎn)對鞘翅目昆蟲具有抗性的雜交玉米植物的方法，包括以下步驟：

a)播種第一近交玉米植物的種子，所述種子的一個實例被保藏為ATCC登錄號PTA-9561，以及具有與該第一近交玉米植物不同基因型的第二近交玉米植物的種子；

b)培養(yǎng)所述第一和第二玉米植物直至產(chǎn)生花；

c)將在該第一亦或該第二近交玉米系開花(flowing)的時間產(chǎn)生的所述花去雄；

d)用該去雄近交植物的花粉將未去雄的植物進行授粉導致雜交玉米；以及

e)收獲所產(chǎn)生的雜交玉米種子。

26.用如項25所述的方法生產(chǎn)的雜交玉米種子。

27.通過培育如項26所述的雜交玉米種子生產(chǎn)的雜交玉米植物。

28.檢測樣品中存在相應于5307玉米轉(zhuǎn)殖項的核酸分子的方法，該方法包括：

a)將樣品與探針進行接觸，該探針在高嚴謹條件下與來自玉米轉(zhuǎn)殖項5307的基因組DNA雜交并且在高嚴謹條件下不與對照玉米植物的DNA雜交；

(b)使該樣品以及探針經(jīng)受高嚴謹雜交條件；以及

(c)檢測該探針與該DNA的雜交。

29.用于檢測生物樣品中存在玉米轉(zhuǎn)殖項5307核酸的試劑盒，該試劑盒包括至少一種DNA分子，該DNA分子包括足夠長度的連續(xù)核苷酸，該DNA分子是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或與其互補，該DNA分子作為對于玉米轉(zhuǎn)殖項5307具有特異性的DNA引物或探針而起作用。

30.玉米染色體靶位點，該位點位于染色體5上在umcl475分子標記與uazl90分子之間，其中該靶位點包括異源核酸。

31.玉米染色體靶位點，該位點位于染色體5上在SEQ ID NO:103的核苷酸1與核苷酸161,752之間，其中該靶位點包括異源核酸。

32.根據(jù)項30或31所述的玉蜀黍(玉米)染色體靶位點，其中所述靶位點位于SEQ ID NO:103的核苷酸75,908和75,946之間。

33.根據(jù)項30或31所述的玉蜀黍染色體靶位點，其中所述靶位點的5'側(cè)翼是SEQ ID NO:103的核苷酸55,980至75,908，并且3'側(cè)翼是SEQ ID NO:103的核苷酸75,946至95,946。

34.制備轉(zhuǎn)基因玉米植物的方法，包括將異源核酸插入在染色體5上的位置處，該位置位于umcl475分子標記與uazl90分子標記之間。

35.根據(jù)項34所述的方法，其中所述異源核酸被插入到染色體5上，位于在SEQ ID NO:103的核苷酸75,908與75,946之間。

36.根據(jù)項34所述的方法，其中所述被插入的異源核酸的5'側(cè)翼是SEQ ID NO:103的核苷酸5,454至25,454，并且3'側(cè)翼是SEQ ID NO:103的核苷酸25,513至45,513。