本申請涉及一種白樺脂酸衍生物及其藥學上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、同位素標記物、溶劑化物、多晶形物或前藥，包含上述物質(zhì)的藥物組合物和用于治療抗腫瘤疾病的用途，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：樺木酸(或白樺脂酸，betulinicacid)為羽扇豆烷型五環(huán)三萜類化合物，廣泛分布于鼠李科、桃金娘科、樺木科等多種植物中，但普遍含量較低。由于樺木酸的母環(huán)結(jié)構(gòu)較大，使得其分子極性較小，脂溶性較大。因此，樺木酸在水中的溶解度較小，易溶于乙醚，氯仿、乙醇等有機溶劑。樺木酸對黑素瘤細胞具有極強的選擇性細胞毒性(PishaE,ChaiH,LeeIS,etal.Discoveryofbetulinicacidasaselectiveinhibitorofhumanmelanomathatfunctionsbyinductionofapoptosis[J].NatMed,1995,1(10):1046-1051)；誘導初級膠質(zhì)母細胞瘤細胞凋亡率遠遠高于長春新堿和亞硝基脲(JeremiasI,SteinerHH,BennerA,etal.Celldeathinductionbybetulinicacid,ceramideandTRAILinprimaryglioblastomamultiformecells[J].ActaNeurochir,2006,146(7):721-729)；能與許多細胞毒性化合物如多柔比星、紫杉醇、依托泊昔、放線菌素D聯(lián)合用藥，且具有協(xié)同作用，有望作為增效劑，用于腫瘤化學聯(lián)合療法，避免多藥耐藥性的產(chǎn)生，增強抗腫瘤藥的治療效果(Eder-CzembirekC,CzembirekC,ErovicBM,etal.Combinationofbetulinicacidwithcisplatin-differentcytotoxiceffectsintwoheadandneckcancercelllines[J].OncolRep,2005,14(3):667-671)；能在病毒生命周期的幾乎全部環(huán)節(jié)抑制H9淋巴細胞中HIV的復制(MayauxJF,BousseauA,PauwelsR,etal.Triterpenederivativesthatblockentryofhumanimmunodeficiencyvirustype1intocells[J].ProNatAcadSci,1994,91(9):3564-3568)。此外，樺木酸還具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化應激、抗菌、抗寄生蟲、抗瘧疾及抗?jié)兊榷喾N活性(易金娥,鄔靜,文利新,等.樺木酸的藥理作用研究進展.中草藥,2014,45(14):2118-2124)。隨著對樺木酸藥理活性的認識不斷加深，不少研究者嘗試以樺木酸為母核進行結(jié)構(gòu)修飾，以求提高其溶解度，增加其生物利用度，降低其毒性。對樺木酸的結(jié)構(gòu)修飾主要集中在三個位置：C-3位、C-20位和C-28位。在文獻《樺木酸及其衍生物的研究進展》(李丹,周金培,吳曉明.[J].藥學進展,2004，28(3):120-125)中：(1)對3位羥基的改造一般是以吡啶作溶劑，與各種環(huán)狀二酸酐反應，合成末端帶羧酸基的酯。這一類型的改造還是比較成功的。如表1所示，化合物3、4、5與樺木酸相比，活性大大增強。說明該類型的酰基可能增強抗HIV活性。對樺木酸及其類似物白樺素3位羥基的其它改造，如將β位羥基改為α位、羥基改為羰基、醇改為酰胺等，大都造成活性增強。說明發(fā)揮活性時關(guān)鍵的氫鍵反應可能與3β位的氧相關(guān)。其中，化合物3(DSB，又稱YK-FH312)，尤其引人注目。TaiseiKanamoto等的研究結(jié)果顯示，YK-FH312可能是通過作用于病毒粒子裝配和(或)病毒粒子出芽步驟實現(xiàn)抗HIV活性。(2)對樺木酸19位異丙烯基的改造未得到很令人滿意的結(jié)果。在30位上取代，活性保持，但酸性基團取代對活性明顯有害；碳20位改為酮或肟，失活或活性降低；19位改為?；蛩嵝曰鶊F，會導致失活。說明高電負性的氧原子可能改變樺木酸的靜電性，使其細胞毒性降低。改造19位獲得的唯一成功是二氫樺木酸(Dihydrobetulinicacid)及其衍生物。二氫樺木酸是HIV與細胞膜的融合抑制劑。它的抗HIV測定以H9細胞為感染模型，IC50為12.6μmol/L，EC50＝0.9μmol/L。以二氫樺木酸為先導物，經(jīng)修飾后得到的化合物7的治療指數(shù)為14000，抗HIV活性比其先導物高約1000倍。(3)28位羧基是當前樺木酸的修飾熱點，對其修飾得到的衍生物種類繁多。在近年的研究中，對28位羧基的結(jié)構(gòu)改造以生物活性為指導，逐漸集中于將羧酸基轉(zhuǎn)變成各種酰胺，而且在這些酰胺類衍生物中大多數(shù)的支鏈末端都保留了羧酸基?，F(xiàn)將比較有代表性的化合物加以介紹。如表2所示，該類衍生物的酰胺鏈較短時活性不好。酰胺鏈較長的時候R＝CONH(CH2)mCOOH,m＝7-11時活性有意義，m＝10時活性最強；R＝CONH(CH2)7CONH(CH2)nCOOH,n＝1-4時活性比前面m＝7、10都有提高；R＝CONH(CH2)7NHCO(CH2)nCOOH，n＝1-3時活性又有提高。另外，可能因為胺部分和相鄰質(zhì)子相互作用對羧酸基起到空間定位的作用，鏈中第一個CONH,N上有取代，CONH變成NHCO或NHCONH，都失活。第二個CONH:①與小的α-氨基酸(該氨基酸包含1-2個甲基的親脂性部分)相連，活性增加。②與鄰位的苯甲酸相連，失活；與間位、對位的苯甲酸相連，IC50可達100nmol/L左右。③若CONH換成NHCO，活性便增強。該類衍生物中最著名的是RPR103611，它通過抑制病毒和細胞膜融合過程中的后結(jié)合，即包膜依賴性階段來抑制HIV感染(IC50＝10nmol/L)，是目前唯一通過影響gp41來阻止HIV入侵的小分子非肽類物質(zhì)，有希望開發(fā)成為HIV細胞膜融合劑。PRP103611的旋光異構(gòu)體IC9564.(34.)在病毒感染性降低測定KNL4-3的IC90＝0.22±0.05μmol/L，顯示出很強的抗HIV活性。而在IC9564的系列衍生物中，較突出的是化合物35(EC50＝0.33μmol/L)和36(EC50＝0.46μmol/L)，它們的活性與IC9564相當。研究顯示，IC9564.能強力阻斷HIV-1外殼介導的膜融合，從而在穿入步驟阻斷HIV的復制。這個過程中的關(guān)鍵物質(zhì)HIV-1gp120是IC9564作用的分子靶點。在文獻《23-羥基白樺酸衍生物抗腫瘤作用的三維定量構(gòu)效關(guān)系及分子對接模式》(張婷婷，畢毅，陳蒙蒙等.[J].中國藥學雜志,2014,49(14):1200-1203)中：23-羥基白樺酸衍生物(結(jié)構(gòu)如下)也是五環(huán)三萜類化合物，是一種從中藥白頭翁中分離得到的白樺酸類似物，具有與白樺酸相當?shù)目鼓[瘤活性，但其作用機制目前正在研究之中。該實驗室前期合成了大量的23-羥基白樺酸衍生物并對其進行了抗腫瘤活性研究，研究表明，28-COOH是影響該類化合物抗腫瘤活性的主要部位。到目前為止，對C-3位羥基和C-28位羧基的改造已取得一定進展，但C-20位的結(jié)構(gòu)修飾和改造尚缺乏令人滿意的結(jié)果。其它位置取代的樺木酸衍生物則未見報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種白樺脂酸衍生物，可用于制備抗腫瘤的藥物。作為本申請的一個方面，本申請?zhí)峁┝擞墒絀表示的化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、同位素標記物、溶劑化物、多晶形物或前藥：其中，R1、R2分別選自R3、R4、R5分別選自-H、鹵素、羥基、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、乙酰氧基或乙?；兄辽僖环N；X選自氧、氮、硫或碳原子。優(yōu)選的，R1為R2為進一步優(yōu)選的，X為氧原子；進一步優(yōu)選的，R4為羥基、R3和R5為-H。更進一步優(yōu)選的，所述式I化合物結(jié)構(gòu)式為：作為本申請的另一個方面，本申請?zhí)峁┝艘环N藥物組合物，其包含本申請上述的式I化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、同位素標記物、溶劑化物、多晶形物或前藥，和藥學上可接受的載體。所述藥物組合物包括但不限于口服劑型、胃腸外給藥劑型、外用劑型和直腸給藥劑型。在一些實施方式中，所述藥物組合物可以是口服的片劑、膠囊劑、丸劑、散劑、緩釋制劑、溶液劑和懸浮液，用于胃腸外注射的無菌溶液、懸浮液或乳液，用于外用的軟膏或乳膏，或者用于直腸給藥的栓劑。在一些實施方式中，所述藥物組合物和至少一種治療劑分別以獨立的劑型組合成組合產(chǎn)品，如藥劑盒。作為本申請的另一個方面，本申請?zhí)峁┧鍪絀化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、同位素標記物、溶劑化物、多晶形物或前藥在制備具有抗腫瘤作用的藥物中的應用。作為本申請的另一個方面，本申請?zhí)峁┮环N治療腫瘤疾病的方法，該方法包括將治療有效量的所述式I化合物、其藥學上可接受的鹽、立體異構(gòu)體、同位素標記物、溶劑化物、多晶形物或前藥施用于由此需求的個體。在一些實施方式中，所述腫瘤疾病包括白血病、惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、胃腸道間質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、陰道癌、肺癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、腦癌、黑色素瘤等。本申請所述“藥學上可接受的鹽”是指保留了指定化合物的游離酸和游離堿的生物效力，并且在生物學或其他方面沒有不良作用的鹽。本申請中的鹽指用有機酸/無機酸形成的酸式鹽，以及用有機堿/無機堿形成的堿式鹽。本申請所述“溶劑化物”是指通過溶劑化作用形成的本申請化合物與溶劑分子的組合。如水合物、乙醇溶劑化物、甲醇溶劑化物等。本申請所述“多晶形物”或“多晶形”是指以不同的晶格形式存在的本申請化合物。本申請所述“同位素標記物”是指由同位素標記的本申請化合物。例如本申請的化合物中的同位素包括H、C、O的各種同位素，如2H，3H，13C，14C，18O，17O。本申請所述“藥學上可接受的前藥”是指本申請化合物的任何藥學上可接受的鹽、酯、酯的鹽或其他衍生物，其在向受體施用后能夠直接或間接的提供本申請的化合物或其具有藥學活性的代謝物或殘基。本申請所述“立體異構(gòu)體”是指由分子中原子在空間上排列方式不同所產(chǎn)生的異構(gòu)體。本申請所述“治療有效量”是指服用后足以在某種程度上緩解所治療的疾病或病癥的一個或多個癥狀的至少一種藥劑或化合物的量。本申請所述“藥物組合物”是指任選的混合有至少一種藥學上可接受的化學成分的生物活性化合物，所述藥學上可接受的化學成分包括但不限于載體、穩(wěn)定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑和/或賦形劑。所述“載體”是指相對無毒的化學試劑，其有助于將化合物引入到細胞或組織中。本發(fā)明體外研究表明，式I化合物對多種腫瘤細胞株，如宮頸癌細胞株Hela、人肝癌細胞株HepG-2、人肝癌細胞株BEL7404、人胃癌細胞株AGS、人肝癌細胞株SMMC7721、小鼠結(jié)腸癌細胞株C26均具有明顯的抑制作用。體內(nèi)研究表明，式I化合物可抑制S180在小鼠體內(nèi)的生長，抑制率為53.8％，與化療藥環(huán)磷酰胺接近，表明其具有較好的抗腫瘤活性。附圖說明圖1化合物1的HMBC相關(guān)圖圖2化合物1的NOSEY相關(guān)圖圖3化合物2的HMBC相關(guān)圖圖4化合物2的NOSEY相關(guān)圖具體實施方式實施例1化合物1的制備1.乙酸乙酯提取物的制備取馬甲子適量，10倍量95％乙醇滲漉提取，提取液減壓濃縮后得浸膏。浸膏加水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯提取物。2.色譜條件Agilent1260高效液相色譜儀，色譜柱：BDS-C18(100*4.6mm，2.4um)，流速：1.0ml/min，柱溫：30℃，檢測波長：320nm(DAD)，流動相：乙腈-甲醇(按下表梯度洗脫)。Time(min)乙腈(％)0.1％甲酸液(％)029852985510003.硅膠柱層析(1)原料溶解：原料200g乙酸乙酯部位加入甲醇中(55℃)溶解，抽濾，取濾液。(2)硅膠拌樣：稱取180-200目硅膠約300g，在水浴鍋上將濾液緩慢加入硅膠中拌樣。(3)裝柱參數(shù)：玻璃柱直徑10cm，填料180-200目硅膠1.5kg，氯仿裝柱；洗脫劑：三氯甲烷→三氯氯甲烷：甲醇＝15:1梯度洗脫；展開劑：三氯甲烷：甲醇＝8:1；TLC：硅膠G板，10％硫酸乙醇加熱顯色。(4)洗脫過程及結(jié)果：純?nèi)燃淄檠b柱，純?nèi)燃淄橄疵撝辽珟Ъ磳⒈幌疵摮鰜頃r換成三氯甲烷--甲醇80：1洗脫，TLC監(jiān)測合并相同部分，依次變換系統(tǒng)液比例→60:1→50:1→40:1→30:1至白樺脂酸洗脫完全后,采用高效液相色譜儀分析監(jiān)測流份(色譜條件同“2.色譜條件”)，并變換比例30：1→20：1→15：1，合并包含35-40min組峰的洗脫物。4.MCI純化(1)原料溶解：將上述洗脫物用最少乙醇量溶解，濕法上樣。(2)裝柱參數(shù)：玻璃柱直徑3cm，裝柱高度45cm。(3)洗脫過程：50％乙醇洗脫至洗脫液顏色變淡，換75％乙醇洗脫，流份每500ml一份收集，高效液相監(jiān)測流份(色譜條件同“2.色譜條件”)并換95％乙醇洗脫，高效液相監(jiān)測(色譜條件同“2.色譜條件”)，合并包含35-40min組峰的流份。(4)干燥：合并35-40min流份液體旋干到無乙醇味，用乙酸乙酯萃取三次，旋干乙酸乙酯后于真空干燥箱中干燥24h，得目標段混合物。5.HPLC制備上述目標段混合物以甲醇溶解，過濾，采用制備高效液相色譜制備，獲得化合物1、2粗品。色譜條件：檢測設(shè)備：waters；柱子型號：XB-C18250×4.6mm5um；柱溫：35℃；流速：1ml/min；UV320nm；流動相:乙腈-0.2％磷酸水(梯度洗脫)，梯度洗脫程序：時間/min：0→30→35→45→46→58；乙腈/％：53→63→90→90→53→53。純化：將制備得到的化合物1、2粗品40℃濃縮至無乙腈，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取物40℃濃縮至干，即得化合物1、2純品。6.化合物1的鑒別化合物1為白色粉末，易容于甲醇、乙醇、乙腈等，不溶于水；m.p.：201-203℃；IRνmax(KBr)：3389，2947，1702，1604，1584，1513，1450，1167，832，表明該化合物具有羥基、羰基和苯環(huán)結(jié)構(gòu)單元；ESI-MS:m/z779.48[M-H]-，781.49[M+H]+，803.44[M+Na]+，819.50[M+K]+，顯示該化合物的分子量為780；HRESI-MS：781.4532[M+H]+(計算值781.4522)，確定其分子式為C48H60O9?；衔?的碳氫歸屬(DMSO-d6，δppm，J＝Hz)化合物1的碳氫歸屬(DMSO-d6，δppm，J＝Hz)(續(xù))1H-NMR(600MHz，DMSO)顯示該化合物有5個甲基信號δH0.74，0.91，0.92,0.93，1.67(each3H，s)，其中δH1.67為連接在雙鍵上面的甲基氫信號。在低場部分δH7.72(2H，d，J＝8.4Hz)，7.55(2H，d，J＝8.4Hz)，6.79(2H，d，J＝8.4Hz)，6.76(2H，d，J＝8.4Hz)，說明分子中有兩個苯環(huán)結(jié)構(gòu)，且苯環(huán)為對位取代，同時在δH7.53(1H，d，J＝15.6Hz)，6.82(1H，d，J＝12.6Hz)，6.39(1H，d，J＝15.6Hz)，5.74(1H，d，J＝12.6Hz)，為兩個順反結(jié)構(gòu)雙鍵上面的氫信號。δH12.19，10.02，9.87(1H，s)為分子中的活潑氫信號。結(jié)合13C-NMR(150MHz，DMSO)和DEPT135°，該化合物共有48個碳原子信號，在低場部分δC177.7，167.1，166.1為酯羰基碳信號，δC160.3，159.2，150.5，126.0，125.4，為季碳信號，δC145.0，143.3，133.2，130.8，116.6，116.2，115.3，114.9，為叔碳信號峰，δC110.2為仲碳信號。結(jié)合氫譜數(shù)據(jù)，說明該化合物有兩個對羥基肉桂?；?，根據(jù)它們之間的耦合常數(shù)，可以判斷其中一個是反式結(jié)構(gòu)，另一個是順式結(jié)構(gòu)。除此之外，分子中還有一個雙鍵。在DEPT135°中，δC78.5，72.5是連氧基團叔碳信號，δC62.5是連氧基團仲碳信號。除了兩個對羥基肉桂?；?，該化合物還剩30個碳信號，再結(jié)合1H、13C-NMR和DEPT135°綜合特征，推斷該化合物為C30型三萜結(jié)構(gòu)。由HSQC對化合物的碳氫信號進行歸屬，兩個對羥基肉桂?；ㄟ^HMBC相關(guān)來確定。δH4.88(δC72.5，C-2)與δC166.1(C-γ)，δH4.51(δC62.5，C-27)與δC167.1(C-γ′)具有相關(guān)；同時δH5.74，6.82與δC166.1(C-γ)，δH7.53，6.39與δC167.1(C-γ′)具有相關(guān)，說明順式對羥基肉桂?；桥c母核2位碳相連，反式對羥基肉桂酰基是與母核27位碳相連。δH1.67(H-18)，1.82、1.38(H-22)與δC177.7(C-28)，55.5(C-17)HMBC相關(guān)；δH4.71、4.58(H-29)，1.68(H-30)與δC150.5(C-20)，46.9(C-19)相關(guān)；δH0.91(H-23)、0.74(H-24)與δC78.5(C-3)，39.5(C-4)相關(guān)。以上進一步說明該化合物為2-O-順式對羥基肉桂?；?27-O-反式對羥基肉桂酰基白樺脂酸。2，3位取代基的相對構(gòu)型是由NOESY確定，在NOESY譜圖中δH4.88(H-2)與δH3.05(H-3)相關(guān)，同時δH4.88(H-2)與δH0.93(H-25)相關(guān)，δH3.05(H-3)與δH0.74(H-24)相關(guān)，δH0.74(H-24)與δH0.93(H-25)相關(guān)。說明2，3位取代基均為α構(gòu)型，同樣從NOESY圖譜中可以看出19位取代基為α構(gòu)型。HMBC相關(guān)圖和NOESY相關(guān)圖分別見圖1、2。綜合以上結(jié)構(gòu)分析，該化合物鑒定為2α-O-順式對羥基肉桂?；?3α-羥基-27-O-反式對羥基肉桂?；讟逯?。經(jīng)scifinder檢索，未見有該化合物的相關(guān)報道，確定其為新三萜類結(jié)構(gòu)。7.化合物2的鑒別化合物2為白色無定性粉末，m.p.202-203℃,(c0.02，MeOH)，ESI-MS：負離子m/z779.02[M-H]-，正離子m/z803.43[M+Na]+，提示該化合物的分子量為780；HRESI-MS給出m/z781.4530[M+H]-(理論計算值為781.4522)，確定該化合物的分子式為C48H60O9?；衔?的碳氫歸屬(DMSO-d6，δppm，J＝Hz)化合物2的碳氫歸屬(DMSO-d6，δppm，J＝Hz)(續(xù))化合物2的碳氫歸屬(DMSO-d6，δppm，J＝Hz)(續(xù))13C-NMR譜數(shù)據(jù)顯示該化合物有48個碳，由1H-NMR譜數(shù)據(jù)顯示的芳氫和烯氫質(zhì)子信號δ7.51(2H,d,J＝8.4Hz,H-2′,6′),6.76(2H,d,J＝8.4Hz,H-3′,5′),7.54(1H,d,J＝15.6Hz,H-α),6.32(1H,d,J＝15.6Hz,H-β),7.65(2H,d,J＝8.4Hz,H-2″,6″),6.80(2H,d,J＝8.4Hz,H-3″,5″),6.87(1H,d,J＝12.6Hz,H-α′),5.78(1H,d,J＝12.6Hz,H-β′)以及13C-NMR譜中的18個sp2雜化碳吸收信號，可推測存在2個苯丙烯酸基，再根據(jù)化學位移值δ160.3和159.2，推測苯環(huán)的對位可能各有1個OH取代，可知化合物2中含有2個對羥基肉桂酰氧基結(jié)構(gòu)單元；再由H-α和H-β的耦合常數(shù)J＝15.6Hz與H-α′和H-β′的耦合常數(shù)J＝12.6Hz,說明分子中有1個反式結(jié)構(gòu)和1個順式結(jié)構(gòu)的雙鍵氫。13C-NMR譜中余下的30個碳信號包括6×CH3、11×CH2、6×CH、7×C，且出現(xiàn)δ177.8(C)以及δ150.5(C),110.1(CH2)和19.5(CH3)等白樺脂酸型三萜的特征峰，可確定化合物2為白樺脂酸衍生物。通過和白樺脂酸的結(jié)構(gòu)對比可看出，C-2和C-27位的化學位移變?yōu)棣?2.6(d)和δ62.5(t)，表明C-2位和C-27位有氧取代。在HMBC譜中(圖1)，δH4.90(H-2)與δC166.8(C-γ)，δH4.54(H-27)與δC166.6(C-γ′)相關(guān)；同時δH7.54(H-α)與δC166.8(C-γ)，δH6.87(H-α′)與δC166.6(C-γ′)相關(guān)，說明反式的取代基接于C-2位，而順式的接于C-27位。則推測化合物2為2-O-反式對羥基肉桂?；?27-O-順式對羥基肉桂酰基白樺脂酸。2，3位取代基的相對構(gòu)型是由NOESY確定，在NOESY譜圖中δH4.90(H-2)與δH3.11(H-3)相關(guān)，同時δH4.90(H-2)與δH0.93(H-25)相關(guān)，δH3.11(H-3)與δH0.74(H-24)相關(guān)，δH0.74(H-24)與δH0.93(H-25)相關(guān)。說明2，3位取代基均為α構(gòu)型，同樣從NOESY圖譜中可以看出19位取代基為α構(gòu)型。HMBC相關(guān)圖和NOESY相關(guān)圖分別見圖3、4。綜合以上分析，化合物2鑒定為2α-O-反式對羥基肉桂酰基-3α-羥基-27-O-順式對羥基肉桂?；讟逯帷＝?jīng)scifinder檢索，未見有該化合物的相關(guān)報道，確定化合物2為新三萜類結(jié)構(gòu)。實施例2化合物1、2抗腫瘤活性試驗本實施例采用的細胞株、試劑的來源為：宮頸癌細胞株Hela、人肝癌細胞株HepG-2、人肺癌細胞株A549、人白血病細胞株K562、人胃癌細胞株MGC-803、小鼠結(jié)腸癌細胞株C26均由成都寶科生物科技有限公司提供，人胃癌細胞株AGS購自中國科學院上海細胞研究所。胎牛血清及其相應培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；MTT、DMSO、西黃芪膠、戊巴比妥鈉、TNBS、植烷(pristane)購自美國sigma公司；環(huán)磷酰胺(CTX)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；地塞米松購自海南制藥廠有限公司；四氯化碳購自成都試劑廠；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)購自南京建成；ELISA、Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ)、透明質(zhì)酸(HA)購自武漢華美；層黏連蛋白(LH)購自上海西唐；雷公藤多苷，購自黃石飛云制藥有限公司；云芝多糖購自上?？抵壅婢嗵怯邢薰荆?-二硝氟苯(DNFB)購自美國sigma公司。1、體外抗腫瘤試驗取處于對數(shù)生長期的各種腫瘤細胞(采用的腫瘤細胞株有如下幾種：宮頸癌細胞株Hela；人肝癌細胞株HepG-2；人肝癌細胞株BEL7404；人胃癌細胞株AGS；人肝癌細胞株SMMC7721；小鼠結(jié)腸癌細胞株C26)，制備細胞懸液，用含有10％胎牛血清的相應培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)為1×105個/mL細胞懸液后，將細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加細胞懸液200μL，次日分別加入一定濃度無菌的化合物1、2溶液，混勻后置37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h后，析出培養(yǎng)液并用PBS洗滌兩次，再向每孔加入5mg/mL的MTT磷酸緩沖液20μL以及150μL培養(yǎng)基，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)。2000rpm離心5min，然后棄去培養(yǎng)板孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO，震蕩10min，使形成的甲臜顆粒充分溶解后，酶標儀檢測吸光值。選擇測定波長為490nm。計算化合物1、2對腫瘤細胞的IC50，結(jié)果見表1。表1化合物1、2對多種腫瘤細胞的抑制作用上述結(jié)果表明，化合物1、2具有體外抑瘤作用，且效果顯著優(yōu)于化療藥5-氟尿嘧啶。2、對荷S180小鼠的影響選取接種8d健康狀況良好的S180瘤源小鼠，腹部皮膚消毒后抽取腹水，以無菌生理鹽水按1︰4(腹水體積：生理鹽水體積)混懸備用。雄性昆明種小鼠60只，18～20g，按體重分層隨機均分為5組，分別為模型對照組(0.5％西黃芪膠)、陽性對照組(環(huán)磷酰胺，CTX)、化合物1組，均在其右側(cè)腋部皮下接種0.2mL前述混懸液。2h后模型對照組和藥物組分別灌胃給予受試物或混懸劑，每日一次，連續(xù)14日；陽性對照組腹腔注射給予CTX，隔日一次，共7次。末次給藥后24h頸椎脫臼處死小鼠，剝離瘤塊稱重，并計算抑瘤率((1-實驗組平均瘤重/模型對照組平均瘤重)*100％)，結(jié)果見表2。表2化合物1對荷S180小鼠的影響()組別動物數(shù)(只)劑量瘤重(g)抑瘤率(％)模型對照12——1.32±0.47——陽性對照(CTX)940mg/kg0.41±0.28**68.9化合物11240mg/kg0.47±0.25**64.4與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。實驗結(jié)果表明，化合物1給予400mg/kg灌胃，可抑制S180在小鼠體內(nèi)的生長，具有較好的抗腫瘤活性。3、化合物1對荷人肝癌SMMC-7721裸鼠的影響B(tài)ALB/c裸鼠24只，按0.2ml/只于左側(cè)腋下接種人肝癌細胞株SMMC-7721細胞懸液，細胞密度約3.3×106個/ml。每3天用游標卡尺測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，計算腫瘤體積(V＝0.5ab2)，同時稱量體重，待腫瘤體積大于100mm3開始進行給藥。按腫瘤體積分層隨機均分為3組，分別為模型對照組、陽性對照組(環(huán)磷酰胺，CTX，40mg/kg)、化合物1組(40mg/kg)。分組當日開始給藥，化合物1組和模型對照組按10ml/kg灌胃給予相應受試物或混懸劑，每日1次，連續(xù)14d；陽性對照組皮下注射給予CTX生理鹽水溶液，隔日1次，共7次。第15d脫頸椎處死動物，剝離腫瘤，稱重，測量體積，計算抑瘤率((1－給藥組平均腫瘤重量/模型對照組平均腫瘤重量)×100％)和腫瘤生長抑制率((1－給藥組平均腫瘤體積/模型對照組平均腫瘤體積)×100％)，結(jié)果見表3。表3化合物1對荷SMMC-7721小鼠的影響(N＝8,)與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。實驗結(jié)果表明，化合物1按40mg/kg灌胃給予，可抑制人源性腫瘤SMMC-7721在裸鼠體內(nèi)的生長，顯示較好的抗腫瘤活性。當前第1頁1 2 3