本發(fā)明涉及生物化工及分離純化領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種左旋多巴轉(zhuǎn)化液的膜過(guò)濾分離純化方法。
背景技術(shù)：
：左旋多巴(3，4-dihydroxylphenylalanine，Levodopa)，又稱L-多巴，化學(xué)名稱為3，4-二羥基苯基丙氨酸，CAS：59-92-7；白色結(jié)晶性粉末，無(wú)臭無(wú)味；是生物體內(nèi)一種重要的生物活性物質(zhì)，是L-酪氨酸到兒茶酚或黑色素的生化代謝途徑過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物。其結(jié)構(gòu)式如下：左旋多巴及復(fù)方左旋多巴(如美多芭)治療常見老年病帕金森氏病已有40多年的歷史，至今仍是治療帕金森病最有效的藥物，且耐受性好，不但能改善運(yùn)動(dòng)遲緩，緩解主要癥狀，而且能延長(zhǎng)帕金森病患者的壽命。左旋多巴2007年在世界暢銷藥中排名100，2009年實(shí)現(xiàn)全球產(chǎn)量達(dá)到250噸，2010年銷售金額已超過(guò)15億美元。2015年全球產(chǎn)量接近1000噸，銷售額超過(guò)30多億美金。國(guó)內(nèi)外科學(xué)家正在不斷努力提高左旋多巴的生產(chǎn)產(chǎn)量。據(jù)報(bào)道，左旋多巴的生產(chǎn)方法有天然植物提取法、化學(xué)合成法和微生物酶轉(zhuǎn)化法。傳統(tǒng)的制取方法是從植物貓豆中經(jīng)科學(xué)提取的，中國(guó)專利CN103641730A公布了一種左旋多巴的制備方法，通過(guò)機(jī)械壓扁貓豆，用醋酸水浸提，浸提液用三氯醋酸去除蛋白，濃縮成膏，用水溶解，調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)析出粗結(jié)晶，用熱酸水溶解，活性炭脫色，室溫重結(jié)晶。中國(guó)專利CN103664669A公布了一種制備高純度左旋多巴的工藝方法，以貓豆為原料，用酸水提取，提取液通過(guò)電滲析，對(duì)左旋多巴進(jìn)行富集和分離。植物提取法由于受到原料來(lái)源的限制，產(chǎn)量小，遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前市場(chǎng)需求。左旋多巴的化學(xué)合成較多。目前，工業(yè)化生產(chǎn)左旋多巴原料藥的化學(xué)方法源于1987年，vanillin(香草醛)以及hydantoin(乙內(nèi)酰脲)，需要經(jīng)過(guò)8步的反應(yīng)制得。但遇到一個(gè)主要的困難是合成出來(lái)的產(chǎn)品是D-型和L-型的混合物，將二者分開的過(guò)程控制難度大，同時(shí)存在生產(chǎn)成本高、環(huán)境污染嚴(yán)重等問題。利用微生物生產(chǎn)左旋多巴，就是利用了代謝途徑中的某些酶，如酪氨酸酶、酪氨酸酚裂解酶、轉(zhuǎn)移酶將不同的底物轉(zhuǎn)變成左旋多巴，可獲得大量的左旋多巴，許多國(guó)家對(duì)其生產(chǎn)進(jìn)行了大量的研究，采取了許多不同的合成方法。上世紀(jì)60年代末，國(guó)外一些學(xué)者開始致力于微生物酶法合成左旋多巴的研究。70年代初，日本學(xué)者Yamada等對(duì)微生物酶法合成左旋多巴進(jìn)行了深入的研究，通過(guò)菌種選育和發(fā)酵條件的優(yōu)化于1993年在味之素公司投入工業(yè)化生產(chǎn)。中國(guó)專利CN103122361A公布了通過(guò)構(gòu)建重組工程菌株，提供一種以L-酪氨酸為底物合成左旋多巴的方法。中國(guó)專利CN104726513A公布了一種酶法制備左旋多巴的方法，以嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia)生產(chǎn)酪氨酸酶，以L-酪氨酸為原料轉(zhuǎn)化制備左旋多巴。然而，目前利用生物法制備左旋多巴實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的報(bào)道并不多見?，F(xiàn)有的生物法制備左旋多巴存在反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，副產(chǎn)物較多，轉(zhuǎn)化率低，底物殘留濃度高，成品色澤較差，結(jié)晶度較低，雜質(zhì)含量高等一系列問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種基于陶瓷膜系統(tǒng)過(guò)濾、適用于工業(yè)化生產(chǎn)的左旋多巴結(jié)晶粉的膜過(guò)濾分離純化方法，用于獲得高收率、高純度、高結(jié)晶度、高透光率的左旋多巴無(wú)水結(jié)晶粉末。技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的一種左旋多巴轉(zhuǎn)化液的膜過(guò)濾分離純化方法，通過(guò)酪氨酸酚裂解酶生物轉(zhuǎn)化獲得含有左旋多巴、酪氨酸酚裂解酶、殘留底物、蛋白、色素、鹽類的左旋多巴轉(zhuǎn)化液，轉(zhuǎn)化液中左旋多巴含量不低于100～120g/L，用酸液將轉(zhuǎn)化液的pH調(diào)至強(qiáng)酸性，適當(dāng)升溫后利用陶瓷膜過(guò)濾體系收集清液，至截留液中左旋多巴濃度降至5～8g/L時(shí)，收集得到的陶瓷膜過(guò)濾清液加入活性炭后攪拌升溫脫色，過(guò)濾清液后調(diào)堿結(jié)晶，再過(guò)濾得到結(jié)晶后進(jìn)行干燥，獲得左旋多巴無(wú)水結(jié)晶粉末。本發(fā)明是基于酪氨酸酚裂解酶酶法反應(yīng)獲得的轉(zhuǎn)化液進(jìn)行左旋多巴無(wú)水結(jié)晶粉末的分離和純化。所述酪氨酸酚裂解酶酶法是采用酪氨酸酚裂解酶在輔酶(5-磷酸吡哆醛)存在的條件下，與基礎(chǔ)底物攪拌混合，反應(yīng)產(chǎn)生左旋多巴?；A(chǔ)底物為鄰苯二酚/丙酮酸銨或鄰苯二酚/丙酮酸/濃氨水。如式(I)所示，酪氨酸酚裂解酶在NH4+過(guò)量存在的條件下，可將一分子的鄰苯二酚和一分子的丙酮酸經(jīng)一步反應(yīng)生物合成左旋多巴。該反應(yīng)的殘留物包括：多余的丙酮酸、鄰苯二酚、銨鹽、酶蛋白等雜質(zhì)，以及鄰苯二酚氧化物、殘余酶蛋白溶液等色素。本發(fā)明所述陶瓷膜為常規(guī)陶瓷膜材料制成的微濾膜，陶瓷膜元件孔徑為50-200nm，優(yōu)選為50nm，陶瓷膜材質(zhì)優(yōu)選為二氧化鋯，單根膜為19通道，耐受壓力為0-0.6Mpa。須要說(shuō)明的是，陶瓷膜材料包括但不限于氧化鋁、氧化鈦、氧化鋯等材質(zhì)，優(yōu)選膜元件材質(zhì)為二氧化鋯，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，耐酸、耐堿、耐有機(jī)溶劑，機(jī)械強(qiáng)度大，可反復(fù)沖洗；抗微生物能力強(qiáng)；耐高溫；過(guò)濾精度高，分離效率好，使用壽命長(zhǎng)。本發(fā)明所采用的陶瓷膜均為現(xiàn)有產(chǎn)品，但其對(duì)左旋多巴含量不低于100～120g/L的轉(zhuǎn)化液的過(guò)濾效果非常出色。所述轉(zhuǎn)化液調(diào)酸pH調(diào)至強(qiáng)酸性，即0.95～1.05，調(diào)酸時(shí)轉(zhuǎn)化液溫度升至30～40℃；所用酸液包括但不限于鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲酸、醋酸中的任意一種或多種的組合。調(diào)酸目的是將轉(zhuǎn)化液里的左旋多巴晶體全部溶解，同時(shí)酶蛋白在此條件下可加速變性絮凝。所述轉(zhuǎn)化液調(diào)堿結(jié)晶溫度控制在30～40℃之間，pH調(diào)至3.9～4.3，緩慢攪拌1～2小時(shí)待大量晶體生成后，降溫至5～10℃，靜置后過(guò)濾收集晶體；調(diào)堿結(jié)晶所用堿液包括氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液、氨水溶液中的任意一種或多種的組合。作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，為了提高成品的一次結(jié)晶品質(zhì)和收率，節(jié)省成本，調(diào)堿結(jié)晶過(guò)濾時(shí)，用少量純水均勻噴淋2～3次，最后用純水泡洗一次，甩干后即可收集晶體。陶瓷膜過(guò)濾清液按質(zhì)量體積百分比加入1.0～2.0％的活性炭，升溫至50～55℃，保溫2小時(shí)并緩慢攪拌。清液中的色素被活性炭吸附，其中含有極少量的酶蛋白在酸性條件下已經(jīng)變性絮凝，進(jìn)一步提高了分離效率。作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，調(diào)堿結(jié)晶前還加入抗氧化劑，其在總料液中的濃度為0.5～1.0g/L，，所述抗氧化劑包括NaHSO3、Na2SO3、Na2S2O5或其鉀鹽、維生素C或其鈉鹽或鉀鹽中的任意一種或多種的組合。調(diào)堿結(jié)晶后的干燥步驟，是將物料堆積5±0.5cm厚，溫度45℃下，微波功率控制在7±0.5kW，真空度-0.099～-0.092Mpa，干燥20～30min。這里需要說(shuō)明的是，本發(fā)明酪氨酸酚裂解酶生物催化方法為公知技術(shù)，所使用的酪氨酸酚裂解酶可直接購(gòu)買獲得，也可利用含有酪氨酸酚裂解酶的已知重組E.coli發(fā)酵表達(dá)獲得含酶的菌體發(fā)酵液，再經(jīng)膜濃縮、機(jī)械破壁、離心除菌渣獲得濃縮酶液。本發(fā)明所述方法獲得的左旋多巴無(wú)水結(jié)晶粉末收率不低于85％。所獲得的左旋多巴無(wú)水結(jié)晶粉末，其總雜質(zhì)按HPLC出峰面積百分比計(jì)不大于0.1％，無(wú)水結(jié)晶的結(jié)晶度為90％以上、結(jié)晶粉末顆粒粒徑大小為120μm～250μm。有益效果：本發(fā)明的方法在實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的基礎(chǔ)上，采用陶瓷膜過(guò)濾系統(tǒng)，不僅提高了產(chǎn)品的收率，同時(shí)大大提高了生產(chǎn)效率，縮短了生產(chǎn)周期，降低的生產(chǎn)成本，使得商業(yè)化生產(chǎn)更具規(guī)?；?。采用真空微波干燥技術(shù)，減少受傳統(tǒng)干燥的鼓熱風(fēng)、翻料等外力作用而造成的產(chǎn)品損耗，避免左旋多巴經(jīng)高溫氧化破壞或分解后引起的產(chǎn)品外觀褐變，提高產(chǎn)品干燥后的水分均一性；該方法獲得的結(jié)晶粉末品質(zhì)明顯優(yōu)于EP和USP要求，總雜質(zhì)按HPLC出峰面積百分比計(jì)不大于0.1％(EP為1.0％，USP為1.1％)，單個(gè)雜質(zhì)按HPLC出峰面積百分比計(jì)不大于0.1％(EP和USP最高均為0.5％)，結(jié)晶粉末的結(jié)晶度在90％以上。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明實(shí)施例2的高效液相色譜分析結(jié)果；圖2是本發(fā)明實(shí)施例3的高效液相色譜分析結(jié)果；圖3為本發(fā)明實(shí)施例1轉(zhuǎn)化過(guò)程中左旋多巴和鄰苯二酚變化情況的HPLC圖譜(轉(zhuǎn)化進(jìn)行至1小時(shí)40分鐘)；圖4為本發(fā)明實(shí)施例1轉(zhuǎn)化過(guò)程中左旋多巴和鄰苯二酚變化情況的HPLC圖譜(轉(zhuǎn)化進(jìn)行至3小時(shí))；圖5為本發(fā)明實(shí)施例1轉(zhuǎn)化過(guò)程中左旋多巴和鄰苯二酚變化情況的HPLC圖譜(轉(zhuǎn)化進(jìn)行至4.5小時(shí))。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1酪氨酸酚裂解酶生物催化工藝向水中投放初始丙酮酸，用濃氨水控制pH在7.0～9.0；再依次投加抗氧化劑、螯合劑、銨鹽、5-磷酸吡哆醛，再次用濃氨水將pH控制在7.0～9.0，加入濃度為80～200g/L的重組酪氨酸酚裂解酶的酶液，通入氮?dú)猓{(diào)整溫度至反應(yīng)溫度，氨水調(diào)節(jié)pH至7.0～9.0，加入鄰苯二酚開始反應(yīng)；初始基礎(chǔ)底物鄰苯二酚與丙酮酸及其鈉鹽投放摩爾比為1∶1～1.5。之后，每10min分別投加底物鄰苯二酚和丙酮酸(或丙酮酸銨，下文除特別說(shuō)明外均只丙酮酸)為2g/L，鄰苯二酚的最終投加濃度為50～70g/L(以初始體積計(jì)算)、丙酮酸最終投加濃度為50～70g/L(以初始體積計(jì)算)，當(dāng)?shù)孜镟彵蕉託埩簟?g/L時(shí)，停止投料，繼續(xù)攪拌0.5h～1h后反應(yīng)結(jié)束，獲得左旋多巴轉(zhuǎn)化液。反應(yīng)轉(zhuǎn)化率之95％，轉(zhuǎn)化液中左旋多巴含量可達(dá)100～120g/L。轉(zhuǎn)化步驟中，還需要添加0.2mol/L～0.3mol/L的銨鹽，包括但不限于甲酸銨、乙酸銨、氯化銨、硫酸銨中的任意一種或多種組合。投入丙酮酸或其銨鹽后，還投入底物質(zhì)量1％～5％的抗氧化劑，抗氧化劑包括但不限于NaHSO3、Na2SO3、Na2S2O5、維生素C及其鈉鹽的任意一種或多種的組合。投入丙酮酸和抗氧化劑后，還投入0.5g/L～1.5g/L的螯合劑，螯合劑包括但不限于酒石酸及其鉀鈉鹽、乙二胺四乙酸(EDTA)及其二鈉鹽的任意一種。如圖3至圖5所示，催化反應(yīng)進(jìn)行了4.5小時(shí)，體系中左旋多巴含量逐漸增加，鄰苯二酚濃度始終≤5g/L；反應(yīng)結(jié)束時(shí)，鄰苯二酚的剩余含量只有0.71g/L。實(shí)施例22500L轉(zhuǎn)化體系取實(shí)施例1獲得的左旋多巴轉(zhuǎn)化液2500L，濃度110g/L，加入濃鹽酸調(diào)pH至0.96，濃鹽酸用量為190kg。料液溫度升至30～40℃，開啟陶瓷膜系統(tǒng)過(guò)濾。選用江蘇久吾高科技股份有限公司的陶瓷膜系統(tǒng)，陶瓷膜元件孔徑為50nm，材質(zhì)為二氧化鋯，單根膜為19通道，膜總面積為21.2平方米。利用陶瓷膜收集清液，當(dāng)達(dá)到最低循環(huán)量時(shí)，約500L體系，開始流加純化水。檢測(cè)截留液中左旋多巴的含量，當(dāng)降至5g/L時(shí)，停止過(guò)濾，截留液總體積為530L。收集得到的清液體積為3000L，清液中左旋多巴的含量為89g/L，故陶瓷膜的收率為97.1％。向收集的3000L左旋多巴清液中加入36kg的活性炭，升溫至52℃，緩慢攪拌2小時(shí)。保溫結(jié)束后，此物料經(jīng)壓濾缸除去活性炭，清液經(jīng)過(guò)精密過(guò)濾器后壓入精烘包車間內(nèi)的搪瓷反應(yīng)釜中。開啟攪拌，向反應(yīng)釜中壓入濃度為150g/L的亞硫酸鈉溶液14L，至總料液中抗氧化劑濃度為0.5～1.0g/L?？刂莆锪蠝囟?5℃左右，開啟攪拌，緩慢加入30％的NaOH溶液，將pH調(diào)至3.9，緩慢攪拌2小時(shí)，開始降溫；當(dāng)溫度降至8℃時(shí)，停止攪拌，靜置結(jié)晶5小時(shí)。用籃式離心機(jī)離心收集晶體。離心時(shí)，用純化水噴淋2次，每次用量為6L水，最后用水泡洗一次，用量為10L水。甩干后收集晶體總重量為290kg，裝入一層聚乙烯袋，待烘干。對(duì)離心后的晶體物料進(jìn)行真空微波干燥，干燥物料厚度5±0.5cm，干燥溫度45℃，微波功率控制在7±0.5kW，真空度-0.099～-0.092Mpa，干燥時(shí)長(zhǎng)20～30min。干燥后總重量為245.6kg，故一次結(jié)晶收率為91.0％，總收率為89.3％。經(jīng)檢測(cè)，烘干得到的產(chǎn)品均符合EP和USP要求：總雜質(zhì)按HPLC出峰面積百分比計(jì)不大于0.1％，結(jié)晶粉末的結(jié)晶度在90％以上，顆粒粒徑為120μm～250μm。按EP要求，各指標(biāo)分別為：外觀為白色結(jié)晶性粉末，鑒別IR與對(duì)照品IR圖譜一致，樣品含量測(cè)定主峰保留時(shí)間與對(duì)照品峰保留時(shí)間一致，溶液顏色沒有深于BY6標(biāo)準(zhǔn)比色溶液，干燥失重為0.19％，pH為5.7，殘?jiān)?.1％，重金屬≤10mg/kg，有關(guān)物質(zhì)合格，光學(xué)純度為99.8％，含量用滴定法檢測(cè)為99.3％。按USP要求，各項(xiàng)指標(biāo)分別為：外觀為白色結(jié)晶性粉末，鑒別IR與對(duì)照品IR圖譜一致，樣品含量測(cè)定主峰保留時(shí)間與對(duì)照品峰保留時(shí)間一致，干燥失重為0.19％，旋光度為-165°，殘?jiān)?.1％，重金屬≤10mg/kg，含量用高效液相色譜法檢測(cè)為99.1％，雜質(zhì)檢測(cè)符合要求。實(shí)施例35000L轉(zhuǎn)化體系取實(shí)施例1獲得的左旋多巴轉(zhuǎn)化液5000L，濃度115g/L，加入濃硝酸調(diào)pH至1.04，濃硝酸用量為325kg，料液溫度升至30-40℃之間，開啟陶瓷膜系統(tǒng)過(guò)濾。選用江蘇久吾高科技股份有限公司的陶瓷膜系統(tǒng)，陶瓷膜元件孔徑為50nm，材質(zhì)為二氧化鋯，單根膜為19通道，膜總面積為21.2平方米。利用陶瓷膜收集清液，當(dāng)達(dá)到最低循環(huán)量時(shí)，約700L體系，開始流加飲用水。檢測(cè)截留液中左旋多巴的含量，當(dāng)降至8g/L時(shí)，停止過(guò)濾，截留液總體積為830L。收集到的清液體積為6200L，清液中左旋多巴的含量為90.6g/L，故陶瓷膜的收率為97.7％。向收集的6200L左旋多巴清液中加入62kg的活性炭，升溫至53℃，緩慢攪拌2小時(shí)。保溫結(jié)束后，此物料經(jīng)壓濾缸除去活性炭，清液經(jīng)過(guò)精密過(guò)濾器后壓入精烘包車間內(nèi)的搪瓷反應(yīng)釜中。開啟攪拌，向反應(yīng)釜中壓入濃度為150g/L的維生素C溶液25L，至總料液中抗氧化劑濃度為0.5～1.0g/L?？刂莆锪蠝囟?5℃左右，開啟攪拌，緩慢加入30％的氫氧化鉀溶液，將pH調(diào)至4.3，緩慢攪拌2小時(shí)后，開始降溫；當(dāng)溫度降至7℃時(shí)，停止攪拌，靜置結(jié)晶5小時(shí)。用籃式離心機(jī)離心收集晶體。離心時(shí)，用純化水噴淋2次，每次用量為6L水，最后用水泡洗一次，用量為10L水。甩干后收集晶體總重量為594kg，裝入一層聚乙烯袋，待烘干。對(duì)離心后的晶體物料進(jìn)行真空微波干燥，干燥物料厚度5±0.5cm，干燥溫度45℃，微波功率控制在7±0.5kW，真空度-0.099～-0.092Mpa，干燥時(shí)長(zhǎng)20～30min。干燥后總重量為506kg，故一次結(jié)晶收率為90.1％，總收率為88.0％。經(jīng)檢測(cè)，烘干得到的產(chǎn)品均符合EP和USP要求?？傠s質(zhì)按HPLC出峰面積百分比計(jì)不大于0.1％，結(jié)晶粉末的結(jié)晶度在90％以上，顆粒粒徑為120μm～250μm。按EP要求，各指標(biāo)分別為：外觀為白色結(jié)晶性粉末，鑒別IR與對(duì)照品IR圖譜一致，樣品含量測(cè)定主峰保留時(shí)間與對(duì)照品峰保留時(shí)間一致，溶液顏色沒有深于BY6標(biāo)準(zhǔn)比色溶液，干燥失重為0.16％，pH為5.5，殘?jiān)?.1％，重金屬≤10mg/kg，有關(guān)物質(zhì)合格，光學(xué)純度為99.6％，含量用滴定法檢測(cè)為99.3％。按USP要求，各項(xiàng)指標(biāo)分別為：外觀為白色結(jié)晶性粉末，鑒別IR與對(duì)照品IR圖譜一致，樣品含量測(cè)定主峰保留時(shí)間與對(duì)照品峰保留時(shí)間一致，干燥失重為0.16％，旋光度為-164°，殘?jiān)?.1％，重金屬≤10mg/kg，含量用高效液相色譜法檢測(cè)為99.0％，雜質(zhì)檢測(cè)符合要求。試驗(yàn)例HPLC分析上述實(shí)施例2和實(shí)施例3產(chǎn)品的雜質(zhì)，其結(jié)果如圖1、圖2所示。表1實(shí)施例2左旋多巴無(wú)水結(jié)晶粉末HPLC分析結(jié)果保留時(shí)間面積％面積高度積分類型13.52375730.03928VV26.2982911139599.962653746BB324.10521240.01256BV表2實(shí)施例3左旋多巴無(wú)水結(jié)晶粉末HPLC分析結(jié)果保留時(shí)間面積％面積高度積分類型13.08094820.03614VV24.0862912242599.942652535BB325.11594720.03731VB表1、表2分別對(duì)應(yīng)說(shuō)明書附圖圖1、圖2的HPLC圖譜。本發(fā)明根據(jù)現(xiàn)有的生產(chǎn)制備工藝，所使用的原料均易溶于水，故生產(chǎn)過(guò)程中無(wú)需用到有機(jī)溶劑。得到的產(chǎn)品中雜質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它工藝生產(chǎn)得到的產(chǎn)品，純度均高于99.9％。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3