本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及與水稻粒長(zhǎng)相關(guān)的蛋白SbGL及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻是人類賴以生存的主要糧食作物之一，全球約有一半的人口以稻米為主食。世界稻米的供求矛盾越來越突出，提高產(chǎn)量是當(dāng)今水稻育種的首要目標(biāo)。粒重、每穗粒數(shù)和每株穗數(shù)是決定水稻產(chǎn)量的三個(gè)組成部分，其中粒重又由粒長(zhǎng)、粒寬和粒厚度決定。粒長(zhǎng)不僅作為重要的產(chǎn)量性狀成為育種目標(biāo)，它還影響稻谷整精米率、烹煮特性和適口性等品質(zhì)和外觀，成為品質(zhì)育種中的主要選擇指標(biāo)之一。相對(duì)于水稻其它產(chǎn)量性狀而言，目前關(guān)于粒長(zhǎng)基因的研究稍顯滯后，真正分離到的粒長(zhǎng)基因還很少。在禾本科材料中克隆與粒長(zhǎng)相關(guān)的優(yōu)良基因，對(duì)培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)水稻新品種具有重要的理論與實(shí)際意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

SbGL基因(GenBank登陸號(hào)XM_002453222.1)是高粱中功能未知基因，定位于高粱第4號(hào)染色體上，mRNA大小為846bp，不存在內(nèi)含子，編碼包含281個(gè)氨基酸殘基的蛋白(GenBank登陸號(hào)XP_002453267.1)，蛋白質(zhì)分子量為29.09KD，等電點(diǎn)為8.02。在該蛋白質(zhì)序列中，帶電荷氨基酸70個(gè)，酸性氨基酸26個(gè)，堿性氨基酸27個(gè)，極性氨基酸67個(gè)，疏水氨基酸98個(gè)。Gnebank數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，SbGL蛋白質(zhì)序列具有推定的DUF1645保守結(jié)構(gòu)域，與小米(XP_004951972.1)、玉米(NP_001145342.1)和玉米(XP_008680000.1)蛋白序列的同源性分別達(dá)到58％、60％和59％。SbGL蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示，SbGL蛋白的編碼基因序列如SEQ ID NO.3所示。本發(fā)明構(gòu)建出蛋白SbGL的表達(dá)載體，其序列如SEQ ID NO.1所示，命名為載體pCAMBIA1300+163+SbGL，將其轉(zhuǎn)化到水稻中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)高粱SbGL基因可引起水稻種子極顯著增長(zhǎng)增重。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因水稻粒長(zhǎng)增長(zhǎng)10.22％，千粒重增重14.48％。因此，蛋白SbGL編碼基因可用于制備與水稻粒長(zhǎng)相關(guān)的表達(dá)載體。蛋白SbGL可用于制備水稻粒長(zhǎng)調(diào)控制劑。

附圖說明

圖1高粱SbGL基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M，Marker；1，PCR產(chǎn)物；

圖2 SbGL的pMD18-T質(zhì)粒酶切分析；M，Marker；1、2分別代表不同質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；

圖3表達(dá)載體pCAMBIA1300+163的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4表達(dá)載體pCAMBIA1300+163+SbGL酶切鑒定；M，Marker；1、2分別代表不同質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；

圖5農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化；A，水稻幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)；B，成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)；C，繼代；D，抗性愈傷篩選；E，愈傷分化；F，生根培養(yǎng)；

圖6跨終止子引物鑒定轉(zhuǎn)SbGL基因株系；M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，無模板對(duì)照；2、3，野生型對(duì)照；4、5，陽性對(duì)照；6-24，轉(zhuǎn)基因植株；

圖7實(shí)時(shí)定量PCR分析SbGL基因在轉(zhuǎn)基因株系及野生型水稻中的表達(dá)水平；WT，野生型水稻；L-2，L-4，L-5，L-6，L-7，L-11，L-17，L-19，L-59，L-62和L-63分別代表不同的轉(zhuǎn)基因株系；

圖8野生型與轉(zhuǎn)SbGL基因植株表型特征比較；WT，水稻野生型；L-2、L-7和L-63，轉(zhuǎn)基因株系；

圖9野生型與轉(zhuǎn)SbGL基因植株種子表型特征比較；WT，水稻野生型；L-2、L-7和L-63，轉(zhuǎn)基因株系；Student’s t test。

具體實(shí)施方式

基因克隆

PCR克隆引物，PCR等反應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件，克隆載體，來源及可能用到的內(nèi)切酶，cDNA陽性克隆分析

人工合成一對(duì)引物，并在其5’端分別加上NcoI和BamHI酶切位點(diǎn)。引物如下：

SbGLF：5'CCATGG CCATGTCCGCAATGGCAAC 3'(25)(NcoI)(SEQ ID NO.4)；

SbGLR：5'GGATCC TTGGAATGCACGGCGAAAA3'(25)(BamHI)(SEQ ID NO.5)。

利用此對(duì)引物，以高粱的總DNA為模板進(jìn)行PCR。PCR條件為：熱蓋溫度105℃，預(yù)變性95℃5min，95℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸2min，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。PCR體系見表1：

表1

使用TAE電泳緩沖液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到了大約1000bp的片段(圖1)，命名為SbGL。

將上述SbGL擴(kuò)增產(chǎn)物用TIANGEN的試劑盒進(jìn)行膠回收，然后將回收片段連入PMD18-T載體(TAKARA)。連接體系如表2：

表2

連接2個(gè)小時(shí)，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，涂板，用氨芐霉素篩選。挑選單克隆，提取質(zhì)粒后用NcoI和BamHI雙酶切鑒定，結(jié)果如圖所示，均有約1000bp的目的條帶(圖2)。送1、2號(hào)對(duì)應(yīng)的菌液測(cè)序，測(cè)序結(jié)果均與GenBank上基因序列完全一致。

基因功能驗(yàn)證詳細(xì)過程

表達(dá)原載體及來源，表達(dá)原載體構(gòu)建可能用到的內(nèi)切酶

克隆得到SbGL基因，將其構(gòu)建到表達(dá)載體，具體步驟如下：將連接有SbGL基因的克隆載體pMD18-T和表達(dá)載體pCAMBIA1300+163(圖3)都用BamHI和NcoI進(jìn)行雙酶切并分別回收純化，然后用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，BamHI和NcoI雙酶切鑒定，最終獲得連接有目的基因的過量表達(dá)載體pCAMBIA1300+163+SbGL(圖4)。利用熱激法將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105菌株中。

基因轉(zhuǎn)化方法，基因轉(zhuǎn)化物種

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到水稻SR59中，獲得過量表達(dá)SbGL基因的水稻轉(zhuǎn)基因株系。該實(shí)驗(yàn)過程如下：以SR59成熟種子誘導(dǎo)而來的愈傷組織為受體，經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染、共培養(yǎng)、2次抗性愈傷組織潮霉素連續(xù)篩選(每次2周)、抗性愈傷組織分化、生根、煉苗等步驟獲得潮霉素抗性植株(圖5)。

轉(zhuǎn)基因植物分子分析

通過跨目的基因與終止子的特異引物，對(duì)潮霉素抗性再生植株進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖6)。檢測(cè)出轉(zhuǎn)SbGL基因的陽性株系20株。引物如下：

SbtermF：5'GCATACCCGCTCTTTGAC 3'(SEQ ID NO.6)；

SbtermR：5'AACCCTGCCTTAGCATCTT 3'(SEQ ID NO.7)。

從20個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中隨機(jī)選取11個(gè)株系及野生型對(duì)照(WT)，利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)SbGL在各轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平(圖7)。SbGL在野生型中沒有表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因株系中都有過量表達(dá)，不同轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量不同。qRT-PCR引物如下：

SbGLRTF：5'ACAGGCTCTTCTACGGCAAG 3'(SEQ ID NO.8)；

SbGLRTR：5'GCGGTAGGGTAGGTACGACT 3'(SEQ ID NO.9)；

OsActinF：5'ACCCAAGAATGCTAAGCCAAGAG 3'(SEQ ID NO.10)；

OsActinR：5'ACTTTGTCCACGCTAATGAAGAAAC 3'(SEQ ID NO.11)。

轉(zhuǎn)基因植物功能表型(圖8、圖9)

對(duì)野生型和T1代轉(zhuǎn)SbGL基因水稻的農(nóng)藝性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中轉(zhuǎn)基因水稻選擇L-2、L-7和L-63三個(gè)株系作為統(tǒng)計(jì)對(duì)象。與野生型的株高相比，L-2株系低于野生型，差異極顯著；L-7株系與野生型無顯著性差異；L-63株系高于野生型，差異顯著。與野生型的分蘗數(shù)相比，三個(gè)株系無顯著性差異。與野生型的每穗粒數(shù)相比，三個(gè)株系無顯著性差異。與野生型的穗長(zhǎng)相比，L-2株系較長(zhǎng)，差異極顯著，L-7株系無顯著性差異，L-63株系較長(zhǎng)，差異極顯著。

與野生型的粒長(zhǎng)相比，三個(gè)株系均極顯著增長(zhǎng)。L-2株系增長(zhǎng)10.35％，L-7株系增長(zhǎng)10.35％，L-63株系增長(zhǎng)10.22％。與野生型的粒寬相比，L-2和L-7株系極顯著變窄，L-63株系無差異。與野生型的長(zhǎng)寬比相比，三個(gè)株系均極顯著變大。與野生型的千粒重相比，三個(gè)株系均極顯著增重。L-2株系增重4.68％，L-7株系增重5.68％，L-63株系增重14.48％。