本發(fā)明屬于植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及了棉花纖維特異的阿拉伯半乳聚糖蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶GhGalT1基因的RNA干涉載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：棉花是世界上最重要的農(nóng)作物之一。我國(guó)皮棉總產(chǎn)全球第一，棉花單產(chǎn)處于中上水平。但是，我國(guó)棉纖維總體品質(zhì)較差，表現(xiàn)之一是原棉類型單一，纖維長(zhǎng)度多集中在27～29毫米(適紡32～40支紗)，缺少長(zhǎng)度在33～35毫米的中長(zhǎng)絨(適紡60～120支紗)和短絨(長(zhǎng)度在27毫米以下，適紡20支紗)的皮棉供應(yīng)。近年來(lái)，傳統(tǒng)的棉花育種技術(shù)遇到了發(fā)展瓶頸，很難有所突破，因而生物技術(shù)已經(jīng)成為一種高效改良棉纖維品質(zhì)的分子育種新方法。棉纖維細(xì)胞是由胚珠外層珠被的上表皮細(xì)胞分化而來(lái)的單細(xì)胞種皮毛，是植物中伸長(zhǎng)最快、纖維素合成最多的獨(dú)特細(xì)胞類型。棉纖維細(xì)胞分化和發(fā)育過程可分為纖維細(xì)胞起始、初生壁形成、次生壁加厚和脫水成熟等四個(gè)連續(xù)而重疊的時(shí)期。棉纖維細(xì)胞初生壁形成于起始和伸長(zhǎng)階段，纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)一般可持續(xù)20天左右。在纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)階段，纖維素僅占細(xì)胞壁總糖的35～50％，半纖維素和果膠占30～50％；而在纖維細(xì)胞次生壁加厚階段，非纖維素多糖卻降低到不足3％，細(xì)胞壁中的纖維素含量上升到約95％，表明這些細(xì)胞壁多糖在棉纖維細(xì)胞發(fā)育過程中是動(dòng)態(tài)變化的，進(jìn)行著活躍地合成、修飾和轉(zhuǎn)換。目前，大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：細(xì)胞壁多糖和糖蛋白在決定纖維形態(tài)建成，以及紡織工業(yè)上重要的品質(zhì)參數(shù)(如纖維長(zhǎng)度、強(qiáng)度等)方面發(fā)揮重要的作用。我們?cè)谶^去10多年的研究中發(fā)現(xiàn)一類富含羥脯氨酸的細(xì)胞壁糖蛋白(hydroxyproline-richglycoproteins,HRGP)在發(fā)育的棉纖維中非常豐富，它們通過改變HRGP交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞壁組成調(diào)控棉纖維發(fā)育。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)一個(gè)GT31家族(GlycosyltransferaseFamily31)的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因GhGalT1參與阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP)多糖主鏈合成。與野生型棉纖維相比較，在棉花中過表達(dá)GhGalT1導(dǎo)致纖維細(xì)胞起始延遲，且起始數(shù)目變少，成熟棉纖維長(zhǎng)度變短；而利用RNA干擾(RNAi)抑制GhGalT1基因表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因棉纖維細(xì)胞起始加快，細(xì)胞數(shù)目增多，成熟棉纖維長(zhǎng)度顯著增長(zhǎng)，表明GhGalT1參與棉纖維細(xì)胞起始和伸長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控過程。因此，利用該基因調(diào)控AGP的糖基化水平，能夠影響棉纖維發(fā)育和品質(zhì)性狀形成。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，目的在于提供一種棉花纖維特異的阿拉伯半乳聚糖蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶GhGalT1基因的RNA干涉載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種棉花纖維特異的阿拉伯半乳聚糖蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶GhGalT1基因的RNA干涉載體，包括含有棉花GhRDL1啟動(dòng)子核心序列的骨架載體和含有GhTUA6基因內(nèi)含子、正義鏈、反義鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述正義鏈、反義鏈為串聯(lián)的棉花GhGalT1基因的特異性DNA片段有義鏈GhGalT1-L1核苷酸序列和反義鏈GhGalT1-L2核苷酸序列，所述棉花GhGalT1基因的特異性DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述方案中，所述棉花GhRDL1啟動(dòng)子核心序列如SEQIDNO.2所示。上述方案中，所述棉花GhRDL1啟動(dòng)子核心序列插入在骨架載體上HindIII和XbaI酶切位點(diǎn)之間。上述方案中，所述骨架載體為pBI101載體。上述方案中，所述正義鏈插入在中間載體上BamHI和XbaI酶切位點(diǎn)之間，所述反義鏈插入在中間載體上SacI和NotI酶切位點(diǎn)之間。上述方案中，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)為上述含有GhTUA6基因內(nèi)含子、正義鏈、反義鏈的中間載體經(jīng)BamHI和SacI雙酶切得到。上述方案中，所述中間載體為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pSK-TUA6intron，即將棉花GhTUA6基因的內(nèi)含子插入到pSK載體上XbaI和NotI酶切位點(diǎn)之間，形成中間載體pSK-TUA6intron，所述GhTUA6基因的內(nèi)含子的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。上述方案中，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)插入在骨架載體上BamHI和SacI酶切位點(diǎn)之間。上述棉花纖維特異的阿拉伯半乳聚糖蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶GhGalT1基因的RNA干涉載體的制備方法，包括如下步驟：(1)GhGalT1-L1和GhGalT1-L2目的片段的獲得：取棉花纖維組織，提取RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，以cDNA為模板，以SEQIDNO.3和SEQIDNO.4核苷酸序列為引物，PCR擴(kuò)增得到GhGalT1-L1目的片段，以SEQIDNO.5和SEQIDNO.6核苷酸序列為引物，PCR擴(kuò)增得到GhGalT1-L2目的片段；SEQIDNO.3：5’-CTTGGATCCTGGATGCCTTCTGATCGTCA-3’SEQIDNO.4：5’-CTTTCTAGAATGCTAACGTTTTGTACGGGAG-3’SEQIDNO.5：5’-GGGGAGCTCTGGATGCCTTCTGATCGTCAAG-3’SEQIDNO.6：5’-CTTGCGGCCGCATGCTAACGTTTTGTACGGGAG-3’(2)pSK-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2載體的構(gòu)建：用BamHI和XbaI分別雙酶切GhGalT1-L1目的片段和pSK-TUA6intron中間載體，通過連接，轉(zhuǎn)化，得到重組質(zhì)粒pSK-GalT1-L1-TUA6intron；用SacI和NotI分別雙酶切GhGalT1-L2目的片段和重組質(zhì)粒pSK-GalT1-L1-TUA6intron，通過連接，轉(zhuǎn)化，得到重組質(zhì)粒pSK-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2；(3)pBI-RDL1p啟動(dòng)子載體的構(gòu)建：以棉花葉片組織基因組DNA為模板，以SEQIDNO.7和SEQIDNO.8核苷酸序列為引物，PCR擴(kuò)增得到棉花GhRDL1啟動(dòng)子核心序列目的片段；用HindIII和XbaI分別雙酶切GhRDL1啟動(dòng)子核心序列目的片段和pBI101載體，通過連接，轉(zhuǎn)化，得到重組質(zhì)粒pBI-RDL1p；SEQIDNO.7：5’-GGGAAGCTTAATTAGTTATGTTTGGTAAATG-3’SEQIDNO.8：5’-CTTTCTAGACTAGAACAGGAGTGACTAATTCTAT-3’(4)pBI-RDL1p-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2載體的構(gòu)建：用BamHI和SacI分別雙酶切重組質(zhì)粒pSK-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2和pBI-RDL1p，通過連接，轉(zhuǎn)化，構(gòu)建得到pBI-RDL1p-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2載體，即GhGalT1RNAi干涉載體。上述棉花纖維特異的阿拉伯半乳聚糖蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶GhGalT1基因的RNA干涉載體在轉(zhuǎn)基因棉花中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明構(gòu)建獲得了棉纖維特異的GhRDL1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GhGalT1基因特異元件構(gòu)建的RNA干涉載體，將其轉(zhuǎn)化棉花，獲得GhGalT1RNAi轉(zhuǎn)基因棉花植株；對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花植株后代(T1–T4代)株系進(jìn)行遺傳和表型等方面的分析表明，該GhGalT1RNAi轉(zhuǎn)基因棉花的纖維中GhGalT1基因表達(dá)水平明顯受到不同程度抑制，成熟纖維長(zhǎng)度顯著增長(zhǎng)，纖維品質(zhì)明顯提高，能夠穩(wěn)定遺傳；本發(fā)明所構(gòu)建的GhGalT1RNAi干涉載體可用于棉纖維品質(zhì)改良的分子育種。附圖說明圖1為pBI-RDL1p-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2載體示意圖。圖2為PCR擴(kuò)增GhGalT1-L1和GhGalT1-L2目的片段，其中M：DNAMarker；–：陰性對(duì)照；1～4：GhGalT1-L1目的片段；5～8：GhGalT1-L2目的片段。圖3為pSK-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2重組質(zhì)粒的PCR及酶切檢測(cè)結(jié)果，其中M：DNAMarker；–：陰性對(duì)照；1～2：用GhGalT1-L1P1與TUA6intronP2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；3：GhGalT1-L2P1與TUA6intronP1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；4～8：分別為pSK-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2質(zhì)粒經(jīng)BamHI+XbaI、NotI+SacI、BamHI+NotI、XbaI+SacI、BamHI+SacI雙酶切檢測(cè)產(chǎn)物。圖4為PCR擴(kuò)增GhRDL1啟動(dòng)子片段，其中M:DNAMarker；1～3:GhRDL1啟動(dòng)子條帶。圖5為pBI-RDL1p-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2重組質(zhì)粒的PCR和酶切檢測(cè)結(jié)果，其中M：DNAMarker：–：陰性對(duì)照；1～2：用RDL1pP1與TUA6intronP2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；3～4：pBI-RDL1p-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2質(zhì)粒經(jīng)HindIII與SacI雙酶切檢測(cè)的產(chǎn)物。圖6為GhGalT1RNAi轉(zhuǎn)基因棉花與野生型棉花的成熟纖維長(zhǎng)度的比較結(jié)果，其中WT為野生型棉花；RNAi-L1-1–-L10-3為不同GhGalT1-RNAi轉(zhuǎn)基因棉花株系，**表示野生型棉纖維長(zhǎng)度與GhGalT1-RNAi轉(zhuǎn)基因棉纖維長(zhǎng)度之間存在顯著差異。具體實(shí)施方式為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。實(shí)施例1pSK-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2載體的構(gòu)建(1)設(shè)計(jì)引物：通過DNA序列分析，篩查到GhGalT1基因序列中比較特異的193bp大小的目的片段(核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)，在此DNA區(qū)段分別設(shè)計(jì)兩對(duì)上、下游引物：其中一對(duì)引物為GhGalT1-L1P1(核苷酸序列如SEQIDNO.3所示)和GhGalT1-L1P2(核苷酸序列如SEQIDNO.4所示)，在其兩端分別引入BamHI與XbaI酶切位點(diǎn)；另一對(duì)引物為GhGalT1-L2P1(核苷酸序列如SEQIDNO.5所示)和GhGalT1-L2P2(核苷酸序列如SEQIDNO.6所示)，在其兩端分別引入SacI與NotI酶切位點(diǎn)。SEQIDNO.3，GhGalT1-L1P1:5’-CTTGGATCCTGGATGCCTTCTGATCGTCA-3’SEQIDNO.4，GhGalT1-L1P2:5’-CTTTCTAGAATGCTAACGTTTTGTACGGGAG-3’SEQIDNO.5，GhGalT1-L2P1:5’-GGGGAGCTCTGGATGCCTTCTGATCGTCAAG-3’SEQIDNO.6，GhGalT1-L2P2:5’-CTTGCGGCCGCATGCTAACGTTTTGTACGGGAG-3’(2)棉花纖維cDNA的獲得：取開花后5天的棉花纖維組織100mg左右，提取總RNA，具體步驟參照SIGMA公司的SPECTRUMTMPlantTotalRNAKit說明書；以50μg總RNA作為起始消化量，先用DNase消化除去總RNA中的gDNA，然后根據(jù)QIANGEN公司的RNA純化試劑盒說明書對(duì)已消化好的RNA進(jìn)行純化；對(duì)純化的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，具體過程參照Promega公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶使用說明書進(jìn)行：取2.5μg已純化的RNA，加入0.5μg的Oligo(16T)，補(bǔ)水至14μL，混勻后于70℃水浴5min后，快速置于冰上5min，使模板充分變性，隨后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表1；混勻反應(yīng)體系，置于42℃反應(yīng)1h后，經(jīng)70℃水浴15min終止反應(yīng)，然后保存于–20℃?zhèn)溆?。?逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(3)GhGalT1-L1與GhGalT1-L2目的片段的獲得：以上述獲得的cDNA為模板，分別用引物對(duì)GhGalT1-L1P1和GhGalT1-L1P2、引物對(duì)GhGalT1-L2P1和GhGalT1-L2P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增GhGalT1-L1與GhGalT1-L2目的片段，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系見表2，PCR擴(kuò)增程序如下：98℃1min；98℃10s，58℃10s，72℃1min，循環(huán)32次；72℃10min；12℃1h。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，獲得目的片段GhGalT1-L1和GhGalT1-L2，大小約為200bp(如圖2所示)。表2PCR反應(yīng)體系成分加量(μl)ddH2O12.45×PSbuffer(Mg2+)4dNTP(2.5mM)1.6P1(10μM)0.4P2(10μM)0.4PrimeSTARPolymerase0.2cDNA模板1Total20(4)pSK-GalT1-L1-TUA6intron載體的獲得：用BamHI和XbaI分別酶切GhGalT1-L1目的片段和pSK-TUA6intron中間載體，其中TUA6intro為GhTUA6基因內(nèi)含子片段，核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，雙酶切消化GhGalT1-L1的反應(yīng)體系見表3，雙酶切消化pSK-TUA6intron質(zhì)粒的反應(yīng)體系見表4，在37℃條件下酶切消化3h后，經(jīng)電泳，切膠回收目的片段；將目的片段與雙酶切消化后的載體在16℃條件下連接反應(yīng)12～16h，連接反應(yīng)體系見表5，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，然后將菌液涂在LB選擇培養(yǎng)基上，在37℃條件下倒置培養(yǎng)過夜，篩選轉(zhuǎn)化子。用GhGalT1-L1P1引物和TUA6intronP2引物(核苷酸序列如SEQIDNO.11所示)進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，挑選重組轉(zhuǎn)化子，挑取陽(yáng)性克隆接種至LB液體培養(yǎng)基(含50μg/ml氨芐青霉素)中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，參照康為質(zhì)粒抽提試劑盒說明書中的操作方法提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切檢測(cè)確認(rèn)重組質(zhì)粒插入了目的片段，所獲得的重組質(zhì)粒命名為pSK-GalT1-L1-TUA6intron。表3雙酶切消化GhGalT1-L1反應(yīng)體系成分加量(μl)ddH2O710×Kbuffer1GhGalT1-L1片段10BamHI1XbaI1total20表4雙酶切消化pSK-TUA6intron質(zhì)粒反應(yīng)體系成分加量(μl)ddH2O1010×Kbuffer1pSK-TUA6intron質(zhì)粒7BamHI1XbaI1total20表5目的片段的連接反應(yīng)體系成分加量(μl)ddH2O110×T4DNAligasebuffer1酶切質(zhì)粒2目的片段5T4DNAligase1total10(5)pSK-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2載體的獲得：用SacI和NotI雙酶切GhGalT1-L2目的片段和pSK-GalT1-L1-TUA6intron重組質(zhì)粒，經(jīng)電泳，切膠回收目的片段；再經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、篩選轉(zhuǎn)化子，使GhGalT1-L2目的片段克隆至pSK-GalT1-L1-TUA6intron載體上，形成pSK-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2的正義鏈-內(nèi)含子-反義鏈結(jié)構(gòu)，獲得重組質(zhì)粒，命名為pSK-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2。提取所獲得的重組質(zhì)粒，分別用GhGalT1-L1P1引物和TUA6intronP2引物、TUA6intronP1引物(核苷酸序列如SEQIDNO.10所示)和GhGalT1-L2P2引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示：GhGalT1-L1和GhGalT1-L2均已正確插入至pSK-TUA6intron載體中，同時(shí)分別用BamHI+XbaI、NotI+SacI、BamHI+NotI、XbaI+SacI、BamHI+SacI雙酶切質(zhì)粒，結(jié)構(gòu)顯示重組質(zhì)粒中已插入了正確的目的片段(PCR及酶切結(jié)果如圖3所示)，隨后，將該重組質(zhì)粒DNA送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，以獲得重組DNA序列信息。SEQIDNO.10，TUA6intronP1:5’-GGGTCTAGAGAACATGGAATCCAGGTATCT-3’SEQIDNO.11，TUA6intronP2:5’-CTTGCGGCCGCATCTGGCCATCAGGCTGTT-3’實(shí)施例2pBI-RDL1p啟動(dòng)子載體的構(gòu)建(1)設(shè)計(jì)引物：選取棉花GhRDL1啟動(dòng)子的具有活性的核心片段(302bp，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)，這個(gè)啟動(dòng)子具有棉纖維特異性表達(dá)活性，我們利用這個(gè)棉纖維特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GhGalT1基因在棉纖維中表達(dá)。在GhRDL1啟動(dòng)子302bp片段的5’和3’兩端分別引入HindIII和XbaI酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)GhRDL1pP1引物(核苷酸序列如SEQIDNO.7所示)和GhRDL1pP2引物(核苷酸序列如SEQIDNO.8所示)用于擴(kuò)增GhRDL1啟動(dòng)子片段。SEQIDNO.7，RDL1pP1：5’-GGGAAGCTTAATTAGTTATGTTTGGTAAATG-3’SEQIDNO.8，RDL1pP2：5’-CTTTCTAGACTAGAACAGGAGTGACTAATTCTAT-3’(2)GhRDL1啟動(dòng)子目的片段的獲得：取棉花葉片組織100mg左右，提取基因組DNA(gDNA)，具體步驟參照康為世紀(jì)公司的棉花基因組DNA試劑盒說明書，并以此gDNA為模板，用GhRDL1pP1引物和GhRDL1pP2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得上述GhRDL1啟動(dòng)子的活性區(qū)域片段(PCR結(jié)果如圖4所示)。(3)pBI-RDL1p載體構(gòu)建：用HindIII和XbaI分別雙酶切GhRDL1啟動(dòng)子目的片段和pBI101載體，再經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化，篩選轉(zhuǎn)化子，使GhRDL1啟動(dòng)子片段克隆至pBI101載體上，形成pBI-RDL1p質(zhì)粒載體，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和雙酶切檢測(cè)驗(yàn)證載體構(gòu)建成功，將重組質(zhì)粒pBI-RDL1p的DNA送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)核實(shí)確認(rèn)所克隆的GhRDL1啟動(dòng)子序列正確無(wú)突變。實(shí)施例3pBI-RDL1p-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2載體的構(gòu)建分別用BamHI和SacI雙酶切pSK-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2重組質(zhì)粒與pBI-RDL1p重組質(zhì)粒，將經(jīng)BamHI和SacI雙酶切后的GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2目的片段與經(jīng)BamHI和SacI雙酶切后的pBI-RDL1p線性質(zhì)粒進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，構(gòu)建獲得pBI-RDL1p-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2重組質(zhì)粒載體(即GhGalT1RNAi載體)。提取重組質(zhì)粒，用引物GhRDL1pP1和TUA6intronP2進(jìn)行PCR檢測(cè)，同時(shí)用HindIII與SacI雙酶切檢測(cè)，結(jié)果顯示目的片段已正確插入到載體中(PCR及雙酶切檢測(cè)結(jié)果如圖5所示)。pBI-RDL1p-GalT1-L1-TUA6intron-GalT1-L2載體示意圖見圖1。實(shí)施例4棉花轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因棉花的獲得(1)按照Lietal.,2005的方法(LiXB,FanXP,WangXL,CaiL,YangWC.ThecottonACTIN1geneisfunctionallyexpressedinfibersandparticipatesinfiberelongation.PlantCell,2005,17:859–875)進(jìn)行棉花遺傳轉(zhuǎn)化，將GhGalT1RNAi載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，浸染棉花幼苗下胚軸外植體，將浸染后的棉花下胚軸切段在MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上連續(xù)繼代培養(yǎng)8～10個(gè)月，獲得轉(zhuǎn)化的胚性愈傷組織，進(jìn)而獲得再生的轉(zhuǎn)基因棉花植株。(2)提取轉(zhuǎn)基因棉花開花后5天和10天的纖維RNA，具體步驟參照SIGMA公司的SPECTRUMTMPlantTotalRNAKit說明書，以50μg總RNA作為起始消化量，先用DNase消化除去總RNA中的gDNA，然后根據(jù)QIANGEN公司的RNA純化試劑盒說明書對(duì)已消化好的RNA進(jìn)行純化，對(duì)純化的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，具體過程參照Promega公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶使用說明書進(jìn)行，按照SYBRGreenReal-timePCRMasterMix(Toyobo,Osaka,Japan)說明書進(jìn)行熒光定量RT-PCR分析，檢測(cè)GhGalT1基因在轉(zhuǎn)基因棉纖維中的表達(dá)情況，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，其中圖6(A)表明：與野生型棉花相比，GhGalT1基因在GhGalT1RNAi轉(zhuǎn)基因棉花中的表達(dá)量明顯下調(diào)，圖6(B)和圖6(C)表明：與野生型棉花相比，GhGalT1RNAi轉(zhuǎn)基因棉花的棉鈴變大，棉纖維顯著長(zhǎng)于野生型。(3)按照Xuetal.,2013的方法(XuWL,ZhangDJ,WuYF,QinLX,HuangGQ,LiJ,LiL,LiXB.CottonPRP5geneencodingaproline-richproteinisinvolvedinfiberdevelopment.PlantMolBiol,2013,82:353–365)測(cè)量轉(zhuǎn)基因棉花植株的成熟纖維長(zhǎng)度并統(tǒng)計(jì)分析，將其和野生型棉花植株中成熟纖維長(zhǎng)度進(jìn)行比較，結(jié)果如圖6(D)所示。圖6(D)說明了GhGalT1RNAi轉(zhuǎn)基因棉花成熟纖維長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于野生型。顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的實(shí)例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限制。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3