本發(fā)明涉及一種藍(lán)藻工程菌系統(tǒng)的制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種無抗生素篩選并持續(xù)高效表達(dá)外源基因的聚球藻(Synechococcus sp.)PCC7002工程菌系統(tǒng)的制備方法和應(yīng)用，為藍(lán)藻在發(fā)酵工業(yè)化中低成本更安全大規(guī)模表達(dá)外源基因提供了一條途徑。

背景技術(shù)：

由于藍(lán)藻光合自養(yǎng)、易于基因操作、生長(zhǎng)速度快等特點(diǎn)，目前文獻(xiàn)上和工業(yè)中已有很多利用藍(lán)藻作為生物反應(yīng)器來表達(dá)外源基因的例子，比如：蚊幼毒蛋白基因、脂肪酸不飽和酶基因、羥丁酸聚合酶基因、催化二十碳五烯酸(EPA)合成的脫氫基因、纖維素基因。目前主要通過兩種方式將外源基因轉(zhuǎn)入藍(lán)藻：(1)通過穿梭表達(dá)載體，定位在染色體基因組外，獨(dú)立自主進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)；(2)整合載體，含有藍(lán)藻基因組同源片段，可以選擇性地將外源基因嵌合在染色體特定位點(diǎn)上。由于第一種方法穿梭載體的拷貝數(shù)低，基因表達(dá)量少，所以目前普遍應(yīng)用的技術(shù)是第二種整合載體的方法：在聚球藻PCC7002中，應(yīng)用pAQ1-Ex整合載體，將外源基因嵌合在聚球藻內(nèi)源性質(zhì)粒pAQ1上，并進(jìn)行表達(dá)。

但是這些技術(shù)都是利用抗生素去篩選陽性菌株，并為了防止今后發(fā)酵培養(yǎng)中工程菌丟失外源基因，在培養(yǎng)液中要持續(xù)加入抗生素。使用抗生素有許多缺點(diǎn)：(1)而抗生素的培養(yǎng)壓力，會(huì)導(dǎo)致工程菌的生長(zhǎng)速度降低，增加藍(lán)藻的培養(yǎng)時(shí)間，增加發(fā)酵成本；(2)使用抗生素本身也需要一定的成本；(3)抗生素會(huì)造成對(duì)環(huán)境的污染；(4)抗生素還會(huì)影響產(chǎn)品的安全性。所以抗生素的使用，不僅增加了發(fā)酵工業(yè)的成本，也造成了對(duì)環(huán)境的污染以及不可靠的產(chǎn)品安全性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種無抗生素表達(dá)外源基因的藍(lán)藻工程菌系統(tǒng)的制備方法和應(yīng)用，用以解決藍(lán)藻反應(yīng)器需要依賴抗生素的培養(yǎng)壓力來表達(dá)外源基因的技術(shù)問題。

本發(fā)明利用編碼光系統(tǒng)Ⅱ組成蛋白CP43的psbC基因缺失和回復(fù)作為選擇標(biāo)記，來篩選陽性克隆，并作為選擇壓力使得外源基因能在無抗生素的培養(yǎng)條件下持續(xù)表達(dá)，從而構(gòu)建了一種無抗生素篩選并持續(xù)高效表達(dá)外源基因的聚球藻(Synechococcus sp.)PCC7002工程菌系統(tǒng)的制備方法。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種藍(lán)藻工程菌表達(dá)系統(tǒng)，包括：聚球藻PCC7002的psbC基因缺失突變體△psbC和用于表達(dá)外源基因的整合載體，所述整合載體具有核心元件FlanKA—P₁—MCS—P₂—psbC—FlanKB，其中：FlanKA和FlanKB代表聚球藻PCC7002內(nèi)源質(zhì)粒pAQ3的兩段同源片段，交換區(qū)域在C0006和C0007基因間區(qū)；MCS是用于插入外源基因的多克隆位點(diǎn)；P₁代表一種藍(lán)細(xì)菌啟動(dòng)子，能夠調(diào)控插入到MCS中的外源基因的表達(dá)；P₂代表用于啟動(dòng)psbC基因表達(dá)的啟動(dòng)子；psbC代表psbC基因序列。

野生型聚球藻PCC7002能夠在無甘油的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，例如無甘油的普通A⁺培養(yǎng)基，而聚球藻PCC7002的△psbC突變體必須用含有甘油的培養(yǎng)基培養(yǎng)，例如含甘油的A⁺培養(yǎng)基。

外源基因通過基因工程手段插入到MCS中。將攜帶了外源基因的整合載體導(dǎo)入聚球藻PCC7002的△psbC突變體中后，同源片段FlanKA和FlanKB能將整合載體上的“P₁—MCS—P₂—psbC”片段整合到聚球藻PCC7002內(nèi)源質(zhì)粒pAQ3的C0006和C0007的基因間區(qū)，其中“P₂—psbC”能夠回復(fù)聚球藻PCC7002的△psbC突變體的psbC基因缺失。

上述P₁啟動(dòng)子可以是任何一種能夠在藍(lán)細(xì)菌中調(diào)控基因表達(dá)的啟動(dòng)子，可以是增強(qiáng)型、組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如藍(lán)細(xì)菌的強(qiáng)啟動(dòng)子P_cpcBA、Cu²⁺濃度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_petE。

上述P₂啟動(dòng)子優(yōu)選為psbC基因的啟動(dòng)子P_psbDC。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所構(gòu)建的整合載體pAQ3-Ex包含核心元件“FlanKA—P_cpcBA—MCS—P_psbDC—psbC—FlanKB”，該核心元件的序列如序列表中SEQ ID No：25所示。其中第1～1007位核苷酸序列是FlanKA，第1014～1604位核苷酸序列是P_cpcBA，第1611～1808位核苷酸序列是MCS，第1815～2126位核苷酸序列是P_psbDC，第2133～3589位核苷酸序列是psbC，3596～4617位核苷酸序列是FlanKB。

本發(fā)明的第二方面，提供了上述藍(lán)藻工程菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括：

A.聚球藻PCC7002的psbC基因缺失突變體△psbC的構(gòu)建：通過PCR和酶切連接技術(shù)獲得“psbC基因上游同源臂T1—選擇性標(biāo)記基因—psbC基因下游同源臂T2”的DNA片段，將該DNA片段轉(zhuǎn)入野生型聚球藻PCC7002中，利用同源雙交換，使選擇性標(biāo)記基因替換預(yù)期滅活的psbC基因，得到聚球藻PCC7002的△psbC突變體；

B.整合載體的構(gòu)建：PCR擴(kuò)增聚球藻PCC7002內(nèi)源質(zhì)粒pAQ3的兩段同源片段FlanKA和FlanKB、藍(lán)細(xì)菌啟動(dòng)子P₁、多克隆位點(diǎn)MCS、啟動(dòng)子P₂、psbC基因，然后用酶切連接的方式構(gòu)建“FlanKA—P₁—MCS—P₂—psbC—FlanKB”這一排列順序的DNA片段，將該DNA片段連入一質(zhì)粒載體中，得到整合載體。

在聚球藻PCC7002的△psbC突變體的構(gòu)建中，所述選擇性標(biāo)記基因常用的是抗生素抗性基因，例如kan抗性基因。

在整合載體的構(gòu)建中，所述“FlanKA—P₁—MCS—P₂—psbC—FlanKB”DNA片段連入的質(zhì)粒載體可以是各種系列的原核表達(dá)載體，例如質(zhì)粒pGEM-7zf。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種利用上述藍(lán)藻工程菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因的方法，包括以下步驟：

1)將外源基因插入整合載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)，得到表達(dá)載體；

2)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化聚球藻PCC7002的△psbC突變體，在無甘油培養(yǎng)基上篩選出陽性菌株，然后利用無甘油培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性菌株并檢測(cè)外源基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)無抗生素培養(yǎng)來表達(dá)外源基因的目的。

上述步驟2)所述無甘油培養(yǎng)基通常是無甘油的普通A⁺培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件一般是在25℃、1％CO₂空氣、50μE/m^2.s的光強(qiáng)下。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，將這種方法應(yīng)用在表達(dá)GFP蛋白上，發(fā)現(xiàn)利用這種方法得到的工程菌能在無抗生素的培養(yǎng)條件下高效持續(xù)表達(dá)GFP蛋白并且其生長(zhǎng)速度與野生型菌株相近。這些結(jié)果證明了本發(fā)明具有實(shí)際可行性。

本發(fā)明可以讓藍(lán)藻不用依賴抗生素培養(yǎng)壓力來高效表達(dá)外源基因，這不僅可以縮短培養(yǎng)時(shí)間并大大降低利用藍(lán)藻做生物反應(yīng)器的成本，更可以減少因抗生素造成的環(huán)境污染和不安全性。

附圖說明

圖1.聚球藻(Synechococcus sp.)PCC 7002的psbC基因缺失突變體△psbC構(gòu)建的原理圖(A)及Southern鑒定結(jié)果(B)。

圖2.外源基因表達(dá)整合載體pAQ3-Ex和試驗(yàn)表達(dá)載體pAQ3-egfp的構(gòu)建示意圖，其中：A為聚球藻PCC7002內(nèi)源質(zhì)粒pAQ3示意圖：FlanKA和FlanKB指兩個(gè)同源片段，交換區(qū)域在C0006和C0007基因間區(qū)；B為整合載體pAQ3-Ex的構(gòu)建示意圖，其中所示的酶切位點(diǎn)均為單一酶切位點(diǎn)；C為外源試驗(yàn)基因egfp插入整合載體后得到表達(dá)載體pAQ3-egfp示意圖；D為試驗(yàn)表達(dá)載體pAQ3-egfp與聚球藻PCC7002內(nèi)源質(zhì)粒pAQ3發(fā)生雙交換同源重組示意圖。

圖3.pAQ3-EGFP陽性菌株的純合驗(yàn)證、GFP蛋白表達(dá)驗(yàn)證、熒光顯微鏡觀察、生長(zhǎng)速度的測(cè)定結(jié)果。其中，A為PCR檢測(cè)pAQ3-EGFP陽性純合菌株實(shí)驗(yàn)結(jié)果，M：DNA marker，WT：野生型，△psbC：psbC基因缺失突變體，1：沒有純合的pAQ3-EGFP陽性菌株，2：已經(jīng)純合的pAQ3-EGFP陽性菌株；B顯示W(wǎng)estern blotting檢測(cè)pAQ3-EGFP純合陽性菌株有GFP蛋白的表達(dá)，采用GFP蛋白單克隆抗體；C為熒光顯微鏡顯示pAQ3-EGFP純合陽性菌株有GFP熒光，表示其有GFP蛋白表達(dá)，WT表示野生型，BF表示顯微鏡明場(chǎng)，PF表示藻膽體色素?zé)晒猓珿FP表示綠色熒光；D為野生型(圓形)、△psbC(正方形)、純合陽性菌株(三角形)的生長(zhǎng)曲線，每個(gè)點(diǎn)均為三個(gè)獨(dú)立樣品的平均值。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。

pBS載體：購自Stratagene公司，產(chǎn)品目錄號(hào)：ST212207。大腸桿菌HB101：購自takara公司，產(chǎn)品目錄號(hào)：D9051。藍(lán)細(xì)菌Synechococcus sp.PCC 7002及其衍生的突變體，生長(zhǎng)于A⁺液體或者固體培養(yǎng)基中。A⁺固體培養(yǎng)基：在A⁺液體培養(yǎng)基中加入瓊脂，使其終濃度為1.2％(質(zhì)量百分含量)。液體培養(yǎng)時(shí)，以照明日光燈光源，光強(qiáng)為100uE/m²·s，溫度30℃，并通以含1％CO₂(v/v)的空氣。用于選擇生長(zhǎng)所用的卡那霉素Kan⁺抗生素濃度為：100μg/mL，甘油濃度為：1mg/mL。

實(shí)驗(yàn)用的大腸桿菌菌株DH5α生長(zhǎng)于常規(guī)的LB培養(yǎng)基，選擇生長(zhǎng)所用的抗生素濃度分別為：100μg/mL Amp⁺，50μg/mLKan⁺。實(shí)驗(yàn)所用其他原始質(zhì)粒pet-15b、PUC-19、pGEM-7zf均購買于生物技術(shù)公司，常見于市面。

A⁺培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基含

另加維生素V_B12(4μg/mL)。

上述Trace metal mix含有H₃BO₃ 2.860mg/L，MnCl₂·4H₂O 1.810mg/L，ZnSO₄·7H₂O0.222mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.390mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.079mg/L，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0494mg/L。

實(shí)施例1、工程菌系統(tǒng)的制備

(1)構(gòu)建純合pbsC基因缺失突變體△psbC

psbC基因缺失突變體△psbC構(gòu)建的過程原理和流程如圖1中A所示。以藍(lán)細(xì)菌野生型聚球藻Synechococcus sp.PCC 7002(2003年6月由美國賓夕法尼亞州立大學(xué)生化和分子生物系教授Donald A.Bryant教授贈(zèng)送，其來源于法國巴黎的巴斯德研究所藍(lán)藻保藏庫(Pasteur Culture Collection)，1962年由C.Van Baalen在海洋污垢中分離得到)的基因組DNA為模板，用特異性引物對(duì)P1/P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到psbC(A1559)基因的上游片段T1；用特異性引物對(duì)P3/P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到psbC(A1559)基因的下游片段T2；以pBS質(zhì)粒為模版，用引物P5/P6擴(kuò)增出1kb左右大小的kan基因片段；然后將三個(gè)片段同時(shí)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI酶切并回收連接，最終以回收產(chǎn)物作為模版，以P1/P4擴(kuò)增出上游同源片段T1-kan抗性基因-下游同源片段T2約3Kb左右的大片段；后將整個(gè)3Kb左右的大片段轉(zhuǎn)化已經(jīng)能在含甘油A⁺平板上適應(yīng)生長(zhǎng)的野生型聚球藻PCC 7002。在含kan⁺抗性和甘油的A⁺平板上篩選陽性突變體，連續(xù)劃線傳代使得突變體純合。將陽性菌株進(jìn)行Southern鑒定(探針如序列表的序列2所示；探針匹配的是psbC基因上游的約700bp片段，由預(yù)期滅活基因和要替換的卡那基因的大小來進(jìn)行區(qū)別是否已完全由卡那基因替換預(yù)期滅活基因)鑒定結(jié)果表明，陽性菌株已經(jīng)完全看不到野生菌的特異條帶(即該突變體已經(jīng)純合，不含有psbC基因)，將其命名為△psbC，鑒定圖見圖1中B。

(2)外源基因表達(dá)整合載體pAQ3-Ex的構(gòu)建

外源基因表達(dá)整合載體pAQ3-Ex的構(gòu)建如圖2中B所示，其中FlankA和FlankB分別表示聚球藻PCC 7002內(nèi)源質(zhì)粒pAQ3上的同源片段(見圖2中A)。以野生型聚球藻PCC 7002基因組總DNA為模板，利用引物對(duì)P7/P8、P9/P10擴(kuò)增出FlanKA和FlanKB片段，利用引物對(duì)P11/P12、P13/P14擴(kuò)增出P_psbDC和psbC片段；以野生型集胞藻(Synechocystissp.)PCC 6803(2003年6月由美國賓夕法尼亞州立大學(xué)生化和分子生物系教授Donald A.Bryant教授贈(zèng)送，其來源于法國巴黎的巴斯德研究所藍(lán)藻保藏庫(Pasteur Culture Collection)，1968年由R.Kunisawa在淡水中分離得到)基因組總DNA為模版，引物P15/P16擴(kuò)增出啟動(dòng)子P_cpcBA；以質(zhì)粒pet-15b為模版，引物P17/P18擴(kuò)增出His-Tag到T7終止子這一片段多克隆位點(diǎn)(MCS)；然后將FlanKA、P_cpcBA、MCS、P_psbDC四個(gè)片段同時(shí)用SpeⅠ、NcoⅠ、NheⅠ酶切回收連接，以最終回收產(chǎn)物作為模版，以P7/P12擴(kuò)增出FlanKA-P_cpcBA-MCS-P_psbDC這約2.1kb的片段，然后用PstⅠ和SalⅠ連入pUC19質(zhì)粒得到中間質(zhì)粒pUC19-1；psbC、FlanKB兩個(gè)片段同時(shí)用SalⅠ酶切回收連接，以最終回收產(chǎn)物作為模版，P13/P10擴(kuò)增出psbC-FlanKB約2.4kb的片段，然后用SaCⅠ和EcoRⅠ連入pUC19-1質(zhì)粒得到中間質(zhì)粒pUC19-2；以質(zhì)粒pUC19-2為模版，引物對(duì)P7/P10擴(kuò)增出片段1(FlanKA—P_cpcBA—MCS—P_psbDC—psbC—FlanKB)，以質(zhì)粒pGEM-7zf為模版引物對(duì)P19/P20擴(kuò)增出片段2，片段1、2利用EcoRⅠ和PstⅠ酶切連接得到最終整合載體pAQ3-Ex(質(zhì)粒示意見如圖2中B所示)。

(3)無抗生素表達(dá)外源基因的藍(lán)藻工程菌的制備

將想要表達(dá)的外源基因x，利用NdeⅠ和BamHⅠ連入到整合載體pAQ3-Ex最終得到載體pAQ3-x；然后再將載體pAQ3-x轉(zhuǎn)化△psbC，然后在無抗性的A⁺培養(yǎng)基上篩選陽性菌株；劃線傳代培養(yǎng)3-4代，利用引物PCR驗(yàn)證載體pAQ3-x是否已經(jīng)完全整合到△psbC的內(nèi)源質(zhì)粒pAQ3上，將已完全整合的菌株命名為pAQ3-X。而pAQ3-X即是我們制備的能在無抗生素培養(yǎng)壓力下持續(xù)表達(dá)外源基因的藍(lán)藻工程菌株。

實(shí)施例2、利用egfp基因來鑒定本發(fā)明工程菌的可行性

用引物對(duì)P21/P22，擴(kuò)增出egfp基因。用NdeⅠ和BamHⅠ將egfp基因連入pAQ3-Ex整合載體得到試驗(yàn)載體pAQ3-egfp(質(zhì)粒示意圖如圖2中C所示)，pAQ3-egfp(試驗(yàn)載體與pAQ3雙交換的示意圖如圖2中D。將試驗(yàn)載體pAQ3-egfp轉(zhuǎn)化psbC缺失突變株△psbC，在無抗性無甘油的A⁺平板上篩選陽性克隆。陽性克隆在A⁺平板劃線3代后，經(jīng)PCR驗(yàn)證純合(見圖3中A，驗(yàn)證引物對(duì)P23/P24)，將純合的突變株命名為pAQ3-EGFP。

pAQ3-EGFP菌株在無抗性培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)后，經(jīng)蛋白質(zhì)純化后經(jīng)SDS-PAGE和Westren blotting檢測(cè)(圖3中B)，可以證明此純化的蛋白質(zhì)為GFP蛋白，而對(duì)照組WT、△psbC均沒有。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)(圖3中C)，pAQ3-EGFP突變株有綠色熒光，而對(duì)照組沒有。這些結(jié)果都能證明GFP蛋白在pAQ3-EGFP突變株里能高效表達(dá)。

為了驗(yàn)證本平臺(tái)表達(dá)外源基因是否會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)速度，我們分別測(cè)WT、△psbC和pAQ3-EGFP生長(zhǎng)曲線(圖3中D)，在25℃、1％CO₂空氣、50μE/m^2.s的光強(qiáng)下，野生型聚球藻PCC7002的代時(shí)為9h，而突變株pAQ3-EGFP代時(shí)為10.2h，△psbC代時(shí)為21.3h。pAQ3-EGFP和野生型的生長(zhǎng)速度相近，說明psbC基因回復(fù)取得效果，而外源基因的表達(dá)并沒有影響菌體的生長(zhǎng)速率。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)(圖3中C)，pAQ3-EGFP菌株在外形上并沒有和野生型有不同的地方。因此，pAQ3-EGFP突變株不僅能表達(dá)外源基因，并且外源egfp基因的表達(dá)對(duì)藻的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)狀態(tài)沒有太大的影響。

通過本試驗(yàn)載體結(jié)果證明：本整合載體能夠在藍(lán)藻中無抗性培養(yǎng)高效表達(dá)外源基因，并且生長(zhǎng)速度與野生型相近；這也為藍(lán)藻在發(fā)酵工業(yè)化中低成本更安全大規(guī)模表達(dá)外源基因提供了一條途徑。

表1本發(fā)明所用的引物序列