本發(fā)明涉及一種新化合物及其制備方法和其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：根據(jù)全國腫瘤登記中心發(fā)布的2012年數(shù)據(jù)顯示，中國每年新增癌癥病例約350萬，約有250萬人因此死亡。因此對于癌癥病人來說及早檢測出癌癥，及時(shí)治療至關(guān)重要。目前癌癥診療的檢測方法有影像學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、基因、生化檢測等方法。其中X射線、PET-CT、核磁共振成像、胃鏡、結(jié)直腸鏡、細(xì)胞活檢等方法不但費(fèi)用高，還可能對機(jī)體造成損傷。并且根據(jù)這些檢測確認(rèn)為癌癥時(shí)，病人一般都處于癌癥的中后期。利用癌癥患者血清中特異物質(zhì)含量升高，根據(jù)含量值高低輔助判定患者是否罹患癌癥，可以實(shí)現(xiàn)癌癥的早期檢測。目前的癌癥血清學(xué)檢測有酶聯(lián)免疫法，免疫比濁法，基因檢測法、生化檢測等。前幾種方法檢測步驟復(fù)雜，測定時(shí)間長，需要掌握技術(shù)的特定人員操作。酶聯(lián)免疫檢測類容易受到血漿、血清蛋白以及其他抗體和代謝物的干擾?；蛟\斷類試劑盒檢測費(fèi)用高，對操作的技術(shù)要求比較高。唾液酸(SA)是細(xì)胞表面糖蛋白和糖脂的重要成份，它與細(xì)胞間的粘著、接觸抑制，細(xì)胞的癌變及腫瘤轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散有密切的關(guān)系。當(dāng)細(xì)胞癌變時(shí)，腫瘤細(xì)胞表面唾液酸密度增加，很多糖蛋白唾液酸化，大量SA脫落進(jìn)入血液循環(huán)，故癌癥病人血清SA含量明顯升高。羥脯氨酸作為膠原蛋白中的特異性氨基酸，可以反映機(jī)體中膠原蛋白含量的變化，在腫瘤疾病進(jìn)展過程中會破壞基底膜，基底膜中膠原釋放入血，使血清中羥脯氨酸含量升高，骨腫瘤也會破壞大量膠原，使羥脯氨酸含量升高；除此之外，多數(shù)晚期腫瘤病人由于轉(zhuǎn)移等會大量破壞組織膠原，也會使血清中羥脯氨酸的含量急劇升高，故測定血液中游離羥脯氨酸含量對腫瘤的診斷有重要臨床意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種新型的化合物，可以簡單、方便地用于癌癥的早期檢測，且不會對人體造成損傷。本發(fā)明的化合物，結(jié)構(gòu)式如式(I)所示：該化合物分子式為C17H13NO5，其分子量為311.0794，外觀為黃色，在450nm處有最大吸收峰。本發(fā)明還提供式(I)化合物的制備方法，步驟如下：(1)將0.1mL5mg/mL的唾液酸和2mL顯色劑充分混勻后置沸水浴(持續(xù)沸騰)中反應(yīng)15min，迅速取出置于室溫水(<25℃)中冷卻3-8min，所述顯色劑組份為：茚三酮0.005-4％，對二甲氨基苯甲醛0.005-3％，HCl2-20％，余量為純化水，其中的百分比均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)；(2)將上述制備得到的液體過0.22μm微孔濾膜；(3)將上述過濾后的液體，進(jìn)高效液相色譜儀，采用KromasilC18色譜柱，以40％乙腈/水為流動(dòng)相進(jìn)行高效液相色譜純化分離，按式(I)化合物色譜峰出峰時(shí)間9.49min收集餾分，合并收集液后40-50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮以去掉溶劑，獲得純化后的式(I)化合物。所述40％乙腈/水為乙腈：水的體積比40％：60％的溶液。本發(fā)明還提供了式(I)化合物在癌癥檢測中作為顯色指示劑的應(yīng)用。進(jìn)一步地，式(I)化合物作為顯色指示劑應(yīng)用時(shí)，用純化水配制成顯色指示劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中：式(I)化合物0.01％-3％、HCl0.1-20％、苯甲酸0.05-5％、余量為水，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。本發(fā)明還提供了式(I)化合物在癌癥檢測制品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種癌癥檢測制品，包括顯色劑和校準(zhǔn)品，所述顯色劑包括以下組份：茚三酮0.005-4％，對二甲氨基苯甲醛0.005-3％，HCl2-20％，余量為純化水，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)；所述校準(zhǔn)品為式(I)化合物制成的顯色指示劑標(biāo)準(zhǔn)溶液。本發(fā)明還提供了上述癌癥檢測制品的檢測方法，步驟如下：(1)取待測血清0.1mL加到含2.0mL顯色劑的離心管中，充分混勻，將離心管置沸水浴(能夠保持持續(xù)沸騰)中反應(yīng)15分鐘；(2)迅速取出離心管置于室溫水(<25℃)中冷卻3-8分鐘，終止反應(yīng)；(3)離心管以2500-3500轉(zhuǎn)/分離心5-15分鐘，去沉淀，取上清液；(4)分別測定血清上清液及校準(zhǔn)品在450nm處的吸光光度值，得到BXTM值＝(血清的吸光光度值/校準(zhǔn)品的吸光光度值)×100U/mL；或者直接用半自動(dòng)生化分析儀測定校準(zhǔn)品和血清上清液的BXTM值；(5)BXTM值＜95U/mL時(shí)初判為癌癥陰性，BXTM值≥95U/mL時(shí)初判為癌癥陽性，對初判為癌癥陽性的需要結(jié)合病史、家族史進(jìn)行影像學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)檢查確診。本發(fā)明還提供了另外一種癌癥檢測制品，包括顯色劑和校準(zhǔn)品，所述顯色劑包括以下組份：茚三酮0.005-4％，對二甲氨基苯甲醛0.005-3％，HCl2-20％，余量為純化水；所述校準(zhǔn)品為以下三種中的一種：(1)唾液酸苯甲酸溶液：唾液酸0.01％-5％，苯甲酸0.05％-7.5％，余量為純化水；(2)羥脯氨酸苯甲酸溶液：羥脯氨酸0.03％-4.5％，苯甲酸0.05％-7.5％，余量為純化水；(3)唾液酸羥脯氨酸苯甲酸溶液：唾液酸與羥脯氨酸共0.01％-3％、其中唾液酸與羥脯氨酸的質(zhì)量比為1:8-15，苯甲酸0.05％-7.5％，余量為純化水；各組分用量均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。本發(fā)明還提供了上述癌癥檢測制品的檢測方法，步驟如下：(1)取待測血清及校準(zhǔn)品各0.1mL分別加到不同的含2.0mL顯色劑的離心管中，充分混勻，將離心管置沸水浴(能夠保持持續(xù)沸騰)中反應(yīng)15分鐘；(2)迅速取出離心管置于室溫水(<25℃)中冷卻3-8分鐘，終止反應(yīng)；(3)離心管以2500-3500轉(zhuǎn)/分離心5-15分鐘，去沉淀，取上清液；(4)分別測定血清上清液及校準(zhǔn)品上清液在450nm處的吸光光度值，得到BXTM值＝(血清的吸光光度值/校準(zhǔn)品的吸光光度值)×100U/mL；或者直接用半自動(dòng)生化分析儀測定校準(zhǔn)品和血清上清液的BXTM值。(5)BXTM值＜95U/mL時(shí)初判為癌癥陰性，BXTM值≥95U/mL時(shí)初判為癌癥陽性，對初判為癌癥陽性的需要結(jié)合病史、家族史進(jìn)行影像學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)檢查確診。步驟(1)中嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間為15分鐘，沸水浴，繼而通過步驟(2)將反應(yīng)終止，時(shí)間過長或過短都會造成陽性率降低，而假陽性率升高。步驟(3)中通過離心去沉淀把大部分影響檢測結(jié)果的大分子雜蛋白去除，使信噪比大幅度提升。上述癌癥檢測制品用于檢測的原理為：根據(jù)癌癥早期患者血清中大量的唾液酸與顯色劑反應(yīng)生成式(I)化合物，其在450nm處有最大吸收峰。校準(zhǔn)品中的唾液酸或羥脯氨酸均可以與顯色劑反應(yīng)生成黃色化合物，唾液酸與顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生的化合物及羥脯氨酸與顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生的化合物均在450nm處有最大吸收峰，因此可以作為校準(zhǔn)品使用。根據(jù)測得的血清與校準(zhǔn)品的吸光光度值確定BXTM值，當(dāng)BXTM值大于95U/mL時(shí)，初步判斷體檢者為癌癥陽性。需要根據(jù)病史和家族史，做影像學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的檢查，確定是否患了癌癥。如果不做血清檢測，身體出現(xiàn)不適癥狀再去檢查一般已經(jīng)到癌癥的中晚期，而本發(fā)明的化合物及方法可以用于癌癥的早期輔助檢測。BXTM值的計(jì)得過程為：待測者血清吸光值除以本發(fā)明所述式(I)化合物的吸光值，再乘以100U/mL，即得出測定者血清羥脯氨酸、唾液酸含量的值。定義校準(zhǔn)品的吸光度值為100U/mL，根據(jù)超過2000例的正常人、非癌疾患、腫瘤患者臨床檢測結(jié)果的ROC曲線分析得出Cutoff值為95U/mL。本發(fā)明的式(I)化合物在450nm下達(dá)到最大的吸光值，利用該化合物的吸光特性可以達(dá)到快速精確的測定早期癌癥病人血清中的唾液酸及羥脯氨酸的目的，從而實(shí)現(xiàn)癌癥病人血清中標(biāo)志物的快速定量分析。相比酶聯(lián)免疫法、基因檢測法敏感性低，操作復(fù)雜，基于本發(fā)明化合物的研究的檢測方法操作簡便，結(jié)果出示快速，根據(jù)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對肺癌、食管癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、喉癌、甲狀腺癌、肝癌，泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)腫瘤及其他腫瘤等的檢測效果有較高的敏感性和特異性。本發(fā)明的試劑檢測方法步驟簡單，容易操作，檢測所需時(shí)間短，在癌癥早期發(fā)生時(shí)，可以同時(shí)檢測唾液酸、羥脯氨酸兩種物質(zhì)，靈敏度，特異度高，適用于癌癥的各個(gè)時(shí)期檢測。本發(fā)明癌癥檢測制品的穩(wěn)定性好，可穩(wěn)定存放14個(gè)月以上。附圖說明圖1：唾液酸與顯色劑混合的RP-HPLC色譜圖(40％乙腈/水，254nm)；圖2：唾液酸與顯色劑反應(yīng)的RP-HPLC色譜圖(40％乙腈/水，254nm)；圖3：唾液酸與顯色劑混合的RP-HPLC色譜圖(40％乙腈/水，450nm)；圖4：唾液酸與顯色劑反應(yīng)的RP-HPLC色譜圖(40％乙腈/水，450nm)；圖5：唾液酸與顯色劑反應(yīng)前后的HPLC-MS色譜圖比較(254nm)(A-加熱反應(yīng)樣品；B-混合樣品)；圖6：唾液酸與顯色劑反應(yīng)后的HPLC-MS色譜圖(450nm)；圖7：唾液酸與顯色劑反應(yīng)產(chǎn)物在8.2min的質(zhì)譜圖(A-正離子模式；B-負(fù)離子模式)；圖8：唾液酸與顯色劑反應(yīng)產(chǎn)物收集后的ESI-MS分析(負(fù)離子模式)；圖9：實(shí)施例4的癌癥檢測制品及CEA檢測結(jié)直腸癌及結(jié)直腸腺瘤ROC曲線。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1取0.1mL的5mg/mL的唾液酸和2mL的顯色劑(茚三酮1.9％，對二甲氨基苯甲醛1.4％，HCl9.2％，余量為純化水)，將二者充分混勻后再置沸水浴(持續(xù)沸騰)中準(zhǔn)確反應(yīng)15min，迅速取出置于室溫水(<25℃)中冷卻5min；將上述制備得到的液體過0.22μm微孔濾膜，得到反應(yīng)樣品。取0.1mL的5mg/mL的唾液酸和2mL的顯色劑(茚三酮1.9％，對二甲氨基苯甲醛1.4％，HCl9.2％，余量為純化水)，將二者混勻，過0.22μm微孔濾膜，得到混合樣品。將上述過濾后的制備液和混合液，進(jìn)高效液相色譜儀，以40％乙腈/水為流動(dòng)相進(jìn)行高效液相色譜純化分離，根據(jù)254nm和450nm分離所得色譜峰效果確定分離適合條件，254nm處的RP-HPLC色譜圖分別如圖1-2所示；在450nm處的RP-HPLC色譜圖分別如圖3-4所示。按新產(chǎn)物色譜峰出峰時(shí)間9.49min收集餾分，合并收集液后45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，獲得純化后的化合物。將上述過濾過的唾液酸與顯色劑的反應(yīng)與混合樣品，用高效液相色譜儀(含有2996型PDA二極管陣列檢測器)與離子阱質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)聯(lián)合分析。在254nm處的紫外吸收進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)唾液酸與顯色劑反應(yīng)后，在8.2min處增加了1個(gè)新產(chǎn)物的色譜峰，如圖5-6所示；在正離子模式出現(xiàn)了[M+H]+＝312.1的離子峰，在負(fù)離子模式中出現(xiàn)了m/z310.1的離子峰[M-H]-，表明含有分子量M為311.1的化合物，如圖7所示。取體積比1:1(V/V)的乙腈和水溶解上述純化后的化合物，采用電噴霧質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，如圖8所示，出現(xiàn)了很干凈的分子離子峰[M-H]-＝310.07，表明其分子量M為311.0～311.1，與上述反應(yīng)產(chǎn)物在液質(zhì)聯(lián)用分析中分子量結(jié)構(gòu)吻合。因此，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的LC-MS和ESI-MS的綜合分析，可以確定該反應(yīng)產(chǎn)物的分子量為370.0～370.1。采用質(zhì)譜軟件進(jìn)行計(jì)算和檢索，確定分子式為C17H13O5N，結(jié)構(gòu)式為：實(shí)施例2將本發(fā)明的式(I)化合物利用分光光度設(shè)備全波長掃描發(fā)現(xiàn)在450nm產(chǎn)生最大吸收峰，產(chǎn)生特定的吸光值。本發(fā)明的式(I)化合物可利用標(biāo)準(zhǔn)比較法測定患者血清中唾液酸和羥脯氨酸含量。血清樣本來源為醫(yī)院確診為癌癥的患者，健康體檢者以及良性疾病患者的血清，其中癌癥患者(肺癌、食管癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌，泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)腫瘤及其他腫瘤)791例，健康對照者及良性疾病患者1148例。癌癥檢測制品的準(zhǔn)備：顯色劑的配制：茚三酮1.9％，對二甲氨基苯甲醛1.4％，HCl9.2％，余量為純化水。校準(zhǔn)品溶液的配置：將實(shí)施例1純化的式(I)化合物作溶質(zhì)用純化水配置成溶液，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％，HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)12％，苯甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5％。待測血清樣本的檢測：(1)取待測血清0.1mL加到含2.0mL顯色劑的離心管中，充分混勻，將離心管置沸水浴(能夠保持持續(xù)沸騰)中反應(yīng)15分鐘；(2)迅速取出離心管置于室溫水(<25℃)中冷卻5分鐘，終止反應(yīng)；(3)離心管以3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去沉淀，取上清液；(4)分別測定校準(zhǔn)品溶液以及與顯色劑反應(yīng)后的血清在450nm處的吸光光度值，得到BXTM值＝(血清的吸光光度值/校準(zhǔn)品的吸光光度值)×100U/mL；(5)BXTM值≥95U/mL時(shí)初判為癌癥陽性，BXTM值＜95U/mL時(shí)初判為癌癥陰性。定義校準(zhǔn)品的吸光度值為100U/mL。根據(jù)臨床檢測結(jié)果ROC曲線分析確定Cutoff值為95U/mL。(6)如表1所示，在臨床試驗(yàn)中，腫瘤組靈敏度(陽性率)達(dá)78％，非癌疾病組特異度達(dá)85.10％。符合率是篩檢試驗(yàn)判定的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)診斷的結(jié)果相同的數(shù)占總受檢人數(shù)的比例。從結(jié)果可看，試劑盒的符合率達(dá)82.21％，與標(biāo)準(zhǔn)診斷的結(jié)果非常相近。腫瘤組與健康及其他良性疾患的檢測結(jié)果有顯著的差異，說明本發(fā)明可為腫瘤疾病診斷提供依據(jù)，并具良好的效果。表1實(shí)施例2的癌癥檢測制品對腫瘤病人血清臨床檢測數(shù)據(jù)結(jié)果膽紅素、血脂、溶血對實(shí)施例2的癌癥檢測制品的干擾實(shí)驗(yàn)：通過對血清中分別添加膽紅素，膽固醇，甘油三酯，血紅蛋白，配制成不同濃度梯度的血清，測定BXTM值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)血清中膽紅素含量小于684μmol/L，膽固醇含量小于15mmol/L，甘油三酯含量小于6mmol/L，血紅蛋白含量小于5mg/mL時(shí)，其對測定結(jié)果無影響。實(shí)際上，臨床血清標(biāo)本中存在干擾物濃度都會遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于以上數(shù)值，所以可認(rèn)為以上干擾因素對測定結(jié)果基本無影響。將實(shí)施例2的癌癥檢測制品在儲存條件下放置十四個(gè)月，檢測產(chǎn)品的酸度、精密性、線性、準(zhǔn)確度，最低檢出量各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果均符合要求。將實(shí)施例2的癌癥檢測制品在37℃條件下放置一周，檢測產(chǎn)品的酸度、精密性、線性、準(zhǔn)確度，最低檢出量各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果均符合要求。實(shí)施例3血清樣本來源為醫(yī)院良性腫瘤患者、健康體檢者以及確診為癌癥患者的血清，其中癌癥患者(肺癌、食管癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌)760例，健康對照者120例及非癌良性疾病患者100例。癌癥檢測制品的準(zhǔn)備：顯色劑的配制：茚三酮0.009％，對二甲氨基苯甲醛0.012％，HC13.8％，余量為純化水。校準(zhǔn)品唾液酸苯甲酸溶液的配置：唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5％，苯甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％，余量為純化水。(1)取待測血清及校準(zhǔn)品各0.1mL分別加到不同的含2.0mL顯色劑的離心管中，充分混勻，將離心管置沸水浴(能夠保持持續(xù)沸騰)中反應(yīng)15分鐘。(2)迅速取出離心管置于室溫水(<25℃)中冷卻5分鐘，終止反應(yīng)。(3)離心管以3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去沉淀，取上清液。(4)用半自動(dòng)生化分析儀分別測定血清上清液及校準(zhǔn)品上清液的BXTM值。(5)BXTM值≥95U/mL時(shí)初判為癌癥陽性，BXTM值＜95U/mL時(shí)初判為癌癥陰性。定義校準(zhǔn)品的吸光度值為100U/mL，根據(jù)臨床檢測結(jié)果ROC曲線法確定Cutoff值為95U/mL。(6)對全部的980例受試者進(jìn)行影像學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)檢測確診，發(fā)現(xiàn)癌癥病患與健康者，癌癥病患與非癌良性疾病患者使用本發(fā)明試劑檢測結(jié)果具有極顯著差異(P<0.01)，同時(shí)癌癥患者總陽性率達(dá)78.29％，特異度達(dá)85.91％，其中肺癌、胃癌、卵巢癌的靈敏度超過80％(表2)，說明可為腫瘤疾病診斷提供依據(jù)，并具良好的效果。表2實(shí)施例3的癌癥檢測制品對腫瘤病人血清臨床檢測的結(jié)果組別靈敏度(％)特異度(％)肺癌83.0——食管癌72.6——胃癌82.5——宮頸癌79.4——卵巢癌88——結(jié)直腸癌73.5——乳腺癌70.0——癌癥患者合計(jì)78.29——健康人及非癌疾患85.91膽紅素、血脂、溶血對實(shí)施例3的癌癥檢測制品的干擾實(shí)驗(yàn)：通過對血清中分別添加膽紅素，膽固醇，甘油三酯，血紅蛋白，配制成不同濃度梯度的血清，測定BXTM值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)血清中膽紅素含量小于684μmol/L，膽固醇含量小于15mmol/L，甘油三酯含量小于6mmol/L，血紅蛋白含量小于5mg/mL時(shí)，其對測定結(jié)果無影響。實(shí)際上，臨床血清標(biāo)本中存在干擾物濃度都會遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于以上數(shù)值，所以可認(rèn)為以上干擾因素對測定結(jié)果基本無影響。將實(shí)施例3的癌癥檢測制品在儲存條件下放置十四個(gè)月，檢測產(chǎn)品的酸度、精密性、線性、準(zhǔn)確度，最低檢出量各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果均符合要求。將實(shí)施例3的癌癥檢測制品在37℃條件下放置一周，檢測產(chǎn)品的酸度、精密性、線性、準(zhǔn)確度，最低檢出量各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果均符合要求。實(shí)施例4血清樣本來源為醫(yī)院確診為癌癥患者、健康體檢者以及良性疾病患者的血清，其中癌癥患者(肺癌、食管癌、胃癌、宮頸癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、喉癌、甲狀腺癌、肝癌)3160例，健康對照者543例及良性疾病患者304例。癌癥檢測制品的準(zhǔn)備：顯色劑的配制：茚三酮0.6％，對二甲氨基苯甲醛1％，HCl8％，余量為純化水。校準(zhǔn)品羥脯氨酸苯甲酸溶液的配置：羥脯氨酸2％，苯甲酸4.5％，余量為純化水。(1)取待測血清及校準(zhǔn)品各0.1mL分別加到含2.0mL顯色劑的離心管中，充分混勻，將離心管置沸水浴(能夠保持持續(xù)沸騰)中反應(yīng)15分鐘；(2)迅速取出離心管置于室溫水(<25℃)中冷卻5分鐘，終止反應(yīng)；(3)離心管以3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去沉淀，取上清液；(4)分別測定血清上清液及校準(zhǔn)品上清液在450nm處的吸光光度值，得到BXTM值；(5)BXTM值≥95U/mL時(shí)初判為癌癥陽性，BXTM值＜95U/mL時(shí)初判為癌癥陰性。定義校準(zhǔn)品的吸光度值為100U/mL，根據(jù)臨床檢測結(jié)果ROC曲線法確定Cutoff值為95U/mL。(6)對全部的4007例受試者進(jìn)行影像學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)檢測確診，發(fā)現(xiàn)癌癥病患與健康者，癌癥病患與非癌良性疾病患者使用本發(fā)明試劑檢測的，結(jié)果和一致性均具有極顯著差異(P<0.01)。如表3所示，全部受試者中本發(fā)明試劑檢測結(jié)果和臨床診斷的符合率為79.36％，靈敏度為77.31％，特異度為87.01％，說明本制品具有較好的輔助診斷效果。陽性預(yù)測值指篩檢試驗(yàn)檢出的全部陽性例數(shù)中，真正“有病”的例數(shù)(真陽性)所占的比例，它反映的是篩檢試驗(yàn)結(jié)果陽性者患目標(biāo)疾病的可能性，本結(jié)果中陽性預(yù)測值比較高，說明判斷陽性的真陽性的準(zhǔn)確性很高。如表4所示，在對腫瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分期病人的檢測中，靈敏度(陽性率)分別達(dá)72.92％、75.70％、75.76％、89.91％，表明該發(fā)明的檢測方法對腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)具有較高的價(jià)值。表3實(shí)施例4的癌癥檢測制品與臨床診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性評價(jià)表符合率靈敏度特異度假陽性率陽性預(yù)測值79.36％77.31％87.01％12.99％95.69％表4實(shí)施例2的癌癥檢測制品對不同分期腫瘤病人血清臨床檢測的陽性率結(jié)果在結(jié)直腸癌(CRC)的檢測中，檢測結(jié)果與CEA(癌胚抗原)對比，實(shí)施例4的癌癥檢測制品的結(jié)直腸癌與結(jié)直腸腺瘤ROC曲線線下面積為0.881，高于CEA的ROC曲線線下面積0.804(圖9)。如表6所示靈敏度和準(zhǔn)確性也高于CEA，說明實(shí)施例4癌癥檢測制品具有較高的輔助診斷效果。如表5所示，用實(shí)施例4的癌癥檢測制品檢測結(jié)直腸息肉組，結(jié)直腸腺瘤組與結(jié)直腸癌組，與健康人均有差異，結(jié)直腸癌與腺瘤組，息肉組也具有顯著差異，結(jié)直腸腺瘤做為結(jié)直腸癌的癌前病變可以被輔助檢測，說明實(shí)施例4的癌癥檢測制品在CRC早期診斷及預(yù)防中有比較高的價(jià)值。表5實(shí)施例4的癌癥檢測制品在檢測結(jié)直腸息肉、腺瘤、惡性腫瘤陽性例數(shù)及差異性指標(biāo)表6實(shí)施例4的癌癥檢測制品與CEA檢測結(jié)果特性對照表靈敏度特異度準(zhǔn)確性實(shí)施例4制品74.888.282.1CEA47.197.374.5在卵巢癌的檢測中，用實(shí)施例4的癌癥檢測制品的檢測結(jié)果與HE4(人副睪蛋白4)、CA125(糖類抗原CA125)比較，ROC曲線面積相當(dāng)，說明與常用的這兩個(gè)檢測指標(biāo)相比，檢測結(jié)果一致，而實(shí)施例4的癌癥檢測制品的靈敏度為87％，HE4的靈敏度為75.3％，CA125的靈敏度為81.8％(表7)，說明與常用指標(biāo)HE4和CA125相比，在診斷卵巢癌中具有更高的靈敏度。表7實(shí)施例4的癌癥檢測制品與HE4、CA125檢測結(jié)果靈敏度(陽性率)對照表實(shí)施例4制品HE4CA125靈敏度87％75.3％81.8％ROC曲線AUC0.9070.9000.880膽紅素、血脂、溶血對實(shí)施例4的癌癥檢測制品的干擾實(shí)驗(yàn)：通過對血清中分別添加膽紅素，膽固醇，甘油三酯，血紅蛋白，配制成不同濃度梯度的血清，測定BXTM值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)血清中膽紅素含量小于684μmol/L，膽固醇含量小于15mmol/L，甘油三酯含量小于6mmol/L，血紅蛋白含量小于5mg/mL時(shí)，其對測定結(jié)果無影響。實(shí)際上，臨床血清標(biāo)本中存在干擾物濃度都會遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于以上數(shù)值，所以可認(rèn)為以上干擾因素對測定結(jié)果基本無影響。將實(shí)施例4的癌癥檢測制品在儲存條件下放置十四個(gè)月，檢測產(chǎn)品的酸度、精密性、線性、準(zhǔn)確度，最低檢出量各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果均符合要求。將實(shí)施例4的癌癥檢測制品在37℃條件下放置一周，檢測產(chǎn)品的酸度、精密性、線性、準(zhǔn)確度，最低檢出量各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果均符合要求。實(shí)施例5血清樣本來源為醫(yī)院確診為癌癥的患者、健康體檢者以及良性疾患的血清，其中癌癥患者(肺癌、肝癌、食管癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、血液系統(tǒng)腫瘤、其他系統(tǒng)腫瘤)342例，健康對照者54例及良性疾病患者34例。癌癥檢測制品的準(zhǔn)備：顯色劑的配制：茚三酮3.8％，對二甲氨基苯甲醛2.8％，HCl18.4％，余量為純化水。校準(zhǔn)品唾液酸羥脯氨酸苯甲酸溶液的配置：唾液酸與羥脯氨酸在溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.75％(唾液酸與羥脯氨酸的質(zhì)量比為1:10)，苯甲酸質(zhì)量百分?jǐn)?shù)4.75％，余量為純化水。(1)取待測血清及校準(zhǔn)品各0.1mL分別加到含2.0mL顯色劑的離心管中，充分混勻，將離心管置沸水浴(能夠保持持續(xù)沸騰)中反應(yīng)15分鐘；(2)迅速取出離心管置于室溫水(<25℃)中冷卻5分鐘，終止反應(yīng)；(3)離心管以3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去沉淀，取上清液；(4)用半自動(dòng)生化分析儀分別測定血清上清液及校準(zhǔn)品上清液的BXTM值。(5)BXTM值≥95U/mL時(shí)初判為癌癥陽性，BXTM值＜95U/mL時(shí)初判為癌癥陰性。定義校準(zhǔn)品的吸光度值為100U/mL，根據(jù)臨床檢測結(jié)果ROC曲線法確定Cutoff值為95U/mL。(6)對全部的416例受試者進(jìn)行影像學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)檢測確診，發(fā)現(xiàn)癌癥病患與健康者，癌癥病患與非癌良性疾病患者使用本發(fā)明試劑檢測結(jié)果均具有極顯著差異(P<0.01)，靈敏度達(dá)77.48％，特異度達(dá)86.36％(表8)，說明可為腫瘤疾病診斷提供依據(jù)，并具良好的效果。表8實(shí)施例5的癌癥檢測制品對腫瘤病人血清臨床檢測結(jié)果組別靈敏度(％)特異度(％)肺癌79.09——肝癌73.03——結(jié)直腸癌73.33——卵巢癌88.89——乳腺癌72.88——食道癌1/1——胃癌95.24——血液系統(tǒng)腫瘤100其他惡性腫瘤70健康者及良性疾患——86.36合計(jì)77.48——膽紅素、血脂、溶血對實(shí)施例5的癌癥檢測制品的干擾實(shí)驗(yàn)：通過對血清中分別添加膽紅素，膽固醇，甘油三酯，血紅蛋白，配制成不同濃度梯度的血清，測定BXTM值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)血清中膽紅素含量小于684μmol/L，膽固醇含量小于15mmol/L，甘油三酯含量小于6mmol/L，血紅蛋白含量小于5mg/mL時(shí)，其對測定結(jié)果無影響。實(shí)際上，臨床血清標(biāo)本中存在干擾物濃度都會遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于以上數(shù)值，所以可認(rèn)為以上干擾因素對測定結(jié)果基本無影響。將實(shí)施例5的癌癥檢測制品在儲存條件下放置十四個(gè)月，檢測產(chǎn)品的酸度、精密性、線性、準(zhǔn)確度，最低檢出量各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果均符合要求。將實(shí)施例5的癌癥檢測制品在37℃條件下放置一周，檢測產(chǎn)品的酸度、精密性、線性、準(zhǔn)確度，最低檢出量各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果均符合要求。當(dāng)前第1頁1 2 3