本發(fā)明涉及一種用于防控雞新城疫病毒(NDV)的特異性抗病毒肽核酸(反義寡核苷酸)，尤其是涉及含有該反義核酸序列的藥物組合物，及其在動物藥物上的用途。
背景技術(shù)：
新城疫(Newcastle Disease，ND)由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)感染引起的一種以呼吸道、消化道粘膜出血為典型病變的高度接觸性、急性敗血性禽類傳染病。該病毒主感染雞、珠雞和火雞等，最少有200多種鳥能夠被感染，成為目前危害世界養(yǎng)禽業(yè)的極易傳染的兩大毀滅性疾病之一。ND對感染禽類的危害極為嚴(yán)重，因而世界各國均對其采取嚴(yán)格防范措施。被國際獸疫局OIE列為對畜禽危害最大的A類傳染病之一。自1926年從印度瓜哇分離到NDV以來，NDV曾在世界范圍內(nèi)造成4次大規(guī)模的流行。首次大暴發(fā)起源于東南亞和英國，持續(xù)時間從1926到1960年，歷時近30年，此次流行主要由基因Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型引起，該毒株未流入美國。隨著NDV疫苗的廣泛使用,此次大流行逐漸平息。第二次大流行始于20世紀(jì)60年代的遠東，此次大流行主要由基因Ⅴ型和Ⅵ型引起，在短短的4年時間便由南美洲和印尼傳入歐美等國家和地區(qū)，引起全球流行，主要原因與畜禽國際貿(mào)易密切相關(guān)。第三次流行始于1974年前后，疫源地尚無定論現(xiàn)在大多數(shù)學(xué)者認為是由鴿源新城疫病毒引起的。第四次流行發(fā)生于亞洲、中東、非洲、南美和歐洲，并一直流傳至今，此次流行主要由新基因Ⅶ型引起的。特別是20世紀(jì)90年代后期，該病在世界范圍內(nèi)對養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。介于ND自然宿主眾多，流行范圍廣，因而對禽類養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重，加上大老規(guī)模的強制使用疫苗，在臨床上該病毒常表現(xiàn)為非典型癥狀。目前國內(nèi)外獸醫(yī)面研究人員對NDV的流行特點及趨勢的研究極為關(guān)注。
關(guān)于國內(nèi)ND的研究，1928年在我國已有記載，1935年在我國部分地區(qū)出現(xiàn)流行，40年代分離到國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)強毒株(F48E8/F48E9株)。ND也是我國禽病中最為烈性的傳染病之一，也曾經(jīng)出現(xiàn)過4次大流行，且在我國許多地區(qū)每年都有流行，損失巨大。80年代前后預(yù)防接種工作已在養(yǎng)禽業(yè)中廣泛推廣，疫苗的廣泛使用收到了良好的效果，許多省區(qū)基本上控制了這種疫病。但我國養(yǎng)殖環(huán)境復(fù)雜，集約化程度仍然不高，疫苗的使用效果仍不夠理想。過去認為NDV可以感染水禽但并不致病，但自1997年在華南和華東地區(qū)分離到對鵝具有致病性的強毒株后，各地相繼分離到對水禽具有高致病性的毒株。在我國，雞與水禽長期混養(yǎng)，這種混養(yǎng)模式為病毒的相互傳播提供良好的宿主環(huán)境。近年來，該病隨著經(jīng)濟的發(fā)展和交往的頻繁，新城疫的流行又有抬頭的趨勢，而且又具有了新的特點，許多地方檢測到非典型新城疫，其造成的經(jīng)濟損失不言而喻。同時，目前NDV疫苗使用情況不規(guī)范，出現(xiàn)中毒、弱毒、滅活疫苗同時使用情況，這給防控ND帶來極大困難，因而開發(fā)針對NDV的新型防控藥物與措施顯得尤為重要。
NDV的毒力千差萬別，毒力變化機制極為復(fù)雜，可以由強變?nèi)酰材軌蛴扇踝儚?，變異趨勢引起禽病專家高度關(guān)注，這也是研究新型藥物所必須考慮的。
NDV屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)，副粘病毒屬。完整的病毒粒子近似球形，直徑120～300nm，NDV病毒粒子內(nèi)部為一直徑約17nm的卷曲的核衣殼(由蛋白質(zhì)相連結(jié)的單股RNA所形成)，其內(nèi)帶有RNA依賴的RNA聚合酶，外面包有脂質(zhì)雙層囊膜。其內(nèi)層襯有一層特殊的M蛋白，囊膜的外層為具有纖突(8～12nm)的糖蛋白所覆蓋,它們分別是具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性的HN蛋白和具有融合功能的F蛋白，HN和F蛋白與病毒的毒力有關(guān)。
典型的NDV為單股負鏈RNA病毒，整個基因組全長15586個核苷酸(經(jīng)典的新城疫病毒基因組長度為15 186個nt，如LaSota和V4毒株等)，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，即核衣殼蛋白(Np)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素神經(jīng)氨酸酶(HN)及RNA聚合酶(L)，各蛋白在基因組上順序為3’—NP—P—M—F—HN—L—5’。Collins等研究表明，在NDV感染細胞的胞漿中，病毒基因組RNA轉(zhuǎn)錄出三組mRNA，沉降系數(shù)分別18s、22～28s和35s。其中18sRNA包括5種3’端聚腺苷酸化的mRNA，分別編碼NP、P、M、HN和F 5種病毒結(jié)構(gòu)成分；35sRNA僅含單一編碼L的信息。Nothern雜交試驗顯示，18s和35sRNA已經(jīng)包含了整個基因組的遺傳信息，其中22～28sRNA含有18sRNA的序列，可能是共價結(jié)合的18sRNA。在各基因間有一個3’-GAA保守序列。NDV mRNA在各組mRNA之前均有一個保守的起始信號3’-UGCCCAUCUU-5’,且每一基因末端含有轉(zhuǎn)錄的終止信號序列,即3’-AUUCUUUUUU5’序列和mRNA互補的polyA。mRNA的起始信號和polyA之間的距離不等通常在1～47個核苷酸之間。
M蛋白，NDV的M蛋白是一個由346個氨基酸組成的多肽，分子量為39.7kDa，基因長度為1241bp，有一個開放閱讀框架。轉(zhuǎn)錄起始信號也是ACGGGTAGAA，翻譯起始于ATG，終止于TAA。M蛋白是非糖蛋白，位于病毒囊膜內(nèi)側(cè)面，一部分鑲嵌在囊膜內(nèi)，另一部分與核衣殼相鄰，共同構(gòu)成囊膜的支架。M蛋白至少有兩個功能區(qū)：一為是蛋白質(zhì)在脂質(zhì)雙層上的嵌合部位；二為區(qū)域與病毒核心中的核衣殼結(jié)構(gòu)相互作用有關(guān)。M蛋白有多種功能，1).通過與細胞膜、病毒糖蛋白的胞質(zhì)區(qū)以及核衣殼的相互作用而參與病毒的裝配過程，進而對形成具有感染性的病毒粒子至關(guān)重要，對于M蛋白發(fā)生突變的NDV毒株，可能由于不能將F蛋白有效地組裝入病毒粒子而失去其感染能力；2).具有抑制宿主細胞RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成的作用而與病毒的致病性相關(guān)。NDV感染早期細胞核內(nèi)就有M蛋白存在，并在核內(nèi)和細胞核物質(zhì)結(jié)合，影響正常的基因復(fù)制和表達。M蛋白在細胞核中的定位不需要NDV其他蛋白質(zhì)的參與。目前普遍認為M蛋白與病毒囊膜和核衣殼都有互相作用，但是沒有發(fā)現(xiàn)它有廣泛的疏水區(qū)域,最長的中性或疏水序列只有12個氨基酸之多，該序列開始于第55位殘基。另有研究顯示，M蛋白的序列與其他副粘病毒的M蛋白同源性較小，與Sendai病毒M蛋白只有17％同源性，與VSV M蛋白同源性也較小，只是在N端的111～127位殘基處有17個殘基同源性較高(64％)。
HN蛋白，NDV的HN基因長度為2031bp,約占基因組的13.5％，基因序列中含有一個長的開放閱讀框架，因終止密碼位置的差異,其翻譯的多肽鏈長短不一。第一類HN的多肽鏈長616個Aa，為無活性的前體(HN0)，代表株有D26/76等，主要是弱毒株；第二類HN的多肽鏈長577個Aa，為有生物活性的蛋白，代表株有B1/47等；第三類HN也具有生物學(xué)活性，多肽鏈長571個Aa，代表株有AUS/32等。HN蛋白，即血凝素—神經(jīng)氨酸酶，是NDV除F蛋白之外，另一種較大的糖蛋白。成熟的HN是一種四聚體寡聚蛋白，亞單位之間通過二硫鍵相聯(lián)形成二聚體，兩個二聚體非共價結(jié)合形成四聚體，HN蛋白具有血球凝集(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)兩種活性。血凝素成分負責(zé)病毒吸附到易感細胞含唾液酸的受體，這是病毒感染細胞的關(guān)鍵第一步。NDV的感染可被HN單抗和單特異性HN糖蛋白抗血清所中和。神經(jīng)氨酸酶則有分解膜結(jié)合或糖結(jié)合的唾液酸的能力,在病毒生命周期中起增加病毒粒子遷移性的作用,包括破壞細胞受體和從感染細胞表面釋放病毒粒子。在HN蛋白中，與神經(jīng)氨酸結(jié)合的區(qū)段為Asp-Arg-Lys-Ser-Cys-Ser，位于HN蛋白靠近中間的第234-329位氨基酸間，而血球凝集位點靠近C端。另有研究表明，所有NDV毒株NP、P、L蛋白分子結(jié)構(gòu)基本一致，而F和HN蛋白氨基酸卻存在較大差異，并且毒力差異越大，F(xiàn)和HN蛋白氨基酸差異也越明顯。HN蛋白氨基酸序列中有六個潛在的糖基化位點，主要疏水區(qū)靠近N端，表明HN是以N端與病毒外膜相連的。多肽N端一側(cè)的極性氨基酸親水性分析表明缺乏裂解信號。糖基化作用對HN向膜轉(zhuǎn)運無作用。但對神經(jīng)氨酸酶的作用是必需的。
反義核酸(antisense nucleic acid)是一段與靶基因(mRNA或DNA)的某段序列互補的天然存在或人工合成的核苷酸序列，反義核酸通過堿基配對方式特異性的與病毒靶基因結(jié)合形成雜交分子，從而在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)靶基因的表達，或誘導(dǎo)RNase H識別并切割mRNA，進而使其功能喪失。
反義核酸包括反義RNA(antisense RNA)和反義DNA(antisense DNA)，具有合成方便、序列設(shè)計簡單、容易修飾、選擇性高、親和力強等特點。反義核酸作為一種新的抗病毒、抗腫瘤藥物，掀起了一場藥理學(xué)領(lǐng)域的革命，即新的藥物受體mRNA通過新受體結(jié)合方式(Watson-Crick雜交)、引發(fā)新的藥物受體結(jié)合后反應(yīng)：(1)RNase H介導(dǎo)的靶RNA的降解；(2)抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的加工和翻譯等。可以說反義寡核苷酸(ODNs)療法比傳統(tǒng)的藥物治療手段有更高的特異性。從二十世紀(jì)70年代末到現(xiàn)在，在這三十年的時間中，反義核酸藥物已走出實驗室，進入了實際臨床應(yīng)用。特別是第一個反義核酸藥物Fomivirsen通過FDA批準(zhǔn)上市后，人們對反義療法尤為關(guān)注。
反義核酸作用原理基于堿基配對原則，可通過與靶RNA進行堿基配對結(jié)合的方式參與對相關(guān)基因表達的調(diào)控。其作用方式可能有：①反義RNA與病毒mRNA結(jié)合形成互補雙鏈阻斷核糖體與病毒mRNA的結(jié)合，從而抑制了病毒mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的過程。②反義DNA能與靶基因形成一種三鏈核酸(triple helix nucleic acid)，它通過作用于控制基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄子、增強子和啟動子區(qū)，對基因的轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控。③反義核酸與病毒mRNA的結(jié)合可阻擋mRNA向細胞質(zhì)的運輸。④反義核酸與病毒mRNA結(jié)合后使得mRNA更加易被核酸酶識別降解，從而大大縮短mRNA的半衰期。上述四種作用途徑都可表現(xiàn)為對病毒基因表達的抑制或調(diào)控，且這種調(diào)控是高度特異性的。
反義核酸是通過堿基互補配對的原理來識別所打靶的基因，從理論來分析，研究人員以動物細胞為例，其染色體大約有幾十億對堿基，如果4個堿基(A、G、C和T)的數(shù)目大致相同，并在整個基因中隨機分布，那么按照統(tǒng)計學(xué)原理，大于17個堿基的反義核酸與非靶基因雜交的可能性不大，所以長度超過17個堿基的反義核酸分子與靶基因的結(jié)合可以說是唯一的，從而使反義核酸具有高度的特異性。
研究表明，在細胞內(nèi)部一個拷貝的基因會產(chǎn)生200-300條mRNA，翻譯出10萬個具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。傳統(tǒng)藥物主要作用于有生物功能的蛋白分子的某結(jié)構(gòu)域上的幾個作用位點，事實上蛋白的結(jié)構(gòu)是非常復(fù)雜的，且在生物體內(nèi)，活性蛋白的空間結(jié)構(gòu)又是千變?nèi)f化的，以傳統(tǒng)藥物有限的幾種作用位點來控制靶分子的動態(tài)的和整體的功能很難達到理想的效果，因而不難看出傳統(tǒng)藥物的局限性。由mRNA可翻譯出幾十到幾百個蛋白，反義核酸在mRNA水平對靶基因直接進行調(diào)控，這個步驟相當(dāng)于將傳統(tǒng)藥物作用放大了數(shù)十到數(shù)百倍，可見反義核酸的調(diào)控是極其經(jīng)濟合理的。
毒理學(xué)研究表明，反義核酸在體內(nèi)具有很低的毒性，盡管其在生物體內(nèi)的存留時間有長有短，但最終都將被降解消除，這避免了如轉(zhuǎn)基因療法中外源基因整合到宿主染色體上的危險性。與傳統(tǒng)藥物相比，反義核酸藥物具有特異性強，效率高和毒副作用低等優(yōu)點，在抑制腫瘤生長和抗病毒復(fù)制等方面顯現(xiàn)出了良好的應(yīng)用價值。目前已有多個藥物進入美國和歐洲市場，另還有30多種反義核酸藥物正在進行臨床前期的研究或開發(fā)后進入了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期實驗。
由于動物體內(nèi)存在大量的核酸外切酶，反義核酸若不經(jīng)過化學(xué)修飾，很快就被降解，失去活性。目前對反義核酸的化學(xué)修飾有很多方法，常見的有硫代修飾反義核酸及2’-甲氧基修飾反義核酸等。且目前硫代修飾藥物的研究最為全面，它可有效抵抗核酸酶的降解，同時可促進核酸酶Rase H的活性，目前這種修飾方法已成功用于臨床的反義核酸藥物。但這些還只是第一代反義核酸的修飾方法，隨著技術(shù)的發(fā)展與進步，新的修飾途徑與方法被開發(fā)出來，使得反義核酸的研究進入了第二、三代，其中肽核酸的修飾最為引人關(guān)注。
肽核酸(peptidenucleic acids，PNAs)，是一種以中性酰胺鍵為骨架的全新的DNA類似物，其骨架的結(jié)構(gòu)單元為N(2-氨基乙基)-甘氨酸，堿基部分通過亞甲基羰基連接于主骨架的氨基N上。盡管PNA在結(jié)構(gòu)上相對寡核苷酸有了顯著的改變，但PNA與互補核酸之間的結(jié)合仍遵循堿基互補配對原則，甚至比天然核苷酸具有更高的親和性。PNA可序列特異性地靶向作用于DNA或RNA，為反義核酸的第二、三代產(chǎn)品。PNA與對應(yīng)的DNA或RNA形成穩(wěn)定的PNA-DNA或PNA-RNA結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，幾乎不受環(huán)境因素變化的影響，如離子，pH值等。近年來，科研人員對最初開發(fā)出的PNA進一步優(yōu)化，在結(jié)構(gòu)方面作了很大改進(如骨架結(jié)構(gòu)、在N-(2-氨基乙基)甘氨酸上連接手性和非手性的基團、堿基的類型等)，提高其生物學(xué)穩(wěn)定性和利用度、靶結(jié)合特性以及藥代動力學(xué)特性,并將PNA應(yīng)用于診斷和治療等方面。
殼聚糖是天然多糖中唯一的堿性多糖,具有來源豐富、無毒、易化學(xué)修飾性、生物相容性和可再生性等優(yōu)越的功能性質(zhì)和獨特分子結(jié)構(gòu)。殼聚糖作為可生物降解材料用于新型給藥系統(tǒng),通過改變給藥途徑可大大提高藥物療效,具有控制釋放、增加靶向性、減少刺激和降低毒副作用以及提高疏水性藥物通過細胞膜、增加藥物穩(wěn)定性等作用特點。
盡管有新城疫疫苗的廣泛使用，但目前形勢仍不樂觀，臨床上多呈非典型新城疫，其造成的經(jīng)濟損失巨大，同時疫苗的使用也極不規(guī)范，因而在家禽養(yǎng)殖業(yè)上加強防控NDV顯得極為重要。同時NDV的毒力千差萬別，毒力變化機制極為復(fù)雜，可以由強變?nèi)酰材軌蛴扇踝儚?，變異趨勢引起禽病專家高度關(guān)注。
因而開發(fā)預(yù)防和治療NDV感染的新技術(shù)與手段顯得尤為迫切，本發(fā)明率先將肽核酸技術(shù)與反義核酸技術(shù)結(jié)合起來，并應(yīng)用于預(yù)防和治療NDV病毒感染引發(fā)的相關(guān)疾病。本發(fā)明針對NDV(HN和M)兩種主要蛋白基因的保守區(qū)域設(shè)計的病毒特異性的反義寡核苷酸序列，采用特定工藝合成、肽修飾及殼聚糖包裝反義寡核苷酸，使其具備高水平的生物利用度、穩(wěn)定理化性能及高效安全的療效。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的是，提出新城疫由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)感染引起的一種以呼吸道、消化道粘膜出血為典型病變的高度接觸性、急性敗血性禽類傳染病。
本發(fā)明技術(shù)方案是，一種抗雞新城疫病毒的肽核酸，其特征是針對雞新城疫病毒NDV的HN和M蛋白的基因高度保守區(qū)域設(shè)計特異性強的兩組反義核酸序列，能特異地與NDV的兩個關(guān)鍵基因HN和M結(jié)合，且分布于NDV基因組的不同區(qū)域，以下為本發(fā)明所涉及的一系列序列或其組合：
第一組反義核酸序列HN：
HN-1：5’-CAUUACUAUUAAAAGUAAGACUG-3’
HN-2：5’-CAUGGUAUUGACCGUCAAAUCCU-3’
HN-3：5’-GGAUAUUUCUGCAAUACUAAGAC-3’
第二組反義核酸序列M：
M，M-1：5’-UCAAAGUACAGCCCGAUUGUCCU-3’
M-2：5’-ACAUCAAUAGUGACAUUGAGCGC-3’
M-3：5’-GGACAUAAGCCCGAUAUGCAGAA-3’。
在所述反義核酸序列中篩選出HN-1，HN-3，M-2和M-3為優(yōu)選序列。
分別按質(zhì)量比例1:(0.4～3):(0.4～3):(0.4～3)，對HN-1，HN-3、M-2和M-3進行配比，從而形成優(yōu)選序列組。
所述的反義核酸制備成肽核酸；還可將將肽核酸溶液與咪唑丙烯酸殼聚糖(UAC)溶液等體積置于55℃水浴恒溫30min,將兩者在混合器上混合,偶聯(lián)制備出UAC-PNA納米分子微囊，并將其用于制備抗NDV新藥的研究。
所述反義核酸制備成肽核酸，采用藥用載體或賦形劑組合的藥物。
有益效果，本發(fā)明采用特定工藝人工制成肽核酸片段，提高反義核酸的穩(wěn)定性和透膜性。該序列與上述靶基因反向互補，根據(jù)堿基互補原理，反義核酸序列特異性地與NDV(HN和M)的對應(yīng)的靶基因相結(jié)合，誘導(dǎo)核酶等分子對靶基因進行降解，阻斷靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達，抑制NDV在宿主體內(nèi)復(fù)制與裝配，以達到防控雞新城疫病毒的目的。本發(fā)明還涉及含有該反義核酸序列的藥物組合物，及其在動物藥物上的用途。本發(fā)明無毒副作用，無耐藥性，能特異性直接抑制NDV復(fù)制，抗病毒效果好，無藥殘等食品安全問題。定量PCR檢測結(jié)果顯示，HN特異肽核酸，HN-1和HN-3抑制率分別為:78％和83％。M特異反義肽核酸，M-2和M-3的抑制率分別為:73％和77％。但實際使用時混合序列的肽核酸更好。
具體實施方式
發(fā)明所設(shè)計的反義核酸序列
主要材料與試劑
病毒毒株
NDV毒株：NS-ND9株，由楠森獸醫(yī)診斷技術(shù)研究中心實驗室提供。
細胞株
CEF細胞：常規(guī)方法制備的10日齡的SPF雞胚成纖維細胞(CEF)。
反義核酸的合成
采用合成工藝進行反義核酸的人工合成。
反義核酸的合成為了獲得良好的實際應(yīng)用效果，采用肽骨架構(gòu)建并引入反義核酸堿基以形成穩(wěn)定理化性能和特定空間結(jié)構(gòu)的肽核酸(PNA)
肽核酸的修飾
以殼聚糖為修飾物對肽核酸進行修飾。
肽核酸的劑型
1、采用控釋制藥工藝將經(jīng)修飾過的肽核酸制備成結(jié)腸溶控釋微囊制劑；
2、采用冷凍干燥制藥工藝將經(jīng)修飾過的肽核酸制備成注射用凍干粉針；
3、采用凍干后再制粒工藝將經(jīng)修飾過的肽核酸制備成口服用水溶性顆粒。
藥劑穩(wěn)定性分析
高溫：流通蒸汽高溫105℃，20分鐘滅菌不影響其生物活性。
極端溫度：50℃存放6個月不影響其生物活性。
室溫：存放24個月不影響其生物活性。
低溫：-20℃存放48個月不影響其生物活性。
實施方案 針對抗NDV的肽核酸體外抗病毒效果分析
從GenBank數(shù)據(jù)庫檢索出NDV的基因組，特別是近年來我國所報道的NDV毒株的序列，用生物學(xué)軟件進行序列分析，綜合考慮序列的保守性，G+C％含量，堿基分布特點，然后從中挑選出合適的區(qū)域設(shè)計反義核酸，最后所確定的針對病毒的HN和M基因的反義核酸序列如下。
HN
HN-1：5’-CAUUACUAUUAAAAGUAAGACUG-3’
HN-2：5’-CAUGGUAUUGACCGUCAAAUCCU-3’
HN-3：5’-GGAUAUUUCUGCAAUACUAAGAC-3’
M
M-1：5’-UCAAAGUACAGCCCGAUUGUCCU-3’
M-2：5’-ACAUCAAUAGUGACAUUGAGCGC-3’
M-3：5’-GGACAUAAGCCCGAUAUGCAGAA-3’
采用NDV病毒特異性定量RT-PCR檢測肽核酸對病毒靶基因的抑制程度，同時運用病毒毒價測定實驗檢測抗病毒的滴度。
Day 1:
鋪板：消化前期準(zhǔn)備的CEF細胞，離心收集，細胞計數(shù)，用完全培養(yǎng)基(E-MEM+5％胎牛血清+青鏈霉素+glutamine)將細胞濃度調(diào)到2～5×105個/ml，鋪24孔板，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)18-24小時。
Day 2:
顯微鏡觀察細胞的密度，待細胞長滿孔板面積的70～80％時，且細胞狀態(tài)良好。吸去培養(yǎng)液，每孔加入300μl待篩選藥物，每個藥物10個孔。溫育1小時后，加入100μlNDV(感染比為100TCID50，NS-ND9半數(shù)組織培養(yǎng)感染量TCID50為10-4.5)，吸附2小時后，用營養(yǎng)液洗去未吸附的病毒后，再加入含3％FBS的E-MEM培養(yǎng)基，在37℃和5％CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，感染后定時觀察細胞病變。感染后48h，將感染細胞進行反復(fù)凍融以釋放病毒，以此為樣本進行病毒檢測。實驗過程中還設(shè)不加病毒和肽核酸的正常細胞對照組，加病毒、不加肽核酸陽性對照組和加肽核酸藥物、不加病毒的陰性對照組。觀察藥物對細胞的保護效應(yīng)，并對結(jié)果進行評判。
Real-time PCR定量檢測
收集上述各處理組中的上清液，用病毒總RNA提取試劑盒提取病毒RNA。對獲得的病毒RNA首先進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后運用針對的引物分別檢測NDV處理組中的病毒含量。定量擴增后的結(jié)果，運用統(tǒng)計學(xué)軟件計算出各處理組中病毒滴度，抑制效果以PNA組與空白對照組差異的倍數(shù)。
本發(fā)明參考Ge SH(2012年)等提供的引物，采用real-time PCR定量檢測NDV。
NDV特異性檢測引物
引物1:5'-AGTGATGTGCTCGGACCTTC-3'
引物2:5’-CCTGAGGAGAGGCATTTGCTA-3’
β-actin為內(nèi)參
Actin-F：5’-TCCCTGTATGCCTCTGGTC-3’
Actin-R：5’-TCTCTCTCGGCTGTGGTGG-3’
反應(yīng)體系(25μl)
反應(yīng)條件：
反轉(zhuǎn)錄，42℃5min，95℃10sec；
PCR擴增，Cycle：40，95℃5sec，58℃60sec，72℃30sec。
反應(yīng)結(jié)束后確認Real Time One Step RT-PCR的擴增曲線和融解曲線，以確保結(jié)果的特異性與可靠性。
針對NDV的肽核酸體外抗病毒結(jié)果
定量PCR檢測結(jié)果顯示，HN特異肽核酸，除HN-2效果不明顯外，HN-1和HN-3抑制率分別為:78％和83％(附表1)。M特異反義肽核酸，除M-1效果不明顯外，M-2和M-3的抑制率分別為:73％和77％(附表1)
附表1.反義核酸對體外CEF細胞抗NDV效果
藥物組合處理
方法同上，針對前一步所篩選出的HN-1/3，M-2/3為優(yōu)選序列。然后，在前面的這些實驗基礎(chǔ)上，對篩選出的有效抗病毒作用的藥物進行組合使用，比較組合后的抗病毒效果與單藥抗病毒效果之間的差異。CEF細胞感染NDV NS-ND9株后，分別加入針對HN或M的基因藥物組合，同時設(shè)陽性對照和陰性對照及空白對照，用Real-time PCR方法進行檢測，統(tǒng)計分析各用藥組之間病毒抑制率，確定藥物的組合，如附表2。
附表2.不同濃度的反義肽核酸對體外CEF細胞抗NDV效果
細胞毒性實驗
1)以CEF細胞作檢測對象，96孔板，每孔加100微升5000個細胞。藥物濃度(0.02，0.1，0.5，1，5，10μm)，每個梯度設(shè)置3個重復(fù)孔，另設(shè)未處理細胞對照、無細胞培養(yǎng)基對照。
2)處理結(jié)束后，每孔每100μl培養(yǎng)基加入10μl MTT Stock，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4小時。也可更換100μl新鮮無血清培養(yǎng)基后再加MTT Stock。
3)吸去培養(yǎng)基，每孔加入100μl MTT溶解劑，保持各孔內(nèi)液體體積一致。
4)在570nm測定OD吸光度并進行比較計算。注意：為準(zhǔn)確考慮可在699nm處測定未還原的MTT本身的吸光度OD值，然后用OD570減去OD699。
5)結(jié)果判斷：細胞增殖或毒性＝100％x(OD實驗－OD本底)/(OD對照－OD本底)。
OD實驗是接受處理細胞的OD值，OD對照是未處理細胞對照管OD值，OD本底是無細胞培養(yǎng)基對照OD值。處理后細胞增殖或毒性變化表示為未處理對照的百分數(shù)。
檢測結(jié)果表明，針對NDV肽核酸無毒性。
實驗動物感染及飼養(yǎng)
健康7日齡SPF雛雞共200只(楠森獸醫(yī)診斷中心實驗動物養(yǎng)殖場司提供，經(jīng)檢測NDV陰性)隨機分為5組。其中NDV感染組(試驗組)40只，采用滴鼻攻毒方式，100μL/只；空白對照組(對照組)共40只，不作任何處理。三個藥物劑量組(25ppm，50ppm，100ppm)，采用飲水給藥方式，嚴(yán)格按組隔離飼養(yǎng)，各組的飼料與飲水均單獨準(zhǔn)備，不交叉。
NDV感染后，逐日詳細觀察至攻毒后7d，統(tǒng)計發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)，計算免疫保護率。同時采集樣品，提取總RNA，進行RT-PCR檢測，分析各組中NDV的檢出率，如附表3。
表3.抗NDV的肽核酸藥物臨床實驗
最終優(yōu)選的給藥劑量為50～100ppm。