本發(fā)明屬于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病毒檢測領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測豚鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)、仙臺(tái)病毒(SendaiVirus,SV)、鼠肺炎病毒(PVM)、呼腸孤3型病毒(Reo-3)的多重液相基因芯片方法及試劑。
背景技術(shù)：
：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的福利以及工作人員的健康，建立并執(zhí)行完善的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康監(jiān)測方案，對(duì)保證和提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量非常重要。隨著我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物事業(yè)的發(fā)展和各項(xiàng)法規(guī)的健全、國際交流的增加，以及大跨國公司對(duì)國內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的嚴(yán)格要求和國內(nèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物出口等需要，國內(nèi)很多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)單位和動(dòng)物使用單位，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康監(jiān)測的要求也在逐步與歐美等發(fā)達(dá)國家的健康監(jiān)測水平接軌。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病中，病毒性疾病占有重要的位置。病毒的監(jiān)測是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制中非常重要的環(huán)節(jié)。無病毒抗體(virusantibodyfree，VAF)是美國CharlesRiverLaboratories(CRL)提出的概念，此標(biāo)準(zhǔn)符合科研使用的實(shí)際需要和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育的要求，也得到了全球眾多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用者的認(rèn)可。CRL在國際上率先使用luminex的x-tag、x-map技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量檢測，而這項(xiàng)技術(shù)在國內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測中的應(yīng)用還是空白。淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤3型病毒是實(shí)驗(yàn)豚鼠常規(guī)病毒檢測項(xiàng)目，其鑒別診斷通常需借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，如病毒分離、免疫熒光試驗(yàn)技術(shù)、電鏡、免疫酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)、RT-PCR和核苷酸序列分析等，雖然以上方法均能鑒別出不同類型的病毒，但如病毒分離、免疫熒光試驗(yàn)、電鏡等方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于臨床快速診斷，也不適于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查；由于不同毒株間衣殼蛋白抗原具有相當(dāng)大的變異性，因此酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的應(yīng)用也受到限制，而PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感度高的優(yōu)點(diǎn)，但結(jié)果判定需要電泳，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且反應(yīng)產(chǎn)物容易產(chǎn)生污染而導(dǎo)致假陽性。熒光定量PCR技術(shù)融合了PCR的多種優(yōu)點(diǎn)，通過直接檢測PCR反應(yīng)過程中熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)目的分子的定量，不需要電泳檢測，并且整個(gè)過程完全閉管式操作，污染機(jī)率降低，避免了常規(guī)PCR容易造成的假陽性問題。相對(duì)常規(guī)PCR，熒光定量PCR在敏感性、特異性與速度等方面具有優(yōu)勢，但實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)受到熒光種類及儀器自身的限制，最多只能對(duì)5個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行檢測，且實(shí)驗(yàn)成功的難度極大，費(fèi)用昂貴。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述問題，本發(fā)明建立了針對(duì)實(shí)驗(yàn)豚鼠的淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤3型病毒的多重液相基因芯片方法。本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測豚鼠LCMV、SV、PVM、Reo-3病毒的多重液相基因芯片方法及試劑。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種快速檢測豚鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤3型病毒的多重液相基因芯片方法的引物，其核苷酸序列如下所示：引物L(fēng)1：ACTGTGTAAAGCAGGCCAAGGTCTGT(SEQIDNO：1)；引物L(fēng)2：AACAATCAATTTGGCACAATGCC(SEQIDNO：2)；引物S1：CCCAGCCATATACTCAGTCGTGC(SEQIDNO：3)；引物S2：TCCACAACTTTTGTGACAGGACAC(SEQIDNO：4)；引物P1：AGATCACAGAGCCCGTCAAAAT(SEQIDNO：5)；引物P2：GCATATAACATCCAATACGAGTTTGAA(SEQIDNO：6)；引物R1：ACGTCTCAAATACACTCTGATAC(SEQIDNO：7)；引物R2：TTCCAATCKGGAGATTGCAAGTTG(SEQIDNO：8)。進(jìn)一步的，所述引物L(fēng)1和L2其中一條引物的5’端被生物素化；所述引物S1和S2其中一條引物的5’端被生物素化；所述引物P1和P2其中一條引物的5’端被生物素化；所述引物R1和R2其中一條引物的5’端被生物素化。進(jìn)一步的，所述引物L(fēng)1和L2、S1和S2、P1和P2、R1和R2中未被生物素化的引物的5’端連接有tag序列，所述tag序列能與熒光編碼微球中帶有的anti-tag序列互補(bǔ)配對(duì)。進(jìn)一步的，所述引物L(fēng)1和L2、S1和S2、P1和P2、R1和R2這4組引物對(duì)中連接的tag序列選自SEQIDNO:9～12所示的tag序列，且該4組引物對(duì)中連接的tag序列互不相同。一種快速檢測豚鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤3型病毒的多重液相基因芯片方法的試劑，該試劑中含有上述任一所述的引物。進(jìn)一步的，所述試劑中還含有鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物、4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球。進(jìn)一步的，所述熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補(bǔ)配對(duì)的anti-tag序列，編碼不同熒光色的熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。一種快速檢測豚鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤3型病毒的多重液相基因芯片方法，包括如下步驟：1)從樣品中提取病毒RNA，以RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得cDNA產(chǎn)物；2)以反轉(zhuǎn)錄出的cDNA產(chǎn)物為模板，用上述任一所述的引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；3)將上步擴(kuò)增產(chǎn)物、4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球、鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行雜交；4)雜交結(jié)束后，通過Luminex系統(tǒng)對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測分析，確定其病毒的類型；上述方法用于非疾病的診斷的治療。進(jìn)一步的，步驟2)中多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：步驟2)中多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57℃退火1min30s，72℃延伸30s；循環(huán)36次；72℃終延伸10min。進(jìn)一步的，步驟3)中4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補(bǔ)配對(duì)的anti-tag序列，4種熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。本發(fā)明的有益效果是：1)本發(fā)明方法同時(shí)對(duì)豚鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤3型病毒進(jìn)行檢測時(shí)，通過PCR獲得目標(biāo)擴(kuò)增片段，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物、熒光編碼微球和鏈霉親和素-藻紅蛋白(SA-PE)進(jìn)行雜交，然后通過檢測儀讀取MFI值時(shí)，分辯不同類型的病毒。2)本發(fā)明方法，能夠同時(shí)對(duì)豚鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤3型病毒進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，而且特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好。與傳統(tǒng)檢測方法相比，本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)同一樣本中的多種不同目的分子同時(shí)進(jìn)行檢測，樣本用量少，操作簡單、快速，可大大降低檢測成本。本發(fā)明能保證相同的復(fù)性溫度和雜交效率，且有效避免不同檢測物標(biāo)記的微球之間交叉雜交。附圖說明圖1是用鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤3型病毒等的cDNA模板進(jìn)行單重PCR的產(chǎn)物電泳圖；圖2是用鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤3型病毒等的cDNA模板進(jìn)行多重PCR的產(chǎn)物電泳圖。具體實(shí)施方式一種快速檢測豚鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤3型病毒的多重液相基因芯片方法的引物，其核苷酸序列如下所示：引物L(fēng)1：ACTGTGTAAAGCAGGCCAAGGTCTGT(SEQIDNO：1)；引物L(fēng)2：AACAATCAATTTGGCACAATGCC(SEQIDNO：2)；引物S1：CCCAGCCATATACTCAGTCGTGC(SEQIDNO：3)；引物S2：TCCACAACTTTTGTGACAGGACAC(SEQIDNO：4)；引物P1：AGATCACAGAGCCCGTCAAAAT(SEQIDNO：5)；引物P2：GCATATAACATCCAATACGAGTTTGAA(SEQIDNO：6)；引物R1：ACGTCTCAAATACACTCTGATAC(SEQIDNO：7)；引物R2：TTCCAATCKGGAGATTGCAAGTTG(SEQIDNO：8)。優(yōu)選的，所述引物L(fēng)1和L2其中一條引物的5’端被生物素化；所述引物S1和S2其中一條引物的5’端被生物素化；所述引物P1和P2其中一條引物的5’端被生物素化；所述引物R1和R2其中一條引物的5’端被生物素化。更優(yōu)選的，引物L(fēng)2、S2、P2和R2的5’端被生物素化。優(yōu)選的，所述引物L(fēng)1和L2、S1和S2、P1和P2、R1和R2中未被生物素化的引物的5’端連接有tag序列，所述tag序列能與熒光編碼微球中帶有的anti-tag序列互補(bǔ)配對(duì)。優(yōu)選的，所述引物L(fēng)1和L2、S1和S2、P1和P2、R1和R2這4組引物對(duì)中連接的tag序列選自SEQIDNO:9～12所示的tag序列，且該4組引物對(duì)中連接的tag序列互不相同；tag序列具體如下：CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT(SEQIDNO：9)；CTAAACATACAAATACACATTTCA(SEQIDNO：10)；TACTTAAACATACAAACTTACTCA(SEQIDNO：11)；AATAACAACTCACTATATCATAAC(SEQIDNO：12)。更優(yōu)選的，引物L(fēng)1、S1、P1和R1的5’端連接有tag序列。優(yōu)選的，引物L(fēng)1、S1、P1和R1的5’端通過間隔臂與tag序列連接。優(yōu)選的，所述的間隔臂為Spacer18(六乙二醇，Spacer18為其通用的寡核苷酸修飾名稱)，修飾引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。一種快速檢測豚鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤3型病毒的多重液相基因芯片方法的試劑，其特征在于，該試劑中含有上述任一所述的引物。優(yōu)選的，上述試劑中還含有鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物、4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球。優(yōu)選的，上述熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補(bǔ)配對(duì)的anti-tag序列，編碼不同熒光色的熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。一種快速檢測豚鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤3型病毒的多重液相基因芯片方法，包括如下步驟：1)從樣品中提取病毒RNA，以RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA產(chǎn)物；2)以反轉(zhuǎn)錄出的cDNA產(chǎn)物為模板，用上述任一所述的引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；3)將上步擴(kuò)增產(chǎn)物、4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球、鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行雜交；4)雜交結(jié)束后，通過Luminex系統(tǒng)對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測分析，確定其病毒的類型；上述方法用于非疾病的診斷的治療。優(yōu)選的，步驟1)中反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為：優(yōu)選的步驟1)中反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃15min；85℃5s，4℃保存。優(yōu)選的步驟2)中多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：優(yōu)選的，步驟2)中多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57℃退火1min30s，72℃延伸30s；循環(huán)36次；72℃終延伸10min。優(yōu)選的，步驟3)所述雜交的反應(yīng)體系和程序?yàn)椋簝?yōu)選的，步驟3)中4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補(bǔ)配對(duì)的anti-tag序列，4種熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。實(shí)施例1引物經(jīng)過對(duì)所設(shè)計(jì)的大量引物進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)引物對(duì)L1和L2、S1和S2、P1和P2、R1和R2對(duì)同時(shí)快檢測豚鼠LCMV、SV、PVM、Reo-3病毒的效果最好，其堿基序列如下所示。引物L(fēng)1：ACTGTGTAAAGCAGGCCAAGGTCTGT(SEQIDNO：1)；引物L(fēng)2：AACAATCAATTTGGCACAATGCC(SEQIDNO：2)；引物S1：CCCAGCCATATACTCAGTCGTGC(SEQIDNO：3)；引物S2：TCCACAACTTTTGTGACAGGACAC(SEQIDNO：4)；引物P1：AGATCACAGAGCCCGTCAAAAT(SEQIDNO：5)；引物P2：GCATATAACATCCAATACGAGTTTGAA(SEQIDNO：6)；引物R1：ACGTCTCAAATACACTCTGATAC(SEQIDNO：7)；引物R2：TTCCAATCKGGAGATTGCAAGTTG(SEQIDNO：8)。本發(fā)明采用多重液相基因芯片的方法對(duì)豚鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)、仙臺(tái)病毒(SV)、鼠肺炎病毒(PVM)、呼腸孤3型病毒(Reo-3)進(jìn)行檢測和區(qū)分，故將上述引物作進(jìn)一步的修飾，以滿足相應(yīng)的操作要求。其中引物L(fēng)1、S1、P1、R1的5’端通過間隔臂連接有tag序列，所連接的tag序列分別為：引物L(fēng)1的tag序列為：CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT(SEQIDNO：9)；引物S1的tag序列為：CTAAACATACAAATACACATTTCA(SEQIDNO：10)；引物P1的tag序列為：TACTTAAACATACAAACTTACTCA(SEQIDNO：11)。引物R1的tag序列為：AATAACAACTCACTATATCATAAC(SEQIDNO：12)。所述的間隔臂為Spacer18(六乙二醇，Spacer18為其通用的修飾寡核苷酸時(shí)名稱)，修飾引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。實(shí)施例2用于快速檢測豚鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)、仙臺(tái)病毒(SV)、鼠肺炎病毒(PVM)、呼腸孤3型病毒(Reo-3)的多重液相基因芯片方法的試劑試劑包括以下組分：(1)實(shí)施例1所設(shè)計(jì)的引物；(2)4種編碼不同熒光色的熒光編碼微球，4種熒光編碼微球分別含有不同的anti-tag序列的熒光編碼微球，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與多重?zé)晒饷庖叻治鲆镏械膖ag序列互補(bǔ)配對(duì)；4種微球均購自luminex公司，其中LCMV、SV、PVM和Reo-3分別對(duì)應(yīng)的熒光編碼微球號(hào)為MTAG-A056、MTAG-A062、MTAG-065和MTAG-077。(3)鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物。實(shí)施例3快速檢測豚鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤3型病毒的多重液相基因芯片檢測方法的建立(1)病毒RNA提取及反轉(zhuǎn)錄用天根OSR-M202病毒核酸提取試劑盒在TGuideM16自動(dòng)核酸提取儀上提取上述4種病毒的RNA，用TakaraPrimeScriptTMRTMasterMix(PerfectRealTime)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為：反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃15min；85℃5s，4℃保存。(2)多重PCR擴(kuò)增引物混合液的制備：將LCMV、SV、PVM和Reo-3的引物以4:1:1:1比例進(jìn)行混合；多重PCR反應(yīng)體系為：擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57℃退火1min30s，72℃延伸30s；循環(huán)36次；72℃終延伸10min。其中，將部分多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測結(jié)果如圖2所示，從中可以看出，由于這4種病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物大小相近，所以四重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶無法分辨。另外，分別用引物對(duì)L1和L2、S1和S2、P1和P2、R1和R2對(duì)豚鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤3型病毒引物進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，單重PCR反應(yīng)體系為：PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57℃退火1min30s，72℃延伸30s；循環(huán)36次；72℃終延伸10min。分別對(duì)單重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1所示(為2次電泳圖片拼接)，從中可以看出。LCMV、SV、PVM和Reo-3的產(chǎn)物大小的確都位于150-200bp之間；進(jìn)一步說明在圖2中，由于這四種病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物大小相近，所以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶無法分辨。(3)多重PCR產(chǎn)物與熒光編碼微球工作液、鏈霉親和素藻紅蛋白(SA-PE)工作液進(jìn)行雜交，包括以下步驟：分別包被有特異的anti-tag序列的4種微球，其中anti-tag序列能相應(yīng)地與LCMV、SV、PVM和Reo-3四種病毒引物上的tag序列互補(bǔ)配對(duì)。四種微球均購自luminex公司，具體的LCMV、SV、PVM和Reo-3分別對(duì)應(yīng)的熒光編碼微球號(hào)為MTAG-A056、MTAG-A062、MTAG-065和MTAG-077。熒光編碼微球工作液的制備：將2500個(gè)/μL熒光編碼微球用1.1×TmHybrdizationBuffer稀釋到1μL約含有125個(gè)/種熒光編碼微球。SA-PE工作液制備：將1mg/mlSA-PE用1×TmHybrdizationBuffer稀釋到10μg/μL。充分重懸熒光編碼微球工作液，每個(gè)樣品孔和背景孔加入微球工作液20μL，樣品孔中加入5μLPCR產(chǎn)物，背景孔中加入5μLPCRblank產(chǎn)物，再加入75μL的SA-PE工作液，充分混勻，于金屬加熱器中37℃孵育30min。依照檢測儀Luminex200儀器的說明將雜交后的50μL上述反應(yīng)液進(jìn)行檢測，結(jié)果如表1所示，雖然多重模板的擴(kuò)增產(chǎn)物無法用電泳分辨，但用檢測儀Luminex200儀器讀取MFI值時(shí)，明顯分辨不同類型的病毒。表1LCMV、SV、PVM和Reo-3的多重液相基因芯片檢測方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果病毒名稱MFI值LCMV4946.5SV8390.5PVM9430Reo-36200結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)(注：該判斷標(biāo)準(zhǔn)僅供參考，亦可對(duì)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)整)如下：最低檢測閾值(cutoff值)的確定：選取10份清潔級(jí)豚鼠腦和肺組織樣品(每個(gè)樣品平行重復(fù)3次)分別通過上述多重液相基因芯片方法進(jìn)行檢測，分別讀取MFI值并計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。以平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差的MFI值設(shè)定其為cutoff值。本發(fā)明所獲得cutoff值分別為LCMV：422.6、SV：511.7、PVM：794.7和Reo-3：312.5，因此將本發(fā)明的cutoff值分別定為430、520、800、320。只有檢測樣品的MFI值高于上述數(shù)值時(shí)，該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)才能進(jìn)行有效分析。待測樣本的分析判斷：1)當(dāng)待測樣本的MFI值≤cutoff值時(shí)，判斷為陰性樣本；2)待測樣本的MFI值＞cutoff值時(shí)，判斷為陽性，需要進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)或采取其他檢測方法進(jìn)一步驗(yàn)證。實(shí)施例4：LCMV、SV、PVM和Reo-3的多重液相基因芯片檢測靈敏性實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例3中反轉(zhuǎn)錄后的cDNA進(jìn)行定量，采用10倍稀釋法進(jìn)行稀釋，稀釋至0.7fg/μL，用上述建立的多重液相基因芯片方法進(jìn)行檢測。LCMV、SV、PVM和Reo-3的多重液相基因芯片檢測靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LCMV、SV、PVM和Reo-3的靈敏度較高，檢出限分別為7ng/μL、0.07ng/μL、0.07ng/μL、7ng/μL。表2LCMV、SV、PVM和Reo-3的多重液相基因芯片檢測靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果cDNA濃度700ng/μL70ng/μL7ng/μL0.7ng/μL0.07ng/μL0.007ng/μLLCMV50752355156616492.588SV8319804573306741.52166513.5PVM93478437691546632121208Reo-363893774188327370.547實(shí)施例5：LCMV、SV、PVM和Reo-3的多重液相基因芯片檢測特異性實(shí)驗(yàn)分別用淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤3型病毒、小鼠腺病毒、小鼠細(xì)小病毒、小鼠多瘤病毒、漢坦病毒、小鼠腦脊髓炎病毒、鼠痘病毒等作為模板進(jìn)行多重液相基因芯片檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，只有淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、仙臺(tái)病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤3型病毒為陽性，其他的均為陰性，說明檢測體系特異性良好。表3LCMV、SV、PVM和Reo-3的多重液相基因芯片檢測特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例6：LCMV、SV、PVM和Reo-3的多重液相基因芯片檢測重復(fù)性實(shí)驗(yàn)四種病毒分別做了批內(nèi)和批間實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。表4LCMV、SV、PVM和Reo-3的多重液相基因芯片檢測重復(fù)性結(jié)果從表4結(jié)果可知，批內(nèi)實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)在0.5％以下，批間實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)在1％以下，表明該方法的檢測性能穩(wěn)定，結(jié)果可靠，具有可重復(fù)性。實(shí)施例7：人工攻毒的樣品的檢測取人工攻毒的清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)豚鼠組織樣品12份(每種病毒3份)，用天根OSR-M202病毒核酸提取試劑盒在TGuideM16自動(dòng)核酸提取儀上提取RNA，然后用TakaraPrimeScriptTMRTMasterMix(PerfectRealTime)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA作為模板，采用上述檢測LCMV、SV、PVM和Reo-3的多重液相基因芯片檢測方法進(jìn)行檢測，具體步驟參照實(shí)施例3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。表5人工攻毒的清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)豚鼠組織樣品的檢測結(jié)果檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，12份樣品都超過了檢測閾值，認(rèn)定為陽性。與測序分析結(jié)果一致。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。<110>廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測所<120>一種快速檢測豚鼠LCMV、SV、PVM、Reo-3病毒的多重液相基因芯片方法及試劑<130><160>12<170>PatentInversion3.5<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>1actgtgtaaagcaggccaaggtctgt26<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2aacaatcaatttggcacaatgcc23<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>3cccagccatatactcagtcgtgc23<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>4tccacaacttttgtgacaggacac24<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5agatcacagagcccgtcaaaat22<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>6gcatataacatccaatacgagtttgaa27<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>7acgtctcaaatacactctgatac23<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>8ttccaatckggagattgcaagttg24<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>9cttaaactctacttacttctaatt24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>10ctaaacatacaaatacacatttca24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>11tacttaaacatacaaacttactca24<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>12aataacaactcactatatcataac24當(dāng)前第1頁1 2 3