本發(fā)明涉及植物育種領(lǐng)域，具體是一種檢測(cè)谷子抗咪唑乙煙酸基因的分子標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
：谷子是我國(guó)重要的糧食作物，也是我國(guó)北方優(yōu)質(zhì)抗旱作物。然而谷子種植一直依靠人工間苗和除草，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，這種傳統(tǒng)方式不適應(yīng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的要求。近年來(lái)，河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交育成了系列抗咪唑乙煙酸除草劑的谷子新品種，實(shí)現(xiàn)了谷田的化學(xué)除草；同時(shí)，提出通過(guò)選育抗、感拿捕凈的同型姊妹系，二者按一定比例混合播種，利用二者對(duì)除草劑的抗性差異，苗期通過(guò)噴施除草劑同步實(shí)現(xiàn)了谷子化學(xué)間苗、化學(xué)除草的簡(jiǎn)化栽培谷子品種選育方法與栽培技術(shù)，并育成了系列品種，使谷子集約化、規(guī)?；a(chǎn)成為可能。目前，該類除草劑品種已分發(fā)到全國(guó)多家單位，用來(lái)培育抗除草劑谷子新品種。然而，選育抗、感除草劑的同型姊妹系需要從低世代中選擇雜合植株，達(dá)到所需農(nóng)藝性狀后，從高世代分離群體中選擇抗、感同型姊妹系或在低世代開始保留抗、感植株，直到高世代形成重組自交系群體，從而選擇農(nóng)藝性狀一致的抗、感姊妹系，因此無(wú)法通過(guò)噴施除草劑來(lái)達(dá)到選育目的。目前鑒定除草劑抗、感、雜合植株的主要方法有田間鑒定法和室內(nèi)培養(yǎng)皿法。田間鑒定法即對(duì)穗行中的部分植株噴施除草劑，通過(guò)抗性差異，判斷其抗、感、雜合情況。室內(nèi)培養(yǎng)皿法是收獲種子后，取部分用于室內(nèi)培養(yǎng)皿發(fā)芽，通過(guò)噴施除草劑，觀察其抗性差異，從而判斷其抗、感、雜合情況。然而該兩種方法工作量大，不適于大批量鑒定；同時(shí)，該方法易受環(huán)境因素的影響，影響判斷結(jié)果。因此建立一種精準(zhǔn)快速鑒定抗、感、雜合咪唑乙煙酸谷子的方法，對(duì)提高抗咪唑乙煙酸谷子育種效率，縮短育種周期具有重要意義。咪唑乙煙酸為乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制類除草劑，通過(guò)抑制乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase,ALS)活性導(dǎo)致植物體內(nèi)支鏈氨基酸的生物合成受阻，抑制細(xì)胞分化，從而導(dǎo)致植物生長(zhǎng)。ALS活性位點(diǎn)中保守位點(diǎn)的突變，往往會(huì)導(dǎo)致其對(duì)ALS抑制劑類除草劑產(chǎn)生不同水平的抗性。開發(fā)用于檢測(cè)谷子純合、雜合和敏感咪唑乙煙酸基因分子標(biāo)記，利用分子標(biāo)記輔助選育提高培育抗、感咪唑乙煙酸配套谷子品種具有重要意義。本研究以遠(yuǎn)緣雜交育成的抗咪唑乙煙酸除草劑谷子新品種M1508、敏感品系13H570及13H570×M1508F2后代材料，克隆M1508中咪唑乙煙酸基因，并開發(fā)用于檢測(cè)谷子抗、感、雜合咪唑乙煙酸基因(imALS)的CAPs分子標(biāo)記，建立精準(zhǔn)快速鑒定抗、感、雜合咪唑乙煙酸谷子的方法，為分子標(biāo)記輔助育種培育抗咪唑乙煙酸谷子品種奠定基礎(chǔ)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的技術(shù)目的是提供一種檢測(cè)谷子抗咪唑乙煙酸基因的分子標(biāo)記方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種抗咪唑乙煙酸基因，其特征在于，包括SEQIDNO：1或SEQIDNO：3所示的核苷酸序列組成。一種抗咪唑乙煙酸基因在培育抗除草劑谷子中的應(yīng)用，其特征在于，該基因包括SEQIDNO：1或SEQIDNO：3所示的核苷酸序列組成。imALS基因在培育抗咪唑啉酮類除草劑谷子中的應(yīng)用，其特征在于，該基因包括SEQIDNO：1或SEQIDNO：3所示的核苷酸序列組成。一種檢測(cè)谷子抗咪唑乙煙酸基因的分子標(biāo)記引物，其特征在于，正向引物為基因內(nèi)特異引物，反向引物以基因3’端外序列設(shè)計(jì)，得到特異PCR引物如下：caps-F：GGGGCTATGGGATTTGGT；caps-R：CCAAATTAGTAGAGTCCCAAAGTC。根據(jù)上述分子標(biāo)記引物用于檢測(cè)谷子抗咪唑乙煙酸基因的方法，包括如下步驟：(1)抗咪唑乙煙酸基因imALS的克?。翰捎靡镄蛄袨镕1：ACGAACGAGTGTGGCCTAAG；R1：GTCAAAGAAAGGCAAGGGCG；將目標(biāo)DNA模板經(jīng)PCR擴(kuò)增得到克隆PCR產(chǎn)物。(2)將所述克隆PCR產(chǎn)物，用所述分子標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(3)用BsrBI酶切，經(jīng)電泳后進(jìn)行觀察。步驟(1)中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為，98℃預(yù)變性5s，98℃變性12s，58℃退火10s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，72℃保溫10min。步驟(2)中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為，94℃預(yù)變性4min，94℃變性40s，55℃退火30s，72℃延伸1’20min，35個(gè)循環(huán)，72℃保溫7min。步驟(3)中，BsrBI酶切，經(jīng)電泳后進(jìn)行觀察，可根據(jù)如下方式判斷目標(biāo)DNA是否為抗性基因：如果是純合抗性基因則不能被該酶切開，酶切產(chǎn)物為一條帶；如果是敏感型基因，則酶切后，產(chǎn)物為兩條帶；如果是雜合抗性則會(huì)出才能三條帶。一種檢測(cè)抗咪唑乙煙酸基因的的試劑盒，包括引物序列F1：ACGAACGAGTGTGGCCTAAG；R1：GTCAAAGAAAGGCAAGGGCG。在一個(gè)實(shí)施例中，該試劑盒還包括引物序列，caps-F：GGGGCTATGGGATTTGGT；caps-R：CCAAATTAGTAGAGTCCCAAAGTC。在一個(gè)實(shí)施例中，該試劑盒還包括BsrBI酶。附圖說(shuō)明圖1是M1508中抗咪唑乙煙酸基因PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖。圖2是本發(fā)明的imALS-CAPs標(biāo)記區(qū)分三種基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖。圖3是本發(fā)明的BsrBI酶切結(jié)果電泳圖。圖4是本發(fā)明的imALS-CAPs標(biāo)記區(qū)分13H570×M1508F2群體中的結(jié)果電泳圖。圖5是本發(fā)明的imALS-CAPs標(biāo)記區(qū)分不同植物品種的檢測(cè)結(jié)果電泳圖。具體實(shí)施方式為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的介紹。M1508中抗咪唑乙煙酸基因imALS的克隆。參考NCBI公布的抗咪唑乙煙酸青狗尾草ALS基因序列(GenBankaccessionno.：KF020518)和豫谷1號(hào)ALS基因(GenBankaccessionno.：XM_004952503.2)序列，利用谷子基因組數(shù)據(jù)，通過(guò)本地blast獲得ALS基因兩端的序列，設(shè)計(jì)特異引物以M1508基因組DNA為模板，用Primerstar(TaKaRa)高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為F1：ACGAACGAGTGTGGCCTAAG；R1：GTCAAAGAAAGGCAAGGGCG。預(yù)測(cè)擴(kuò)增大小為2100bp左右。PCR反應(yīng)體系為：5×PrimerStarBuffer10μldNTP4μlF11.5μlR11.5μlDNA模板1μlPrimerStar0.5μlddH2O31.5μl總體積50μl反應(yīng)程序條件：98℃預(yù)變性5s，98℃變性12s，58℃退火10s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，72℃保溫10min。擴(kuò)增條帶結(jié)果與預(yù)測(cè)大小一致(圖1)，將該基因命名為imALS。擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收，與T載體(全式金)連接后送去測(cè)序，獲得擴(kuò)增目的條帶的全長(zhǎng)序列。對(duì)該序列進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)，找到長(zhǎng)為1932bp(SEQIDNO：1)，可編碼643個(gè)氨基酸的編碼框(SEQIDNO：2)。該編碼框與豫谷1號(hào)ALS基因序列比對(duì)，其相似性為99％；而與青狗尾草相比，青狗尾草序列中缺少部分5’端序列。說(shuō)明克隆基因正確。imALS抗咪唑乙煙酸除草劑的抗性位點(diǎn)分析。ALS近3’端活性位點(diǎn)中保守位點(diǎn)的突變，往往會(huì)導(dǎo)致其對(duì)ALS抑制劑類除草劑產(chǎn)生不同水平的抗性。為了驗(yàn)證M1508對(duì)咪唑乙煙酸的抗性是由于imALS基因活性位點(diǎn)處堿基突變引起的，與KF020518和XM_004952503.2序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明與XM_004952503.2序列相比imALS近3’端序列第1877為存在單堿基突變G突變A，而與KF020518的3’端序列無(wú)差異。imALS編碼氨基酸序列分析表明，該基因1877位的堿基突變導(dǎo)致626位絲氨酸取代天冬氨酸。該處氨基酸替代常引起對(duì)ALS抑制類除草劑的抗性。說(shuō)明imALS基因?qū)溥蛞覠熕岢輨┦怯捎谠摶?877為堿基突變，導(dǎo)致626位絲氨酸取代天冬氨酸引起的?？惯溥蛞覠熕峄騣mALS-CAPs標(biāo)記的開發(fā)由于imALS活性位點(diǎn)位于3’端，如在該基因內(nèi)設(shè)計(jì)引物，酶切后因片段較小無(wú)法用瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分開。設(shè)計(jì)正向引物為基因內(nèi)特異引物，反向引物以基因3’端外序列設(shè)計(jì)。為獲得3’端外序列，利用該ALS基因通過(guò)本地blast搜尋谷子基因組序列獲的該基因3’端外序列(SEQIDNO：3)。利用該序列設(shè)計(jì)特異PCR引物，caps-F：GGGGCTATGGGATTTGGT；caps-R：CCAAATTAGTAGAGTCCCAAAGTC。引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1293bp。PCR反應(yīng)體系為：2×PCRmix(全式金)10μlcaps-F0.5μlcaps-R0.5μlDNA模板1μlddH2O8μl總體積20μl反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，94℃變性40s，55℃退火30s，72℃延伸1’20min，35個(gè)循環(huán)，72℃保溫7min。采用M1508和13H570材料，經(jīng)PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2，擴(kuò)增大小與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明caps-F/R能夠特異性擴(kuò)增出目的條帶，該引物作物為該標(biāo)記的PCR引物。對(duì)咪唑乙煙酸青狗尾草突變體材料的研究發(fā)現(xiàn)，其抗性是由乙酰乳酸合酶基因中密碼子AGC突變?yōu)锳AC，導(dǎo)致654位天冬氨酸代替甘氨酸引起的。利用DNAman軟件對(duì)imALS基因突變位點(diǎn)處序列進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析，結(jié)果表明在該位點(diǎn)處存在BsrBI特異內(nèi)切酶識(shí)別序列GAGCGG，該序列為敏感型基因序列，而抗性基因中該位點(diǎn)序列為GAACGG。因此針對(duì)此位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增包含該位點(diǎn)的片段，用BsrBI酶切，如果純合抗性基因則不能被該酶切開，酶切產(chǎn)物為一條帶；如果是敏感型基因，則酶切后，產(chǎn)物為兩條帶；如果是雜合抗性則會(huì)出才能三條帶。BsrBI酶切后可產(chǎn)428和867bp大小的條帶。以M1508和13H570材料驗(yàn)證該標(biāo)記。用1.2％瓊脂糖凝膠,在5Vcm-1電壓下電泳分離PCR產(chǎn)物,用0.01％EB溶液染色15min,用紫外成像儀照相。如圖3所示。imALS-CAPs在F2群體中的驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證該標(biāo)記的可行性，檢測(cè)13H570×M1508F2植株。F2植株在苗期已噴施除草劑。故檢測(cè)植株應(yīng)為純合或雜合抗性植株。PCR擴(kuò)增及酶切同上。共檢測(cè)95株，部分檢測(cè)結(jié)果如圖4。在90株中出現(xiàn)單條帶的有30株，三條帶的有65株，未出現(xiàn)兩條帶的。根據(jù)標(biāo)記原理單條帶為純合抗性植株，三條帶為雜合抗性植株，兩條帶的為敏感型，因?yàn)槊缙谠撊后w已噴施除草劑，故未出現(xiàn)敏感類帶型，檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期一致。另外三條帶植株數(shù)與一條帶植株數(shù)比值為2:1(P＝0.7996，χ2＝0.0645)，符合孟德爾遺傳定律中F2植株純合顯現(xiàn)：雜合：純合顯性＝2:1的定律。進(jìn)而說(shuō)明該標(biāo)記鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。分別取單條帶和三條帶部分植株DNA送去測(cè)序，根據(jù)測(cè)序套峰驗(yàn)證標(biāo)記檢測(cè)的準(zhǔn)確性。測(cè)序結(jié)果表明單條帶的在突變位點(diǎn)處為單峰，為純合抗性；而三條帶的測(cè)序峰值為套峰，為雜合抗性。與標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果一致。說(shuō)明該標(biāo)記可準(zhǔn)確檢測(cè)純合抗、雜合抗和對(duì)咪唑乙煙酸敏感的基因類型，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。imALS-CAPs在不同品種中的檢測(cè)為了驗(yàn)證引物的特異性及imALS-CAPs標(biāo)記適應(yīng)性，檢測(cè)了來(lái)自不同生態(tài)區(qū)域的谷子育成品種，高代品系、地方品種、種質(zhì)資源及國(guó)外品種共100份。結(jié)果表明該引物在100份材料中都可擴(kuò)增出目的大小的特異條帶，PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果也與預(yù)期一致，部分檢測(cè)結(jié)果如圖5。說(shuō)明該標(biāo)記可用于不同生態(tài)區(qū)域，不同品種抗咪唑乙煙酸谷子選育的分子標(biāo)記，快速精準(zhǔn)鑒定純合抗、雜合抗和敏感型植株，從而加快谷子咪唑乙煙酸抗、感同型姊妹系配套品種的選育，提高育種效率。圖5中條帶說(shuō)明，1、6、11：分別為抗咪唑乙煙酸谷子M2173(河北石家莊)、鄭谷16(河南鄭州)、衡201101(河北衡水)；2、3、4、5、7、8、9、10、12：分別為咪唑乙煙酸敏感型谷子冀谷31(河北石家莊)、濟(jì)0626-4(山東濟(jì)南)、滄368(河北滄州)、晉谷21(山西長(zhǎng)治)、0517-1-12(山東泰安)、旱千谷(地方品種)、黃殼狗尾粟(種質(zhì)資源)、金香玉(內(nèi)蒙赤峰)、錦谷(遼寧)。在一個(gè)實(shí)施例中，本專利中所述imALS基因應(yīng)于在培育抗咪唑啉酮類除草劑谷子，該基因包括SEQIDNO：1或SEQIDNO：3所示的核苷酸序列組成。咪唑乙煙酸屬于咪唑啉酮類除草劑之一，咪唑啉酮類除草劑是ALS類除草劑中應(yīng)用最廣泛的一類除草劑，包括咪唑乙煙酸、咪唑煙酸、甲咪唑煙酸、甲氧咪草煙等。該類除草劑作用方式與咪唑乙煙酸相同。本專利中所述抗咪唑乙煙酸基因也可用于創(chuàng)制除咪唑乙煙酸外的，其它咪唑啉酮類抗除草劑谷子。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3