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      一種降低水稻籽粒落粒性的分子改良方法與流程

      文檔序號:11936813閱讀:來源:國知局

      技術(shù)特征:

      1.一種利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向修飾水稻落粒性基因qSH1降低水稻落粒性的分子遺傳改良方法,其特征包括如下步驟:

      1)根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶點設(shè)計要求,在qSH1或LOC_Os01g62920或Os01g0848400編碼區(qū)和起始密碼子5’端附近區(qū)域選擇合適的靶點;

      2)構(gòu)建含靶點序列的pYLgRNA-U3、pYLgRNA-U6a載體;

      3)利用所述的pYLgRNA-U3、pYLgRNA-U6a載體構(gòu)建含有靶點序列的pCRISPR/Cas9重組載體;

      4)將所獲得的pCRISPR/Cas9重組載體導入受體水稻中,獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株;

      5)利用上述轉(zhuǎn)基因陽性植株獲得靶向突變的突變植株;

      6)利用上述突變植株加代種植后獲得不含轉(zhuǎn)基因成分的純合突變植株;

      7)利用上述純合突變植株經(jīng)落粒性調(diào)查獲得落粒性顯著降低的植株作為落粒性改良株。

      2.如權(quán)利要求1所述的方法,其中,步驟1)中所述靶點雙鏈片段中的一條鏈具有結(jié)構(gòu)5’-(N)X-NGG-3’, N 表示A,T,C 和G 中的任意一個,較好的靶點序列X為19或20且以A或G開頭,并且靶標序列NGG上游的12bp應(yīng)在水稻基因組中有較好的特異性。

      3.如權(quán)利要求1所述的方法,其中,步驟2)具體步驟為:先分別合成帶有粘性末端的寡鏈靶點引物,將兩條互補配對的寡鏈靶點引物變性后移至室溫冷卻完成退火形成雙鏈靶點片段,將退火后的雙鏈靶點片段連接到經(jīng)酶切后的pU3-gRNA或pU6a-gRNA載體上并利用PCR擴增含有靶點的gDNA表達盒。

      4.如權(quán)利要求1所述的方法,其中,步驟3)具體步驟為:將PCR擴增后的gDNA表達盒連接到含Cas9 表達盒的pCRISPR/Cas9載體上。

      5.如權(quán)利要求1所述的方法,其中,步驟4)具體步驟為:將含靶點的pCRISPR/Cas9重組載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織,經(jīng)篩選、分化、生根和煉苗后,種植于溫室;通過潮霉素基因分子檢測鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)基因水稻植株。

      6.如權(quán)利要求1所述的方法,其中,步驟5)具體步驟為:選擇上述陽性轉(zhuǎn)基因水稻的DNA,用核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物擴增上述DNA,擴增產(chǎn)物純化后測序,測序結(jié)果與野生型序列比對,分析轉(zhuǎn)基因植株是否在預期靶點區(qū)域發(fā)生突變,并分析突變類型、突變靶點基因型,獲得T0代突變水稻植株。

      7.如權(quán)利要求6所述的方法,其中,步驟6)具體步驟為:收獲T0代突變植株的種子,繼續(xù)種植T1代分離群體,通過潮霉素分子檢測、靶點擴增測序分析獲得靶點基因純合且不帶轉(zhuǎn)基因成分的植株。

      8.如權(quán)利要求1所述的方法,其中,步驟7)具體步驟為:選擇上述植株黃熟期的主穗或大分蘗穗通過儀器法測定籽粒落粒程度,獲得落粒性顯著降低的植株。

      9.如權(quán)利要求1所述的方法,其中,步驟1)中設(shè)計的兩條靶點序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;

      上述兩條靶點序列均含有5’-(N)X-NGG-3’結(jié)構(gòu),加框部分為NGG結(jié)構(gòu),其中Target-qSH1-5為反向互補鏈。

      10.如權(quán)利要求9所述的方法,其中,構(gòu)建含Target-qSH1-1、Target-qSH1-5雙靶點的pYLgRNA-U3、pYLgRNA-U6a載體:首先分別合成帶有粘性末端的寡鏈靶點引物,其中Target-qSH1-1引物的正、反向序列分別如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示,Target-qSH1-5 引物的正、反向序列分別如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示,將兩對寡鏈靶點引物變性后冷卻至室溫完成退火,在將退火后的兩個片段分別接連到pYLgRNA-U6a、pYLgRNA-U3載體上,并利用PCR分別擴增含有Target-qSH1-5、Target-qSH1-1靶點的gDNA表達盒。

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