技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及應用大規(guī)模平行序列分析儀進行HLA基因的DNA分型的方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

作為人主要組織相容性復合物（MHC）的人白細胞抗原（HLA）通過向T細胞呈遞衍生自病原體等外來蛋白質(zhì)的肽以及衍生自自身蛋白質(zhì)的肽而深入地牽涉免疫應答的誘導，有6種抗原已知為主要的HLA。即，幾乎在所有細胞中表達的I類分子（HLA-A、HLA-B、HLA-C）與主要在免疫系統(tǒng)細胞中表達的II類分子（HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP）。

HLA I類抗原由表現(xiàn)高度多態(tài)性的α鏈和幾乎沒有多態(tài)性的β2-微球蛋白組成，HLA II類抗原由存在高度多態(tài)的β鏈和多態(tài)性低的α鏈組成。I類分子的α鏈由HLA-A、HLA-B、HLA-C各基因編碼，II類抗原的β鏈由HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DPB1基因編碼，α鏈由HLA-DRA1、HLA-DQA1、HLA-DPA1基因編碼。在基因水平，在HLA I類抗原中，編碼α鏈的基因的外顯子2和外顯子3顯示高度多態(tài)性，在HLA II類抗原中，編碼β鏈的基因的外顯子2顯示高度多態(tài)性。

編碼HLA的基因區(qū)域位于人6號染色體短臂6p21.3，從端粒側(cè)至著絲粒側(cè)，以I類區(qū)域（HLA-A、HLA-C、HLA-B等）、III類區(qū)域、II類區(qū)域（HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1等）的順序排列，許多基因以非常高的密度編碼，這些基因與輸血、移植和各種疾病的關(guān)聯(lián)被報告。在III類區(qū)域中不存在HLA基因，存在補體成分、腫瘤壞死因子（TNF）等的基因。

在編碼HLA-DR抗原的β鏈的HLA-DRB基因區(qū)域中，確認了5種結(jié)構(gòu)多態(tài)性。在DR1型和DR10型中，在同一染色體上，除HLA-DRB1之外還定位HLA-DRB6和HLA-DRB9等假基因。在DR2型中，在同一染色體上，除HLA-DRB1之外還定位HLA-DRB5（DR51）基因以及HLA-DRB6和HLA-DRB9等假基因。在DR3、DR5以及DR6型中，除HLA-DRB1之外，在同一染色體上還定位HLA-DRB3（DR52）基因以及HLA-DRB2和HLA-DRB9等假基因。在DR4、DR7以及DR9型中，除HLA-DRB1之外，在同一染色體上還定位HLA-DRB4（DR53）基因以及HLA-DRB7、HLA-DRB8和HLA-DRB9等假基因。與這些相對，在DR8型中，在同一染色體上沒有定位HLA-DRB1之外的HLA-DRB基因。

在各等位基因的外顯子中，存在顯示多態(tài)性的多個區(qū)域，在許多情況下，特定多態(tài)區(qū)域的堿基序列（氨基酸序列）在多個等位基因中是共同的。即，各HLA等位基因通過多個多態(tài)區(qū)域的組合而指定。在HLA I類抗原中，不僅外顯子內(nèi)的多態(tài)區(qū)域、而且具有同一堿基序列的外顯子2或外顯子3有時在多個等位基因中是共同的。

由于HLA中存在高度多態(tài)，已知等位基因的種類極多，它們的表示法也得到確定。也即，辨別血清學HLA型的第1領(lǐng)域（2位數(shù)(two-digit)水平）、辨別同一血清學HLA型內(nèi)伴有氨基酸置換的等位基因的第2領(lǐng)域（4位數(shù)水平）、辨別具有不伴有氨基酸突變的堿基置換的等位基因的第3領(lǐng)域（6位數(shù)水平）、和辨別編碼HLA分子的基因區(qū)域外（內(nèi)含子）中伴有堿基置換的等位基因的第4領(lǐng)域（8位數(shù)水平）。

認為在骨髓移植時，如果希望移植者與供體的HLA型在4位數(shù)水平完全匹配，移植的成功率提高，重度GVHD頻率降低。相反，如果HLA型在4位數(shù)水平不匹配，產(chǎn)生引起排斥反應等失敗的風險增加。因此，準確且高精度地進行HLA分型在臨床上是極端重要的。

作為HLA基因中的DNA分型法，基于聚合酶鏈式反應（PCR）的SBT（基于序列分型）法和SSO（序列特異性寡核苷酸）-Luminex法是主流。

這些常規(guī)的DNA分型法具有可以對多數(shù)樣品迅速分型的優(yōu)勢，但是，有時不能準確確定多態(tài)區(qū)域和I類基因情況下外顯子在染色體上的順反位置關(guān)系，因此，產(chǎn)生相位模糊（phase ambiguity），有時難以進行高精度的HLA分型。

另外，常規(guī)方法是以各基因外顯子區(qū)域為中心應用PCR的DNA分型法，因此，忽略了內(nèi)含子區(qū)域和啟動子區(qū)域中的堿基置換，其結(jié)果是，對基因結(jié)構(gòu)與其它表達HLA基因一樣但表達抑制的無效等位基因的檢測有可能失敗。

現(xiàn)有技術(shù)文獻

專利文獻

專利文獻1 : 特開平11-216000號公報

非專利文獻

非專利文獻1 : Lind C.等，Human Immunology，第71卷，1033-1042頁（2010年）。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的課題

本發(fā)明的課題是，提供高精度的DNA分型方法和試劑盒，其排除了相位模糊引起的不明確。

解決課題的手段

本發(fā)明人基于新想法反復研究上述課題，從而完成本發(fā)明，所述新想法為，新設(shè)計能夠特異性擴增I類HLA分子HLA-A、HLA-B和HLA-C以及II類HLA分子HLA-DRB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1這些HLA基因的PCR引物，設(shè)定合適的PCR條件，應用大規(guī)模平行測序技術(shù)。

也即，本發(fā)明提供了包含以下步驟的HLA的DNA分型方法。

（1）制備對人基因組堿基序列中HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1各基因的上游區(qū)域和下游區(qū)域分別特異性退火的引物組以及對HLA-DRB1的外顯子2和3'側(cè)非翻譯區(qū)域特異性退火的引物組的步驟；

（2）應用前述引物組對被測試樣（DNA）進行PCR擴增的步驟；

（3）確定PCR擴增產(chǎn)物的堿基序列的步驟；和

（4）進行與數(shù)據(jù)庫的同源性檢索的步驟。

發(fā)明效果

本發(fā)明方法得到對來自1分子的HLA基因進行DNA分型所需的全部堿基序列，因此為排除了順反位置關(guān)系不清楚的相位模糊的最終DNA分型法。通過該方法，實現(xiàn)了移植時希望移植者與供體候選者之間高精度的HLA匹配。

由于含有HLA基因的啟動子區(qū)域、外顯子區(qū)域、內(nèi)含子區(qū)域等周邊區(qū)域的基因全部堿基序列得到確定，可以檢測出完全不表達或表達抑制的無效等位基因和新穎的等位基因。

附圖說明

[圖1] （a）示出HLA I類基因結(jié)構(gòu)與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)性的圖。（b）示出HLA I類基因的啟動子區(qū)域的結(jié)構(gòu)的圖。引用自Transplantation/transfusion Examination，Hidetoshi Inoko、Takehiko Sasazuki和Takeo Juuji編輯，Kodan-sha Scientific，2004年，第35頁。

[圖2] （a）示出HLA II類基因結(jié)構(gòu)與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)性的圖。（b）示出HLA II類基因的啟動子區(qū)域的結(jié)構(gòu)的圖。引用自Transplantation/transfusion Examination，Hidetoshi Inoko、Takehiko Sasazuki和Takeo Juuji編輯，Kodan-sha Scientific，2004年，第46頁至第47頁。

[圖3] 示出HLA-DR基因區(qū)域的圖。引用自Transplantation/transfusion Examination，Hidetoshi Inoko、Takehiko Sasazuki和Takeo Juuji編輯，Kodan-sha Scientific，2004年，第48頁。

[圖4] 示出實施例1中擴增的PCR產(chǎn)物的擴增狀況的瓊脂糖凝膠電泳圖。

[圖5] 示出HLA基因的基因結(jié)構(gòu)與設(shè)計PCR引物的位置的示意圖（括號內(nèi)指明在該區(qū)域設(shè)計的引物的序列編號）。

[圖6] 示出實施例2中擴增的HLA基因的PCR擴增狀況的瓊脂糖凝膠電泳圖。

[圖7] 示出實施例3中3種DNA提取法得到的各PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

具體實施方式

下文對本發(fā)明DNA分型方法按步驟詳細說明。

（1）引物組制備步驟

在本發(fā)明的DNA分型方法中，首先，制備對人基因組堿基序列中HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1各基因的上游區(qū)域和下游區(qū)域分別特異性退火的引物組，以及對HLA-DRB1的外顯子2和3'側(cè)的非翻譯區(qū)域特異性退火的引物組。

包含HLA基因存在的區(qū)域的人第6號染色體（6p21.3）的基因組堿基序列已經(jīng)闡明，其基因結(jié)構(gòu)與表達產(chǎn)物（HLA分子）的結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)也是已知的（參考圖1和圖2）。

也即，稱為經(jīng)典HLA I類分子的HLA-A、HLA-B和HLA-C的基因含有7個或8個外顯子（圖1（a）），外顯子1的外側(cè)有2種增強子和啟動子區(qū)域調(diào)節(jié)表達（圖1（b））。

進一步地，外顯子2、3和4中存在多個多態(tài)區(qū)域也是已知的，因此，在常規(guī)的DNA分型方法中，應用尤其基于外顯子2和3制備的引物進行PCR，隨之產(chǎn)生如上述的相位模糊問題。

另外，稱為經(jīng)典的HLA II類分子的HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP由α鏈與β鏈構(gòu)成，其各自基因包含5個或6個外顯子（圖2（a）），外顯子1的外側(cè)有啟動子區(qū)域調(diào)節(jié)表達（圖2（b））。

進一步地，外顯子2和3中存在多個多態(tài)區(qū)域也是已知的，因此，在常規(guī)的DNA分型方法中，應用尤其基于外顯子2制備的引物進行PCR，隨之產(chǎn)生如上述的相位模糊問題。

本發(fā)明中，制備引物組，其能夠PCR擴增經(jīng)典的I類分子（HLA-A，HLA-B，HLA-C）以及經(jīng)典的II類分子的HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1的基因區(qū)域的全部（不僅包含外顯子，也包含內(nèi)含子、5'側(cè)與3'側(cè)非翻譯區(qū)域、啟動子區(qū)域）、HLA-DRB1的含有外顯子2至3'側(cè)非翻譯區(qū)域的基因區(qū)域，應用該引物組PCR擴增的PCR產(chǎn)物接受下述下一代測序（next-generation sequencing），因此能夠排除相位模糊等的不確定性，也能夠正確檢測無效等位基因的有無。

具體地，制備下述表1至表4中列出的PCR引物組。

表1中序列編號1至3是特異性擴增作為MHC I類α鏈的HLA-A基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-A基因全部區(qū)域（包含啟動子、外顯子和內(nèi)含子）從上游側(cè)和下游側(cè)夾入（挾み込む）。

序列編號1具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第29,909,487號至第29,909,514號的堿基序列。

序列編號2具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第29,909,487號至第29,909,514號的堿基序列。

序列編號3具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第29,914,925號至第29,914,952號的堿基序列互補的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約5,500個堿基（bp）。

表1中序列編號4至5是特異性擴增作為MHC I類α鏈的HLA-B基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-B基因全部區(qū)域（包含啟動子、外顯子和內(nèi)含子）從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號4具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第31,325,796號至第31,325,820號的堿基序列互補的堿基序列。

序列編號5具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第31,321,212號至第31,321,235號的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約4,600個堿基（bp）。

表1中序列編號6至8是特異性擴增作為MHC I類α鏈的HLA-C基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-C基因全部區(qū)域（包含啟動子、外顯子和內(nèi)含子）從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號6具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第31,240,868號至第31,240,892號的堿基序列互補的堿基序列。

序列編號7具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第31,240,868號至第31,240,892號的堿基序列互補的堿基序列。

序列編號8具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第31,236,991號至第31,236,114號的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約4,800個堿基（bp）。

[表1]

表2中序列編號9至11是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DRB1基因的HLA-DR1亞型基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的外顯子2至3'非翻譯區(qū)域從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號9具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,552,131號至第32,552,156號的堿基序列互補的堿基序列。

序列編號10具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,552,131號至第32,552,156號的堿基序列互補的堿基序列。

序列編號11具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,546,609號至第32,546,629號的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約5,200個堿基（bp）。

表2中序列編號31、32是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DRB1基因的HLA-DR1、HLA-DR4、HLA-DR6（DR13）、HLA-DR10亞型基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的5'非翻譯區(qū)域至外顯子2從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號31具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,558,110號至第32,558,133號的堿基序列互補的堿基序列。

序列編號32具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,551,974號至第32,551,999號的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是HLA-DR1亞型約6,100個堿基（bp）、HLA-DR4亞型約9,100個堿基（bp）、HLA-DR6（DR13）亞型約8,900個堿基（bp）、HLA-DR10亞型約8,900個堿基（bp）。

表2中序列編號11和12是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DRB1基因的HLA-DR2亞型基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的外顯子2至3'非翻譯區(qū)域從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號11如上述。

序列編號12具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,552,130號至第32,552,151號的堿基序列互補的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約5,500個堿基（bp）。

表3中序列編號31和33是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DRB1基因的HLA-DR2（DR15）亞型基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的5'非翻譯區(qū)域至外顯子2從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號31如上述。

序列編號33具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,551,974號至第32,551,999號的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約6,100個堿基（bp）。

表2中序列編號13和14是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DRB1基因的HLA-DR3、HLA-DR5、HLA-DR6、HLA-DR8亞型基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的外顯子2至3'非翻譯區(qū)域從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號13具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,552,137號至第32,552,160號的堿基序列互補的堿基序列。

序列編號14具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,546,609號至第32,546,629號的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約5,100個堿基（bp）。

表2中序列編號34和32是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DRB1基因的HLA-DR3亞型基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的5'非翻譯區(qū)域至外顯子2從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號34具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,558,110號至第32,558,133號的堿基序列互補的堿基序列。

序列編號32如上述。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約8,900個堿基（bp）。

表2中序列編號15和16是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DRB1基因的HLA-DR4亞型基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的外顯子2至3'非翻譯區(qū)域從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號15具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,552,131號至第32,552,157號的堿基序列互補的堿基序列。

序列編號16具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,546,609號至第32,546,629號的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約6,200個堿基（bp）。

表2中序列編號31和35是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DRB1基因的HLA-DR5（DR11）亞型基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的5'非翻譯區(qū)域至外顯子2從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號31如上述。

序列編號35具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,551,974號至第32,551,999號的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約8,900個堿基（bp）。

表2中序列編號31和36是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DRB1基因的HLA-DR5（DR12）亞型基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的5'非翻譯區(qū)域至外顯子2從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號31如上述。

序列編號36具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,551,974號至第32,551,999號的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約8,900個堿基（bp）。

[表2]

表3中序列編號31和37是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DRB1基因的HLA-DR6（DR14）亞型基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的5'非翻譯區(qū)域至外顯子2從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號31如上述。

序列編號37具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,551,974號至第32,551,999號的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約8,900個堿基（bp）。

表3中序列編號17和18是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DRB1基因的HLA-DR7亞型基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的外顯子2至3'非翻譯區(qū)域從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號17具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,552,137號至第32,552,160號的堿基序列互補的堿基序列。

序列編號18具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,546,606號至第32,546,629號的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約5,100個堿基（bp）。

表3中序列編號38和36是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DRB1基因的HLA-DR7、HLA-DR9亞型基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的5'非翻譯區(qū)域至外顯子2從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號38具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,558,110號至第32,558,133號的互補的堿基序列。

序列編號36如上述。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約11,400個堿基（bp）。

表3中序列編號31和39是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DRB1基因的HLA-DR8亞型基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的5'非翻譯區(qū)域至外顯子2從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號31如上述。

序列編號39具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,551,974號至第32,551,999號的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約8,900個堿基（bp）。

表3中序列編號19和20是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DRB1基因的HLA-DR9亞型基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的外顯子2至3'非翻譯區(qū)域從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號19具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,552,137號至第32,552,160號的堿基序列互補的堿基序列。

序列編號20具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,546,609號至第32,546,629號的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約5,100個堿基（bp）。

表3中序列編號21和22是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DRB1基因的HLA-DR10亞型基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DRB1基因的外顯子2至3'非翻譯區(qū)域從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號21具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,552,137號至第32,552,159號的堿基序列互補的堿基序列。

序列編號22具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,546,403號至第32,546,435號的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約5,400個堿基（bp）。

[表3]

表4中序列編號23和24是特異性擴增作為MHC II類α鏈的HLA-DPA1基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DPA1基因的全部區(qū)域（包含啟動子、外顯子和內(nèi)含子）從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號23具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第33,041,478號至第33,041,502號的堿基序列互補的堿基序列。

序列編號24具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第33,031,888號至第33,031,911號的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約9,600個堿基（bp）。

表4中序列編號40和41是特異性擴增作為MHC II類α鏈的HLA-DPA1基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DPA1基因的全部區(qū)域（包含啟動子、外顯子和內(nèi)含子）從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號40具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第33,041,573號至第33,041,596號的堿基序列互補的堿基序列。

序列編號41具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第33,031,888號至第33,031,912號的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約9,600個堿基（bp）。

表4中序列編號25和26是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DPB1基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DPB1基因的全部區(qū)域（包含啟動子、外顯子和內(nèi)含子）從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號25具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第33,043,056號至第33,043,079號的堿基序列。

序列編號26具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第33,055,476號至第33,055,499號的堿基序列互補的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約12,400個堿基（bp）。

表4中序列編號42和43是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DPB1基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DPB1基因的5'非翻譯區(qū)域至外顯子2從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號42具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第33,043,168號至第33,043,191號的堿基序列。

序列編號43具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第33,049,084號至第33,049,107號的堿基序列互補的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約5,900個堿基（bp）。

表4中序列編號44和45是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DPB1基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DPB1基因的外顯子2至3'非翻譯區(qū)域從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號44具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第33,048,182號至第33,048,207號的堿基序列。

序列編號45具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第33,055,428號至第33,055,453號的堿基序列互補的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約7,200個堿基（bp）。

表4中序列編號27和28是特異性擴增作為MHC II類α鏈的HLA-DQA1基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DQA1基因的全部區(qū)域（包含啟動子、外顯子和內(nèi)含子）從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號27具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,604,318號至第32,604,338號的堿基序列。

序列編號28具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,611,681號至第32,611,701號的堿基序列互補的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約7,400個堿基（bp）。

表4中序列編號46和47是特異性擴增作為MHC II類α鏈的HLA-DQA1基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DQA1基因的全部區(qū)域（包含啟動子、外顯子和內(nèi)含子）從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號46具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,604,469號至第32,604,488號的堿基序列。

序列編號47具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,611,936號至第32,611,956號的堿基序列互補的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約7,400個堿基（bp）。

表4中序列編號29和30是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DQB1基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DQB1基因的全部區(qū)域（包含啟動子、外顯子和內(nèi)含子）從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號29具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,626,545號至第32,626,568號的堿基序列。

序列編號30具有與相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,635,612號至第32,635,637號的堿基序列互補的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約9,100個堿基（bp）。

表4中序列編號29、30、48-50是特異性擴增作為MHC II類β鏈的HLA-DQB1基因的PCR引物組。這些引物組是在下列位置存在的堿基序列，其將人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中HLA-DQB1基因的全部區(qū)域（包含啟動子、外顯子和內(nèi)含子）從上游側(cè)和下游側(cè)夾入。

序列編號29和48具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,626,545號至第32,626,568號的堿基序列。

序列編號30、49、50具有相應于人基因組堿基序列（參考序列：hg19）中第32,635,612號至第32,635,637號的互補的堿基序列。

應用這些引物組得到的PCR產(chǎn)物的預測長度是約9,100個堿基（bp）。

[表4]

這些引物可以用本領(lǐng)域常用的方法制備。另外，表1和表2中記載的引物組是最優(yōu)選的例子，在本發(fā)明的方法中，可以使用任何引物組，只要是可以在將HLA的各基因全部區(qū)域從上游側(cè)和下游側(cè)夾入的位置退火的正向引物和反向引物的組。

（2）PCR擴增步驟

在本發(fā)明的方法中，應用前述步驟（1）中制備的引物組，對被測試樣（DNA）進行PCR擴增。

PCR擴增反應按照通常的方案實施。具體如下。

1．取決于被測試樣的形式，從該試樣提取DNA。

2．對提取的DNA定量，設(shè)定合適引物濃度并配制反應液。

3．設(shè)定反應條件進行PCR反應。

例如：熱變性步驟（通常92至97℃）

退火步驟（通常55至72℃）

延伸步驟（通常65至80℃）

在本發(fā)明的方法中，在除HLA-DRB1的HLA基因的情況下，優(yōu)選前述退火步驟的溫度設(shè)為約60℃。由于在約60℃退火，可以等比率（均一地）生成等位基因。另外，對于HLA-DRB1，優(yōu)選前述退火步驟的溫度設(shè)為約70℃。由于在約70℃退火，可以特異性地僅產(chǎn)生目的DR亞型。

4．純化得到的PCR產(chǎn)物，進行隨后的堿基序列確定步驟。

（3）堿基序列確定步驟。

隨后，確定前述步驟（2）中生成的PCR產(chǎn)物（擴增DNA）的堿基序列。該步驟優(yōu)選應用稱為下一代測序（或超高速測序）的方法進行。關(guān)于下一代測序，參考例如Experimental Medicine, Vol. 27, No. 1, 2009 (Yodo-sha)等。

在本說明書中，應用Roche的基因組序列分析儀FLX系統(tǒng)基于焦磷酸測序的序列確定方法在下文記載。

1．前述步驟（2）中得到的PCR產(chǎn)物通過霧化器片段化成約500個堿基左右。

2．在該片段化的DNA片段的末端附加DNA銜接子。

3．將附加了DNA銜接子的DNA片段制成單鏈DNA片段后，將其通過銜接子與珠子結(jié)合，將得到的珠子包埋入油包水型乳劑（形成1個珠子結(jié)合1個DNA片段的微反應器環(huán)境）。

4．實施乳劑PCR反應，在各珠子上形成各DNA片段的拷貝（各DNA片段在各微反應器內(nèi)克隆擴增，因此能夠不與其他序列競爭地、同時平行地實施多數(shù)片段的擴增）。隨后，破壞乳劑并且回收具有擴增的DNA片段的珠子。

5．濃縮珠子，將珠子裝載在picotiter板中（1個孔的尺寸為放入1個珠子）。

6．對各珠子，通過螢光素酶的熒光反應檢測聚合酶在酶反應時產(chǎn)生的焦磷酸，根據(jù)發(fā)光的強度和模式確定DNA的堿基序列。以一定順序加入4種核酸（A、C、G、T），記錄相應于添加的核酸的化學發(fā)光模式，基于其信號強度與位置信息的組合確定堿基序列。

（4）DNA分型步驟

然后，將前述步驟（3）中得到的堿基序列與已知的HLA等位基因的堿基序列數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行比較，從而確定被測試樣中包含的DNA的等位基因型（直至8位數(shù)）。

本發(fā)明方法以前述表1中記載的引物組作為代表例。其特征是，在夾入HLA I類和除HLA-DRB1之外的HLA II類的各基因全部區(qū)域、以及HLA-DRB1的外顯子2至3'非翻譯區(qū)域的位置設(shè)定引物，確定跨越幾乎全部區(qū)域擴增的DNA的序列，從而排除相位模糊（不確定性），能夠獲得與無效等位基因相關(guān)的信息。

實施例

下文舉出具體例對本發(fā)明進行更詳細地說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。

（實施例1）

［實驗方法］

1．以已提取的基因組DNA作為模板，應用各HLA I類基因特異性引物組（參考表1：序列編號1至8）進行PCR反應。具體順序如下。

（1）PCR擴增應用Prime STAR GXL聚合酶（TaKaRa）。即，在50 ng的基因組DNA溶液中，加入4 μL的5 × PrimeSTAR GXL緩沖液、1.6 μL的dNTP溶液、各4μL（1pmol／μL）的PCR引物、0.8μL的Prime STAR GXL聚合酶，用滅菌水將反應液總量調(diào)整至20μL。

（2）在94度保溫2分鐘后，隨后將98度10秒、60度20秒、68度5分鐘的3步驟作為1個工序重復30次。另外，該PCR擴增中應用GeneAmp PCR System 9700 （Applied Biosystems）。PCR后，通過瓊脂糖凝膠電泳確認PCR產(chǎn)物的擴增情況。其電泳圖示于圖4。

2．確定PCR產(chǎn)物的堿基序列。具體地，如下進行。

（1）將PCR產(chǎn)物按照QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）的標準方案純化。

（2）按照PicoGreen dsDNA Quantitation Kit（Invitrogen）的標準方案測定濃度。

（3）將純化的PCR產(chǎn)物調(diào)整至500ng／100μL的濃度，按照Genome Sequencer（GS）Junior（Roche）的標準方案進行快速文庫（rapid library）的制備、乳劑PCR、測序，獲得1個樣品1萬個讀出（reads）的堿基序列。

（4）通過GS de novo Assembler（Roche）組合和編輯這些序列，之后通過與DNA數(shù)據(jù)庫上已知堿基序列的同源性檢索，鑒定HLA基因的等位基因。

［討論］

在HLA-A、HLA-B以及HLA-C中，設(shè)計分別特異性擴增5.5kb、4.6kb以及4.8kb的PCR引物。根據(jù)PCR條件的研究以及這些PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，對各HLA I類基因得到PCR產(chǎn)物，同時在目的分子量位置得到單一的擴增產(chǎn)物（圖4）。另外，通過Sanger法確定PCR產(chǎn)物的堿基序列，結(jié)果得到與已知不矛盾的HLA等位基因，因此確認本PCR系統(tǒng)能夠用于HLA分型。

應用3個樣本的HLA-B*40：02純合子以及17個樣本的包含在常規(guī)DNA分型法中觀察到的相位模糊的等位基因的組合（B*40和B*55）的HLA-B*40：02雜合子，通過GS Junior對來自HLA-B基因的PCR產(chǎn)物進行HLA分型，結(jié)果從所有樣本檢測出HLA-B*40：02：01：01，在17個樣本的雜合子中，除15種已知等位基因，還檢測出2種新的等位基因。尤其是，對于觀察到相位模糊的等位基因的組合（B*40和B*55）的1個樣本，能夠分型為HLA-B*40：02：01：01和HLA-B*55：02：01：01。因此本發(fā)明方法能夠無相位模糊地在8位數(shù)水平進行HLA分型，同時是用于高效檢測作為無效等位基因的原因的啟動子和內(nèi)含子內(nèi)的堿基置換、插入和缺失的良好手段。

（實施例2）

［實驗方法］

1．以已提取的基因組DNA作為模板，應用HLA I類和HLA II類各基因特異性引物組（參考表1至4：序列編號1至8、9至22、31至50）進行PCR反應。具體順序如下。

（1）PCR擴增應用Prime STAR GXL聚合酶（TaKaRa）。即，在50 ng的基因組DNA溶液中，加入4 μL的5 × PrimeSTAR GXL緩沖液、1.6 μL的dNTP溶液、1至7 μL（4 pmol／μL）的PCR引物、0.8 μL的Prime STAR GXL聚合酶，用滅菌水將反應液總量調(diào)整至20μL。

（2）在94度保溫2分鐘后，隨后將98度10秒、70度5分鐘的2步驟作為1個工序重復30次。另外，該PCR擴增中應用GeneAmp PCR System 9700 （Applied Biosystems）。PCR后，通過瓊脂糖凝膠電泳確認PCR產(chǎn)物的擴增情況。其電泳圖示于圖6。

2．確定PCR產(chǎn)物的堿基序列。具體地，如下進行。

（1）將PCR產(chǎn)物按照QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）的標準方案純化。

（2）按照PicoGreen dsDNA Quantitation Kit（Invitrogen）的標準方案測定濃度。

（3）將純化的PCR產(chǎn)物調(diào)整至100 ng的濃度，按照Ion Personal Genome Machine（Ion PGM）（LifeTechnologies）的標準方案進行片段庫的制備、乳劑PCR、測序，獲得1個樣品30萬個讀出的堿基序列。

（4）通過GS De Novo Assembler（Roche）組合和編輯這些序列，之后通過與DNA數(shù)據(jù)庫上已知堿基序列的同源性檢索，鑒定HLA基因的等位基因。

［結(jié)果和討論］

1．在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1的5'非翻譯區(qū)域至外顯子2，HLA-DRB1的外顯子2至3'非翻譯區(qū)域，HLA-DQB1、HLA-DPB1的5'非翻譯區(qū)域至外顯子2和HLA-DPB1的外顯子2至3'非翻譯區(qū)域，設(shè)計特異性擴增各自4kb至12kb的PCR引物。根據(jù)PCR條件的研究以及這些PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，對HLA I類和HLA II類的各基因得到PCR產(chǎn)物，同時在目的分子量位置得到單一的擴增產(chǎn)物（圖6）。另外，通過Sanger法確定PCR產(chǎn)物的堿基序列，結(jié)果得到與已知不矛盾的HLA等位基因，因此再次確認本PCR系統(tǒng)能夠用于HLA分型。

2．應用包含在常規(guī)DNA分型法中觀察到相位模糊的等位基因的組合的4個樣本，通過Ion PGM對來自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1的5'非翻譯區(qū)域至外顯子2，HLA-DRB1的外顯子2至3'非翻譯區(qū)域，HLA-DQB1、HLA-DPB1的5'非翻譯區(qū)域至外顯子2和HLA-DPB1的外顯子2至3'非翻譯區(qū)域的各基因的PCR產(chǎn)物進行HLA分型，結(jié)果對于HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1，可以進行全部基因區(qū)域的分型。對于HLA-DPB1，可以進行僅外顯子部分的分型。進一步地，對于HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1的各基因，檢測出新的等位基因。因此本發(fā)明方法能夠無相位模糊地在8位數(shù)水平進行HLA分型，同時是用于高效檢測作為無效等位基因的原因的啟動子和內(nèi)含子內(nèi)的堿基置換、插入和缺失的良好手段。

（實施例3）

［實驗方法］

1．應用Buccal Cell DNA Extraction Kit，BuccalQuick（TRIMGEN）提取基因組DNA。

2．將應用Buccal Cell DNA Extraction Kit，BuccalQuick（TRIMGEN）提取的基因組DNA進一步通過異丙醇和乙醇純化。

3．應用QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN）提取基因組DNA。

4．應用第1至3項中提取的基因組DNA各3個樣本，通過與實施例1和實施例2同樣的實驗方法，應用HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQB1特異性引物組（參考表1和表4：序列編號1至8、29、30、48至50）進行PCR反應。PCR后，通過瓊脂糖凝膠電泳確認PCR產(chǎn)物的擴增情況。其電泳圖示于圖7。

［實驗結(jié)果和討論］

圖7的泳道1至3顯示用實驗方法1提取的情況下PCR產(chǎn)物的擴增情況，泳道4至6顯示用實驗方法2提取的情況下PCR產(chǎn)物的擴增情況，泳道7至9顯示用實驗方法3提取的情況下PCR產(chǎn)物的擴增情況。對于任一基因，以用實驗方法1提取的基因組DNA作為模板的PCR擴增都與用實驗方法3提取的基因組DNA等價地得到目的PCR產(chǎn)物。實驗方法3中伴隨采血，但實驗方法1中可從口腔粘膜采取細胞，因此證明，如果應用本發(fā)明方法，在不可能采血的情況下也可以充分地進行HLA分型。

序列表

<110> TOKAI University Educational System

<120> Method and Kit for DNA typing of HLA genes

<130> PC0879GDP

<150> JP 2011-159832

<151> 2011-07-21

<160> 30

<170> Patent In version 3.1

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 1

AACTC AGAGC TAAGG AATGA TGGCA AAT 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 2

AACTC AGAGC TATGG AATGA TGGTA AAT 28

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 3

ATATA ACCAT CATCG TGTCC CAAGG TTC 28

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 4

CCCGG TTGCA ATAGA CAGTA ACAAA 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 5

GGGTC CAATT TCACA GACAA ATGT 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 6

TGCTT AGATG TGCAT AGTTC ACGAA 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 7

TGCTT AGATG TGCAT AGTTC CGGAA 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 8

TGGAC CCAAT TTTAC AAACA AATA 24

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 9

GCACG TTTCT TGTGG CAGCT TAAGT T 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 10

GCACG TTTCT TGTGG CAGCT AAAGT T 26

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 11

ATGCA CGGGA GGCCA TACGG T 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 12

TTTCC TGTGG CAGCC TAAGA GG 22

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 13

CACAG CACGT TTCTT GGAGT ACTC 24

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 14

ATGCA CAGGA GGCCA TAGGG T 21

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 15

AGCAC GTTTC TTGGA GCAGG TTAAA CA 27

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 16

ATGCA TGGGA GGCAG GAAGC A 21

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 17

CACAG CACGT TTCCT GTGGC AGGG 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 18

CAGAT GCATG GGAGG CAGGA AGCG 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 19

CACAG CACGT TTCTT GAAGC AGGA 24

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 20

ATGCA TGGGA GGCAG GAAGC G 21

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 21

ACAGC ACGTT TCTTG GAGGA GGT 23

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 22

TGGAA TGTCT AAAGC AAGCT ATTTA ACATA TGT 33

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 23

TGATT TCTCT GATAG GTGAA TCCCA 25

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 24

TTGGC CTCTT GGCTA TACCT CTTT 24

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 25

ATTGA AGACA AGGAA TCGAA GTCC 24

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 26

TCCCC CGATG GAAGA TATTA TTTG 24

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 27

GCAAA GGTAT TGCTT GGGCT A 21

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 28

CAGAC TGCGC CTCTA TTCAG G 21

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 29

AAGAA ACAAA CTGCC CCTTA CACC 24

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 30

TAGTA TTGCC CCTAG TCACT GTCAA G 26

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 31

CTGCT GCTCC TTGAG GCATC CACA 24

<210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 32

CTTCT GGCTG TTCCA GTACT CGGCA T 26

<210> 33

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 33

CTTCT GGCTG TTCCA GTACT CAGCG T 26

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 34

CTGCT GCTCC CTGAG GCATC CACA 24

<210> 35

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 35

CTTCT GGCTG TTCCA GTACT CCTCA T 26

<210> 36

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 36

CTTCT GGCTG TTCCA GGACT CGGCG A 26

<210> 37

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 37

CTTCT GGCTG TTCCA GTGCT CCGCA G 26

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 38

CTGCT ACTCC TTGAG GCATC CACA 24

<210> 39

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 39

CTTCT GGCTG TTCCA GTACT CGGCG C 26

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 40

CTCTC TTGAC CACGC TGGTA CCTA 24

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 41

TTGGC CTCTT GGCTA TACCT CTTTT 25

<210> 42

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 42

CCTCC TGACC CTGAT GACAG TCCT 24

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 43

CCATC TGCCC CTCAA GCACC TCAA 24

<210> 44

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 44

CTCAG TGCTC GCCCC TCCCT AGTGA T 26

<210> 45

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 45

GCACA GTAGC TTTCG GGAAT TGACC A 26

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 46

GCCAG GGAGG GAAAT CAACT 20

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 47

ATCCA GTGGA GGACA CAGCA C 21

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 48

AAGAA ACAAA CTGCC CCTTA TACC 24

<210> 49

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 49

TAGTA CTGCC CCTAG TCACT GCCAA G 26

<210> 50

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 50

TAGTA CTGTC CCTAG TCACT GCCAA G 26